原位成像檢測活性酶的分子熒光探針研究進(jìn)展

張 龍，黃眾熙，沈 倩，鞠霖杰，吳 瓊，余昌敏*

（1.南京工業(yè)大學(xué) 柔性電子（未來技術(shù)）學(xué)院，江蘇 南京 211816；2.南京醫(yī)科大學(xué) 附屬腫瘤醫(yī)院，江蘇 南京 210009）

1 引言

活性酶不僅是各項(xiàng)生命活動的重要組成，同時(shí)也與疾病的發(fā)生有關(guān)[1-3]。例如，實(shí)驗(yàn)研究表明急性胰腺炎（Acute pancreatitis,AP）的腺泡細(xì)胞損傷與組織蛋白酶B 依賴的胰蛋白酶激活密切相關(guān)[4]；抑制天冬氨酸蛋白酶β-淀粉樣前體蛋白裂解酶1（Beta-Amyloid precursor protein lyase 1,BACE1）是降低阿爾茨海默病（Alzheimer's disease,AD）的一種有前景方法[5]；基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）使其他可溶性或膜表達(dá)的介質(zhì)分子失活或激活，使它們能夠控制發(fā)育過程、組織重塑、炎癥反應(yīng)和增殖信號通路，MMPs 的失調(diào)早已在急性腎損傷和慢性腎病中得到認(rèn)可[6]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)已經(jīng)有多種技術(shù)用于檢測活性酶，例如核磁成像、單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層成像（Single photon emission computed tomography,SPECT）以及正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層成像（Positron emission computed tomography,PECT）[7]，這些成像技術(shù)有著特定的靈敏度、空間分辨率以及穿透深度[8]。然而，目前現(xiàn)有的診斷方法不能直觀地反映因疾病導(dǎo)致活性酶的表達(dá)異常，以此區(qū)分疾病的進(jìn)展期，這容易錯(cuò)過最佳治療階段[3]。因此，有著較好特異性以及一定組織穿透力的熒光探針進(jìn)入臨床醫(yī)學(xué)診斷中。生物活性酶熒光探針可以通過檢測酶的水平以及生物成像，判斷疾病類型以及進(jìn)展期，還可以對治療方案的有效性進(jìn)行反饋，促進(jìn)相關(guān)抑制劑以及藥物和新型醫(yī)療方案的開發(fā)。

現(xiàn)今在熒光生物成像領(lǐng)域，研究者已經(jīng)開發(fā)了多種類型熒光探針，包括肽探針、納米粒子探針以及分子熒光探針。基于蛋白酶的特異性底物例如抗體、結(jié)蛋白等開發(fā)了肽探針，肽探針對蛋白酶具有特異性表達(dá)并且蛋白酶對肽鏈作用改變結(jié)構(gòu)進(jìn)而引發(fā)熒光信號。這類探針具有較好的生物相容性以及靈敏度，但是分子式的尺寸大小會對腫瘤結(jié)合有所影響，肽鏈分子結(jié)構(gòu)尺寸較大，可能會增加體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，增加體內(nèi)背景信號強(qiáng)度[9]。納米科學(xué)與生物技術(shù)的聯(lián)合也讓熒光探針領(lǐng)域誕生了納米熒光探針的研究，納米材料具有更高的光穩(wěn)定性，納米結(jié)構(gòu)可以作為載體與其他方法結(jié)合使用，以實(shí)現(xiàn)更強(qiáng)大的成像和治療功能[10-11]。然而，臨床實(shí)驗(yàn)中大多數(shù)納米粒子被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吸收，導(dǎo)致腫瘤組織內(nèi)分布不均，并可能對肝、脾和肺等關(guān)鍵器官產(chǎn)生毒性作用[12]，為此有針對性地開發(fā)出膠囊式納米粒子探針，不過仍需要對該類探針的安全性進(jìn)行長期評估。

分子熒光探針作為活細(xì)胞成像的強(qiáng)大工具，由于其非侵襲性以及靈敏度高、檢測限低、響應(yīng)時(shí)間快和生物相容性好等特性[13-17，近年來，許多研究小組已經(jīng)成功地開發(fā)了一系列用于細(xì)胞內(nèi)離子、代謝物、蛋白質(zhì)（包括酶）、細(xì)胞器和不同類型的細(xì)胞/組織的檢測小分子成像探針[18-21]，這些方案也逐步應(yīng)用于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)診斷中。19 世紀(jì)末，亞甲基藍(lán)熒光染料讓科研人員確立了進(jìn)行體內(nèi)染色病原體可視化診斷的想法；隨后，20 世紀(jì)小分子近紅外染料吲哚青綠（Indocyanine green,ICG）被美國食品和藥物管理局批準(zhǔn)用于常規(guī)臨床使用，可以為肝臟腫瘤手術(shù)進(jìn)行術(shù)中導(dǎo)航[22]。在此基礎(chǔ)上許多分子靶向熒光探針已被開發(fā)出來，如利用葉酸受體-α 靶向卵巢癌這一腫瘤特異性，設(shè)計(jì)的熒光探針成功在人體內(nèi)實(shí)現(xiàn)了術(shù)中導(dǎo)航[23]。這些熒光團(tuán)在光源的照射下吸收光子達(dá)到激發(fā)態(tài)，能量在回到基態(tài)時(shí)，由于分子振動以及弛豫現(xiàn)象而損失，從而發(fā)射出波長能量相較于吸收光低的熒光，產(chǎn)生斯托克斯位移，這也是分子熒光探針的理論基礎(chǔ)[24]。然而，這類小分子探針存在缺乏特異性、主動靶向性、在生物體內(nèi)易擴(kuò)散以及組織穿透力差等問題[25-27]。分子熒光探針在檢測蛋白質(zhì)活性以及生物成像領(lǐng)域已經(jīng)有了漫長的發(fā)展歷史，科研人員一直被小分子的毒性低、組織滲透能力好、可代謝能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)所吸引。近年來，近紅外Ⅰ區(qū)以及近紅外Ⅱ區(qū)的熒光探針增強(qiáng)了探針的組織穿透能力，因此更多的高靈敏度、高選擇性、特異性表達(dá)的分子探針被開發(fā)出來[28-31]。

2 分子熒光探針響應(yīng)機(jī)制及其檢測活性酶面臨的問題

分子熒光探針因?yàn)槠涑叽缧『徒Y(jié)構(gòu)明確，帶來了許多優(yōu)勢。如圖1 所示，根據(jù)分子熒光變化，探針熒光的響應(yīng)機(jī)制可以分為熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Fluorescence resonance energy transfer,FRET）[32]、分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（Intramolecular charge transfer,ICT）[33-34]、光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移（Photoinduced electron transfer,PET）[35]、激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移（Excited state intramolecular proton transfer,ESIPT）[36]、聚集誘導(dǎo)發(fā)射（Aggregation-induced emission,AIE）[37]、多模態(tài)熒光方法（Multimode fluorescence method）等[38-39]。參考以上機(jī)制，分子熒光探針結(jié)構(gòu)上的設(shè)計(jì)大部分由熒光團(tuán)、連接劑、識別基團(tuán)三個(gè)部分組成[40]。然而，尺寸小也帶來了一些問題。小分子熒光團(tuán)在生物體內(nèi)有著易擴(kuò)散以及易被快速代謝等問題，導(dǎo)致熒光團(tuán)分子的擴(kuò)散，特別是水溶性熒光團(tuán)，無法提供高時(shí)空分辨率的原位實(shí)時(shí)成像（圖2）。因此，分子熒光探針的原位成像功能特別是酶的原位檢測，目前在該領(lǐng)域備受關(guān)注。隨著科研人員的不斷探索，分子熒光探針檢測生物活性酶并原位成像得到了巨大發(fā)展，但仍然存在一些問題。分子熒光探針生物成像存在因?yàn)榧ぐl(fā)光或發(fā)射光波長較短造成的光損傷問題，而且一些常用熒光團(tuán)無法較好展示精細(xì)的生物組織結(jié)構(gòu)或者會受到生物組織散射光的影響。分子熒光探針的檢測限也是需要考慮的，較低的生物標(biāo)志物檢測限可以更好地表達(dá)不同濃度生物標(biāo)志物，有助于成像后的區(qū)分；同時(shí)，探針的靈敏度、特異性識別也需要注意。最后，盡管部分探針已經(jīng)進(jìn)入臨床，但是仍然無法滿足臨床需求，臨床轉(zhuǎn)譯工作仍需努力。

圖1 熒光響應(yīng)機(jī)制示意圖。（a）FRET 機(jī)制；（b）ICT 機(jī)制；（c）PET 機(jī)制；（d）ESIPT 機(jī)制；（e）AIE 機(jī)制。Fig.1 Schematic diagram of fluorescence response mechanism.（a）FRET mechanism.（b）ICT mechanisms.（c）PET mechanism.（d）ESIPT mechanism.（e）AIE mechanism.

圖2 活性酶原位成像和非原位成像對比示意圖。（a）熒光探針用于原位成像與非原位小鼠組織成像對比；（b）細(xì)胞內(nèi)活性酶與探針共價(jià)（上圖）或非共價(jià)原位成像對比（下圖）。Fig.2 Schematic diagram of enzyme in situ imaging.（a）In situ and non-in situ probe mouse tissue imaging.（b）Cell enzyme and probe covalent（top）or non-covalent in situ imaging（bottom）.

綜上，本文將主要探討近幾年分子熒光探針用于檢測酶的活性以及原位成像的設(shè)計(jì)策略，并對這些策略進(jìn)行匯總，希望對該領(lǐng)域的研究者們提供一些啟發(fā)。

3 分子熒光探針原位檢測活性酶設(shè)計(jì)策略

分子熒光探針是在生理?xiàng)l件下檢測和成像生物重要酶活性的寶貴工具，這些成像試劑大多依賴于酶刺激時(shí)熒光強(qiáng)度或發(fā)射波長的變化來報(bào)告酶活性。與大分子試劑相比，小分子具有更高的細(xì)胞滲透性和代謝性。然而，生命物體不同于實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中穩(wěn)定的和嚴(yán)密測試的溶液，是高度動態(tài)和開放的系統(tǒng)；小分子探針容易在生物體內(nèi)擴(kuò)散，導(dǎo)致信號背景比下降。為了提高熒光團(tuán)在目標(biāo)酶及其附近的保留時(shí)間，一些設(shè)計(jì)策略隨之被開發(fā)。這些策略可以簡單地分為共價(jià)方法和非共價(jià)方法。第一種是在酶促作用下探針形成反應(yīng)中間體，酶蛋白結(jié)構(gòu)中的親核基團(tuán)進(jìn)攻探針形成的反應(yīng)中間，兩者以共價(jià)鍵的形式連接，減少了熒光染料的擴(kuò)散，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)原位成像。第二種方案是利用酶裂解連接劑使得熒光探針的水溶解度降低，熒光團(tuán)通過聚集或自組裝非共價(jià)成鍵方式停留在活性位點(diǎn)附近。因此，本文將主要針對這兩種探針設(shè)計(jì)策略，探究蛋白酶原位成像技術(shù)的研究進(jìn)展。

3.1 基于（酰氧基）甲基酮反應(yīng)基團(tuán)的分子熒光探針

（酰氧基）甲基酮（（Acyl oxygen）methyl ketones,AOMKs）探針是一種與半胱氨酸蛋白酶發(fā)生反應(yīng)脫去AOMKs 反應(yīng)基團(tuán)與蛋白酶形成硫酯共價(jià)鍵，常用于開發(fā)半胱氨酸蛋白酶的抑制劑以及相應(yīng)的活性探針，活性探針的開發(fā)原理是通過形成共價(jià)鍵達(dá)到成像的能力[41-42]。

2007 年，Bogyo 團(tuán)隊(duì)利用以上成像原理首次開發(fā)了可“開關(guān)”的組織蛋白酶小分子近紅外熒光探針[43]。探針成功地對小鼠活體在腫瘤、肝臟、脾臟和腎臟組織中標(biāo)記了相同的三種組織蛋白酶，并通過組織蛋白酶抑制劑處理成像進(jìn)行了驗(yàn)證；該研究表明AOMKs 反應(yīng)基團(tuán)可以引入原位分子熒光探針用于半胱氨酸蛋白酶的檢測。隨著半胱氨酸蛋白酶的AOMKs 抑制劑轉(zhuǎn)化為小分子活性探針（Active base probes,ABPs）的研究不斷進(jìn)行，Bogyo 團(tuán)隊(duì)篩選了半胱氨酸蛋白酶抑制劑庫，設(shè)計(jì)了關(guān)于類泛素化蛋白酶（Sentrin specific proteases,SENPs）的含AOMKs 反應(yīng)基團(tuán)的抑制劑以及活性檢測探針GB137（圖3（a））[44]。含有Cy5 染料的AOMK 探針對hSENPs 的標(biāo)記效果較好（圖3（b）），同時(shí)也證明了探針是由于hSENPs 活性位點(diǎn)半胱氨酸的修飾擁有的標(biāo)記能力，可以作為SENP 的高選擇性探針。隨后，該團(tuán)隊(duì)為丁香假單胞菌產(chǎn)生的分泌木瓜蛋白酶樣Ⅲ型效應(yīng)物——AvrPphB 合成了一種AOMK 探針[45]，開發(fā)了一種熒光強(qiáng)度更好的熒光團(tuán)FH11，用來更好地識別標(biāo)記蛋白酶。至此AOMKs 基團(tuán)修飾分子熒光探針用于生物成像的可行性得到了證明，小鼠實(shí)驗(yàn)的成功說明該類探針具有用于半胱氨酸蛋白酶原位成像的潛力。

圖3 （a）探針GB137 與組織蛋白酶原位成像的響應(yīng)機(jī)理；（b）探針用于原位標(biāo)記活體荷瘤小鼠生物成像［44］。Fig.3 （a）Response mechanism of probe GB137 and cathepsin in situ imaging.（b）Optical in situ imaging of cathepsin with probe GB137 in mice tumors，bright-light images［44］.

同樣地，Drag 團(tuán)隊(duì)研發(fā)了標(biāo)記組織蛋白酶B的分子熒光探針用于蛋白酶的可視化成像和檢測（圖4（a））[46]。該團(tuán)隊(duì)為了設(shè)計(jì)蛋白酶選擇性底物，使用了兩個(gè)化學(xué)庫分析組織蛋白酶B 在P4-P1的位置偏好，實(shí)現(xiàn)這些底物可以不被其他類型組織蛋白酶水解。然后將選擇性底物轉(zhuǎn)化為AOMK反應(yīng)基團(tuán)的抑制劑，最后用Cy5/Cy7 熒光染料進(jìn)行修飾得到探針。實(shí)驗(yàn)證明，通過增加一個(gè)ahx連接器可以增加探針的保留能力以及組織蛋白酶L 和S 的標(biāo)記，含有Cy5 染料的探針MP-CB-2 相比于Cy7 可以被腫瘤細(xì)胞吸收并對組織蛋白酶B 有較高的選擇性（圖4（b））；隨后通過18 個(gè)不同的癌細(xì)胞株發(fā)現(xiàn)探針對組織蛋白酶B 的選擇性較好，并發(fā)現(xiàn)探針信號和組織蛋白酶L 抗體染色在被測細(xì)胞系中有很大的重疊，這表明組織蛋白酶B 和L 具有相同的內(nèi)溶酶體區(qū)，而且還驗(yàn)證了A-431 細(xì)胞的細(xì)胞核中存在組織蛋白酶B。該探針雖然無法進(jìn)行熒光的“開關(guān)”，但從生物細(xì)胞的成像結(jié)果上證明了AOMKs 基團(tuán)應(yīng)用于分子熒光探針進(jìn)行原位成像的能力。

AOMKs 對半胱氨酸蛋白酶有較高的選擇性，目前眾多科研團(tuán)隊(duì)選擇該類反應(yīng)基團(tuán)進(jìn)行半胱氨酸蛋白酶活性探針以及抑制劑的開發(fā)[47-48]。AOMKs 現(xiàn)在更多用于相關(guān)抑制劑的開發(fā)中，抑制劑轉(zhuǎn)化為活性探針的進(jìn)程也在持續(xù)更新；目前熒光發(fā)射標(biāo)記類的探針由于熒光發(fā)射光譜的重疊，限制了平行檢測和可視化的酶的數(shù)量，從而限制了它們在多參數(shù)分析中的應(yīng)用[49]。同時(shí)，該探針對其他酶的特異性表達(dá)能力弱，僅適合用于半胱氨酸蛋白酶的成像與標(biāo)記。

3.2 基于Aza 醌甲基反應(yīng)中間體的分子熒光探針

在以往的研究中，Aza 醌甲基結(jié)構(gòu)適用于生物滅活劑[50-51]，隨著科研人員的不斷探索，以香豆素衍生物作為熒光團(tuán)基本框架的分子熒光探針開發(fā)出來。這類探針在酶的作用下形成高活性醌甲基反應(yīng)中間體，然后由目標(biāo)酶或附近蛋白質(zhì)的親核殘基進(jìn)行邁克爾加成，以共價(jià)錨定激活位點(diǎn)周圍的熒光團(tuán)實(shí)現(xiàn)原位成像功能；這種探針設(shè)計(jì)策略在糖苷酶、磷酸酶、類固醇硫酸酯酶等熒光成像中得到了應(yīng)用[52-54]。Yao 團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一類用于胱天蛋白酶（Cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspases）以及蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶（Protein tyrosine phosphatases,PTP）的Aza 醌甲基反應(yīng)中間體熒光探針[55]，所得到的熒光探針通常處于“關(guān)閉”狀態(tài)，在這種狀態(tài)下，熒光團(tuán)因?yàn)镕RET 效應(yīng)被猝滅劑有效猝滅（圖5（a））。由于設(shè)計(jì)分子尺寸較大，需要提前進(jìn)行細(xì)胞滲透，在引入到細(xì)胞和酶對酶底物的裂解后，1,6-消除反應(yīng)導(dǎo)致猝滅劑離去，探針釋放熒光和醌甲基中間體。P1 探針對胱天蛋白酶具有良好的響應(yīng)，P6 探針可以對PTP 進(jìn)行雙光子成像（圖5（b）、（c））。隨后，該課題組在探針P5 基礎(chǔ)上加入細(xì)胞穿透肽（CPP）以解決滲透問題。該類探針通過利用這種中間體的反應(yīng)性和擴(kuò)散性，實(shí)現(xiàn)足夠酶定位的空間分辨率，能夠不滅活目標(biāo)酶，允許在原位放大目標(biāo)信號。該實(shí)驗(yàn)對醌甲基探針的作用機(jī)制進(jìn)行了較好的闡述，也表明醌甲基結(jié)構(gòu)應(yīng)用于分子熒光探針仍然有著優(yōu)異的生物相容性。

圖5 （a）猝滅型活性探針的設(shè)計(jì)及其原位標(biāo)記活性酶的機(jī)理；（b）P1 探針在凋亡HeLa 細(xì)胞中原位檢測caspase-3/7 活性的共聚焦熒光圖像；（c）P6 探針在HeLa 細(xì)胞中單光子和雙光子成像［55］。Fig.5 （a）Overall design principle of the quenched activity-based probes（qABPs）.（b）Confocal images of caspase-3/-7 activities using P1 in apoptotic HeLa cells and confirmed with immunofluorescence staining.（c）Confocal images of PTP1B overexpressed HeLa cells with P6 under two-photon excitation（800 nm）and one-photon excitation（543 nm）［55］.

Withers 團(tuán)隊(duì)于2011 年發(fā)表了含雙氟基團(tuán)的Aza 醌甲基中間體可以原位固定的檢測糖苷水解酶的分子熒光探針（圖6（a））[56]。雙氟甲基結(jié)構(gòu)相對于單氟結(jié)構(gòu)有較好的水溶性、便捷的合成路徑以及較高的原位標(biāo)記[57]。該類探針可以用于農(nóng)桿菌β-葡萄糖苷酶/半乳糖苷酶（Beta-glucosidase/galactosidase,Abg）的生物成像，表明醌甲基結(jié)構(gòu)探針廣泛的生物應(yīng)用，對于人體病原體感染探針原位成像也有著較好的借鑒。隨后該團(tuán)隊(duì)于2018 年在原來研究的基礎(chǔ)上發(fā)表了一個(gè)非特異性的唾液酸酶分子熒光探針（T1，圖6（b））以及一個(gè)特異性流感病毒神經(jīng)氨酸酶（NA）成像的分子熒光探針（T8，圖6（b））[58]，可以近距離連接的試劑在唾液酸酶/神經(jīng)氨酸酶作用后在酶周圍環(huán)境共價(jià)標(biāo)記。T1 探針對MDCK 細(xì)胞的內(nèi)源性唾液酸酶有較好的熒光標(biāo)記，在抑制劑N-乙酰-2,3 脫氫-2-脫氧神經(jīng)氨酸（N-acetyl-2,3-dehydrogen-2-deoxyneuraminic acid,DANA）作用下信號有所降低。由于T1 探針的非特異性，無法區(qū)分唾液酸酶的類型，在檢測流感病毒感染的MDCK 細(xì)胞的NA和唾液酸酶時(shí)，使用NA 抑制劑奧司他韋信號沒有降低，而DANA 效果較好，這表明細(xì)胞標(biāo)記是由于唾液酸酶導(dǎo)致的（圖6（c））。在唾液苷部分的C4 和C7 位置引入甲基可以增加探針的選擇性[59]，在使用奧司他韋以及DANA 處理后，T8 探針的熒光效果有所減弱，說明該探針是NA 特異性底物（圖6（c））。實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分說明了醌甲基探針在生物成像上的廣泛應(yīng)用，對于植物以及動物病原體侵入的原位成像以及診斷具有巨大潛力。

圖6 （a）含雙氟甲基探針結(jié)構(gòu)式及其檢測農(nóng)桿菌β-葡萄糖苷酶/半乳糖苷酶（Abg）作用原理［56］；（b）神經(jīng)氨酸酶探針T1和T8 的設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)及其原位熒光標(biāo)記酶的作用機(jī)制；（c）T1 探針（c1）以及T8 探針（c2）在流感病毒感染后對MDCK 活細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)氨酸酶的原位熒光成像照片［58］。Fig.6 （a）The structure of the probe containing difluoromethyl and its mechanism for detecting Abg［56］.（b）The structure and its mechanism of T1 and T8 for in situ detection of neuraminidase.（c）Confocal images of influenza-infected MDCK cells after incubation of T1（c1）and T8（c2）probes［58］.

根據(jù)上述機(jī)理，Xie 團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了檢測γ-谷?；D(zhuǎn)肽酶（GGT）的自固定近紅外分子熒光探針[60]。在GGT 作用下探針在715 nm 處熒光信號顯著增強(qiáng)，實(shí)現(xiàn)了在活體小鼠中對GGT 特異性可視化成像。響應(yīng)后的分子可以因共價(jià)作用保留在腫瘤內(nèi)增大熒光效果時(shí)間，對GGT 可以進(jìn)行免洗以及實(shí)時(shí)熒光成像。探針與傳統(tǒng)設(shè)計(jì)一樣由識別基團(tuán)、連接劑以及熒光團(tuán)三個(gè)部分組成，含有甲基的氨基甲酸乙酯作為離去基團(tuán)使得反應(yīng)后少量羥甲基化HD 染料A2 成為Aza 醌甲基反應(yīng)中間體，引入兩性離子增加探針的水溶性。探針熒光被對氨基苯酚連接劑猝滅，在GGT 作用下水解得到不穩(wěn)定中間體釋放氨基甲酸乙酯形成Aza 醌甲基中間體，與GGT 周圍的蛋白質(zhì)親核基團(tuán)攻擊，形成共價(jià)鍵釋放熒光信號。在活體小鼠實(shí)驗(yàn)中，探針對腫瘤組織以及肝臟和腎臟具有GGT 活性的組織器官都有熒光信號釋放。相比對照組，醌甲基自固定熒光探針有著較好的原位成像以及較高的熒光信號，也說明了該類探針在生物成像以及進(jìn)行深入腫瘤診斷的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

研究表明衰老時(shí)表達(dá)相關(guān)β-半乳糖苷酶（Senescence-associated β-galactosidase,SA-β-Gal），且衰老細(xì)胞可能會隨著年齡的增長而積累，因此相關(guān)的熒光探針也開發(fā)出來[61-62]。Cui 團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種用于檢測藥物誘導(dǎo)體內(nèi)衰老的自固定分子近紅外熒光探針（圖7（a）、（b））。Aza 醌甲基中間體與酶親核基團(tuán)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了更長時(shí)間的保留，雙氟甲基相對于單氟甲基的加入增強(qiáng)了原位近紅外信號的強(qiáng)度，為SA-β-Gal 酶提供了新的分子熒光探針策略[63]。該團(tuán)隊(duì)使用喜樹堿（CPT）處理，誘導(dǎo)HeLa 細(xì)胞的細(xì)胞衰老，在未處理細(xì)胞及處理細(xì)胞成像以及沖洗后成像證實(shí)了雙氟結(jié)構(gòu)具有良好的原位近紅外成像能力（圖7（c））。在小鼠實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過CPT 處理的相比于接受生理鹽水處理的對照組的腫瘤熒光強(qiáng)度明顯增加，具有相同的實(shí)驗(yàn)結(jié)論（圖7（d））。該探針利用近紅外熒光團(tuán)以及原位共價(jià)自固定方式對細(xì)胞衰老相關(guān)糖苷水解酶進(jìn)行原位檢測，為檢測SA-β-Gal 酶提供了一個(gè)新的思路，也為相關(guān)領(lǐng)域的研究提供了較好的觀察方法。

圖7 （a）NIR-BG1 和NIR-BG2 探針結(jié)構(gòu)及其對化療誘導(dǎo)的體內(nèi)衰老進(jìn)行無創(chuàng)傷成像機(jī)理；（b）探針NIR-BG1 和NIRBG2 的體外光譜學(xué)性能；（c）探針在HeLa 細(xì)胞內(nèi)對SA-β-Gal 原位熒光成像照片；（d）CPT 處理的小鼠腫瘤模型原位熒光成像，NIR-BG1（上）或NIR-BG2（下）［63］。Fig.7 （a）The structures and their noninvasive imaging mechanism of chemotherapy-induced senescence in vivo using probe NIR-BG1 or NIR-BG2.（b）Photophysical properties of NIR probes NIR-BG1 and NIR-BG2.（c）Confocal images of HeLa cells incubated with NIR-BG1 or NIR-BG2.（d）Live animal in situ imaging of CPT-treated HeLa xenografts mice after tail vein injection of NIR-BG1（top）or NIR-BG2（bottom）［63］.

3.3 基于反應(yīng)基團(tuán)的重氮茚酮和識別基團(tuán)用于轉(zhuǎn)基因酶

通過羅丹明與重氮茚酮結(jié)構(gòu)的結(jié)合與修飾開發(fā)出了一系列可以應(yīng)用于生物細(xì)胞活體成像的熒光染料。Hell 團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了五種羅丹明N=N 結(jié)構(gòu)染料，染料可以被常見光源激活，這類結(jié)構(gòu)染料可以與蛋白質(zhì)結(jié)合，重氮茚酮籠化基團(tuán)的尺寸減小導(dǎo)致籠化染料的結(jié)構(gòu)緊湊，有利于穿透細(xì)胞膜，光激活可以方便地生成一個(gè)無害的二氮分子作為離去基團(tuán)[64]。該團(tuán)隊(duì)初步證明了這類探針的響應(yīng)機(jī)制，并對探針的生物應(yīng)用進(jìn)行了一定的評估。受到上述啟發(fā)，Rivera-Fuentes 團(tuán)隊(duì)通過這種存在生物相容性、熒光發(fā)射波長長以及與蛋白質(zhì)結(jié)合有巨大潛力的染料[65]，對結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾得到雙激活的高分辨率熒光探針，并對該探針作用機(jī)制以及生物原位成像應(yīng)用進(jìn)行了測試（圖8（a））。該設(shè)計(jì)方案是利用重氮茚酮的光激活發(fā)生沃爾夫重排，使得熒光團(tuán)的熒光發(fā)射更強(qiáng)，同時(shí)烯酮中間體與酯酶發(fā)生共價(jià)反應(yīng)連接實(shí)現(xiàn)原位成像能力。小分子探針首先受到酶促作用對酚羥基去乙酰化，使得抑制熒光作用減弱。同時(shí)在不同激發(fā)波長光的照射下，所得到的中間體結(jié)構(gòu)也不一樣。該團(tuán)隊(duì)選用了適合人體的激發(fā)波長405 nm，在該波長激發(fā)光的照射下發(fā)生沃爾夫重排，得到的烯酮中間體可以在酯酶及其附近發(fā)生共價(jià)反應(yīng)，減少在細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)散達(dá)到原位成像水平（圖8（b））。該團(tuán)隊(duì)探索了雙激發(fā)重氮茚酮結(jié)構(gòu)在生物細(xì)胞體內(nèi)的作用機(jī)制，表明了該類結(jié)構(gòu)用于原位檢測活性酶的能力，同時(shí)為羅丹明染料作為生物熒光染料提供了一個(gè)新的發(fā)展方向。隨后，該團(tuán)隊(duì)再次開發(fā)了對硝基還原酶進(jìn)行檢測的重氮茚酮結(jié)構(gòu)的分子熒光探針[66]。探針本身以及在被硝基還原酶催化硝基芳香族化合物還原為苯胺后沒有熒光發(fā)射，在激發(fā)光照射后，重氮茚酮結(jié)構(gòu)發(fā)生沃爾夫重排得到烯酮中間體發(fā)出熒光。實(shí)驗(yàn)中看出熒光產(chǎn)物會受到吸電子基團(tuán)硝基的抑制，中間體與酶的蛋白親核片段發(fā)生共價(jià)反應(yīng)，該中間體在極性溶劑中有較高的量子產(chǎn)率，減少了和水以及亞硝基的親核反應(yīng)的概率，增大了原位成像的能力。這次實(shí)驗(yàn)不僅展示了這類探針強(qiáng)大的原位成像能力，同時(shí)通過聚焦共定位實(shí)驗(yàn)論證了硝基還原酶主要存在于線粒體中且分布不均勻。

圖8 （a）酯酶和光照雙激活原位分子熒光探針的響應(yīng)機(jī)制；（b）探針與HeLa 細(xì)胞孵育后不同波長激光激發(fā)共定位成像［65］。Fig.8 （a）Response mechanism of double-activated in situ small molecule fluorescent probes.（b）Colocalization imaging of HeLa cells with probe 1 after photoactivation（b1）and before photoactivation（b2），line profile（dashed green line in b2）（b3）［65］.

利用重氮茚酮與羅丹明染料的修飾思路已經(jīng)得到了一些具有生物相容性潛力的新型熒光染料，并且借助光激活后的烯酮中間體與蛋白質(zhì)親核基團(tuán)的共價(jià)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)原位成像減少分子擴(kuò)散，這些策略對今后開發(fā)重氮茚酮類的分子熒光探針有所幫助和啟發(fā)。設(shè)計(jì)研究時(shí)也需要考慮生物大環(huán)境中水分子這種含量最多的親核試劑對這類探針的影響，可以通過改變環(huán)境溶劑極性大小對熒光強(qiáng)度變化進(jìn)行選擇[67]。酶促反應(yīng)與光激活需要同時(shí)進(jìn)行，這也是探針臨床轉(zhuǎn)化的一項(xiàng)挑戰(zhàn)。

3.4 基于構(gòu)象變化引起的電子轉(zhuǎn)移機(jī)制

不可逆抑制劑可以通過較強(qiáng)的共價(jià)鍵形式與酶蛋白中的基團(tuán)結(jié)合，研究人員利用該性質(zhì)，在熒光團(tuán)、不可逆抑制劑以及抑制結(jié)合劑的基礎(chǔ)上進(jìn)行合適的化學(xué)修飾，在酶的作用后使探針發(fā)生構(gòu)象變化，得到新型原位成像分子熒光探針。

Peng 團(tuán)隊(duì)合成了用于檢測環(huán)氧合酶-2（COX-2）用于區(qū)分炎癥、腫瘤以及正常細(xì)胞的分子熒光探針[68]，探針在基于化學(xué)修飾的吲哚美辛（Indomethacin,IMC）與硝基苊醌（Nitro benzoquinone,NANQ）熒光團(tuán)的連接，選擇一種線性烷基二胺作為連接劑，在一端與吲哚美辛形成酰胺鍵，在另一端與熒光團(tuán)形成仲胺鍵（圖9（a））。在COX-2 缺失的親水環(huán)境下，探針處于平面折疊狀態(tài)，此時(shí)結(jié)構(gòu)能量最低，并且由于NANQ 與IMC 兩平行平面之間的電子轉(zhuǎn)移（PET）熒光被猝滅；在COX-2 過表達(dá)的炎癥和癌癥中探針的抑制劑會識別結(jié)合這種氧化還原酶，分子部分進(jìn)入酶狹窄的疏水空腔內(nèi)，導(dǎo)致構(gòu)象被迫展開，熒光恢復(fù)[69]。體外測試中，該探針展現(xiàn)了在不同COX-2 濃度下熒光發(fā)射波長的變化。由于環(huán)境親水性以及疏水性的改變，在疏水性環(huán)境中探針發(fā)射波長為526 nm，在親水性環(huán)境中發(fā)射波長為595 nm。并且通過小鼠癌癥組織以及炎癥組織成像，在綠色通道（（555 ± 20）nm）中小鼠癌細(xì)胞組織熒光增強(qiáng)，在紅色通道（（615 ± 20）nm）中小鼠炎癥組織熒光顯色增強(qiáng)（圖9（b）），證明探針具有區(qū)分癌細(xì)胞以及炎癥的能力。后面的小鼠成像進(jìn)一步證實(shí)了這個(gè)觀點(diǎn)，同時(shí)也表明了探針在應(yīng)用于術(shù)中導(dǎo)航的潛力。隨后，該團(tuán)隊(duì)選用塞來昔布作為抑制劑、萘酰亞胺作為熒光團(tuán)以及阿司匹林作為抑制劑、萘酰亞胺作為熒光團(tuán)對COX-2 進(jìn)行檢測[70-71]。

圖9 （a）構(gòu)象變化引發(fā)電子轉(zhuǎn)移的NANQ-IMC6 探針熒光檢測機(jī)制；（b）裸眼熒光引導(dǎo)下腫瘤切除術(shù)的操作圖片：（b1）小鼠體內(nèi)腫瘤成像，（b2）紫外線照射下肉眼可見腫瘤切除情況［68］。Fig.9 （a）The mechanism of the probe NANQ-IMC6 via conformational change triggering electron transfer.（b）Possibility of naked eye fluorescence-guided resection of tumors：（b1）imaging tumors in vivo，（b2）visualization of tumor resection by the naked eye under ultraviolet illumination［68］.

Lv 團(tuán)隊(duì)依照上述策略設(shè)計(jì)了IMC 作為抑制結(jié)合劑、近紅外七甲氨酸菁作為熒光團(tuán)[72]、己二胺作為連接劑的近紅外分子熒光探針，并成功對肺纖維化細(xì)胞以及小鼠模型的COX-2 可視化。這種策略利用不可逆抑制劑與酶的高度選擇性和共價(jià)結(jié)合以及活性COX-2 酶作用探針誘發(fā)空間構(gòu)象，改變控制PET 作用影響熒光“開關(guān)”，減少了因?yàn)橐种苿┙档兔傅幕钚詫?dǎo)致探針熒光處于總是打開的狀態(tài)，提高探針的原位成像能力。

這類探針展示了一種新型活性酶共價(jià)原位結(jié)合方式，利用不可逆抑制劑的特異性選擇以及高強(qiáng)度共價(jià)結(jié)合能力、己二胺良好的延展性以及分子間距對PET 機(jī)制影響，設(shè)計(jì)出針對COX-2 氧化還原酶高效生物原位成像的分子熒光探針。但是該類探針目前僅針對COX-2 進(jìn)行了大量設(shè)計(jì)，其他類型的酶還沒有太多相關(guān)報(bào)道，后期需要對其他不可逆抑制劑進(jìn)行篩選，對其他酶的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，設(shè)計(jì)出熒光團(tuán)與抑制劑較好的結(jié)合方式。

3.5 基于酶促作用的固態(tài)熒光團(tuán)原位沉淀

固態(tài)熒光成像是原位成像的一種常見策略，相較于水溶性熒光團(tuán)易擴(kuò)散至整個(gè)細(xì)胞，固態(tài)熒光團(tuán)有著較好的沉淀能力，在酶促作用實(shí)現(xiàn)原位沉淀后，熒光團(tuán)能在活性酶附近快速沉淀積累，增強(qiáng)原位熒光信號，降低背景信號，從而提高最終的原位成像分辨率。

Tan 和Zhang 團(tuán)隊(duì)基于不溶于水的聚集誘導(dǎo)發(fā)射發(fā)光物質(zhì)（AIEgens）——2-（2′-羥苯基）-4（3氫）-喹唑啉酮（HPQ）結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，研發(fā)了新型固態(tài)熒光團(tuán)HTPQ（圖10）[73]，該熒光團(tuán)的響應(yīng)機(jī)制是激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移（ESIPT）。該熒光團(tuán)有以下特點(diǎn)：（1）有著較大的斯托克斯位移，這不僅有利于熒光成像，還可以增加靈敏度，降低背景信號；（2）高度不可溶性降低了分子擴(kuò)散有利于沉積，實(shí)現(xiàn)了原位成像的能力，染料在固態(tài)情況下有著強(qiáng)烈的熒光；（3）熒光團(tuán)的不可溶性和強(qiáng)烈熒光可以被消除。并以此設(shè)計(jì)了堿性磷酸酶（ALP）的熒光探針，對酚羥基進(jìn)行保護(hù)阻止ESIPT 機(jī)制，達(dá)到抑制熒光實(shí)現(xiàn)“開關(guān)”的功能，探針表現(xiàn)出了較好的原位實(shí)時(shí)成像能力；同時(shí)還能夠監(jiān)測兩種骨肉瘤細(xì)胞系（U-2OS 和Saos-2）中的ALP 活性。這是首次利用HPQ 固態(tài)熒光團(tuán)進(jìn)行分子熒光探針的設(shè)計(jì)，為非共價(jià)原位成像探針設(shè)計(jì)提供了一個(gè)嶄新的策略。Yang 團(tuán)隊(duì)在HPQ 的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了針對乙酰膽堿酯酶（AChE）、丁酰膽堿酯酶（BChE）、糜蛋白酶（Chy）、羧酸酯酶1&2（Carboxylesterase 1&2,CE 1&2）的固態(tài)熒光探針用于追蹤殘留農(nóng)藥[74]，該探針對活體細(xì)胞、斑馬魚以及新鮮蔬菜中的代表性有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥表現(xiàn)出良好的檢測能力，也為分子熒光探針在更多領(lǐng)域應(yīng)用提供了新思路[75]。

圖10 （a）探針HTPQA 的設(shè)計(jì)策略以及對堿性磷酸酶響應(yīng)機(jī)制；（b）探針HTPQA 在不同濃度的堿性磷酸酶時(shí)熒光發(fā)射光譜；（c）HTPQA 在HeLa 細(xì)胞的實(shí)時(shí)熒光成像［73］。Fig.10 （a）The design and response mechanism of the probe HTPQA to ALP.（b）The fluorescence emission spectra of HTPQA in the presence of different concentrations of ALP in TBS buffered solution.（C）Real-time imaging of HeLa cells incubated with HTPQA［73］.

HTPQ 的量子產(chǎn)率相對HPQ 有所下降，同時(shí)四苯乙烯結(jié)構(gòu)的較大空間位阻使得HTPQ 難以設(shè)計(jì)其他酶的探針，于是Zhang 團(tuán)隊(duì)再次開發(fā)了一種基于AIE機(jī)制的固態(tài)ESIPT發(fā)射用于檢測細(xì)胞內(nèi)溶酶體酶——β-葡萄糖醛酸酶（β-glucuronidase,GLU）的可“開關(guān)”分子熒光探針[76]，并引用供電子原子硫合成出新型自組裝小分子固態(tài)熒光團(tuán)HDPQ（圖11（a））。探針識別GLU 后發(fā)生酶促作用，酚羥基去保護(hù)，熒光團(tuán)HDPQ 在溶酶體內(nèi)通過氫鍵作用發(fā)生自組裝且激活熒光信號（圖11（b））。接著，組裝分子熒光團(tuán)在溶酶體內(nèi)固態(tài)沉積，保持原位性，從而具有長期原位成像以及檢測GLU 的能力（圖11（c）、（d））。而且由于溶酶體處于酸性環(huán)境，熒光團(tuán)的熒光信號會因此受到限制，熒光團(tuán)HDPQ 則表現(xiàn)出較低的pH 靈敏度，這也為開發(fā)相應(yīng)的溶酶體酶的分子熒光探針提供了一個(gè)新的思路。隨后，該團(tuán)隊(duì)在此基礎(chǔ)上提出將HPQ 融合到簡單的半花氨酸共軛體系上，構(gòu)建了一系列可活化、高穩(wěn)定性的近紅外Ⅱ區(qū)J 聚集體，克服了傳統(tǒng)J 聚集體對載體的依賴，可以在體內(nèi)進(jìn)行原位自組裝[77]。通過近紅外Ⅱ區(qū)J聚集體設(shè)計(jì)探針HPQ-Zzh-B，并在近紅外Ⅱ區(qū)成像導(dǎo)航，實(shí)現(xiàn)腫瘤的長期原位成像和精確腫瘤切除以及減少肺轉(zhuǎn)移。這一策略將推動可控近紅外Ⅱ區(qū)J聚集和體內(nèi)精確生物成像的發(fā)展。

圖11 （a）探針HDPQ-GLU 的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其與溶酶體酶GLU 的反應(yīng)機(jī)制；（b）探針HDPQ-GLU 的體外光譜學(xué)性質(zhì)；（c）LPS 誘導(dǎo)L02 細(xì)胞炎癥中細(xì)胞內(nèi)GLU 的熒光圖像；（d）活斑馬魚在不同時(shí)期GLU 變化的熒光成像［76］。Fig.11 （a）Chemical structure of the HDPQ-GLU and its response mechanism with GLU.（b）Fluorescence emission spectra of HDPQ-GLU after incubating with GLU in MES buffer.（c）Fluorescence images for detecting intracellular GLU after different incubation times in L02 cells.（d）Fluorescence imaging of GLU in living zebrafish at different periods［76］.

固態(tài)熒光團(tuán)原位沉淀的開發(fā)是期望保留分子熒光探針毒性小、可代謝等優(yōu)點(diǎn)的同時(shí)，能減少小分子熒光團(tuán)在細(xì)胞組織內(nèi)的擴(kuò)散，延長保留時(shí)間，達(dá)到更好的原位實(shí)時(shí)成像能力。對于現(xiàn)有的商業(yè)固態(tài)熒光染料進(jìn)行修飾改性，也是較為常見的開發(fā)生物相容性的新型熒光團(tuán)以及探針的有力方法。

ESIPT 機(jī)制的運(yùn)用可以有效地增大熒光團(tuán)的斯托克斯位移，加入供電子基團(tuán)進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾改性也可能在增大斯托克斯位移上有所幫助[78]，這些是在新型固態(tài)熒光團(tuán)進(jìn)行初步篩選以及后期改性修飾需考慮的因素。可自組裝的固態(tài)熒光團(tuán)需要考慮氫鍵等分子相互作用后的結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定以及鍵長較短（小于0.35 nm，π-π 作用越小越強(qiáng)）的自組裝結(jié)構(gòu)也是需要考慮的。

3.6 基于酶促作用發(fā)生原位自組裝的納米結(jié)構(gòu)

2004 年，小分子作為酶的底物進(jìn)行自組裝得到了驗(yàn)證[79]。受到上述啟發(fā)，科研人員將該想法引入分子熒光探針設(shè)計(jì)中，通過酶促作用，探針以非共價(jià)鍵形式（如靜電作用、氫鍵、π-π 作用、范德華力和疏水作用）實(shí)現(xiàn)自組裝，在生物活性酶及其周圍附著形成納米結(jié)構(gòu)，達(dá)到原位成像的能力[80]。Rao 團(tuán)隊(duì)研發(fā)了一種檢測接受化療后腫瘤細(xì)胞凋亡過程的小分子自組裝熒光探針[81]，用于區(qū)分腫瘤化療過程的陰性和陽性反應(yīng)（圖12（a））。小分子具有易滲透、生物分布范圍廣等優(yōu)勢，借助小分子在細(xì)胞內(nèi)生物正交環(huán)化反應(yīng)持續(xù)控制自組裝形成納米熒光顆粒，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞組織成像。體外自組裝的納米顆粒在細(xì)胞內(nèi)無熒光信號，證明納米聚集在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生，探針可以發(fā)生原位納米聚集，增大保留時(shí)間。探針對化療有效的腫瘤細(xì)胞以及組織發(fā)生分子內(nèi)大環(huán)化，探針轉(zhuǎn)化大環(huán)化分子達(dá)到90%，由于阿霉素（DOX）化療作用腫瘤細(xì)胞凋亡時(shí)胱天蛋白酶-3/7 被激活，切割L-DEVD capping肽，通過分子間疏水相互作用p-p 堆疊聚集并高度成像（圖12（b）、（c）），其他酶的選擇性測試都表明探針對胱天蛋白酶-3/7 有高度特異性表達(dá)。探針的熒光強(qiáng)度與腫瘤化療后的大小有著直接關(guān)系，這提供了治療對個(gè)體療效的有力信息。該探針初步實(shí)現(xiàn)了生物體內(nèi)腫瘤化療效果的檢測，為判斷腫瘤化療療效提供了一個(gè)新的思路，也展現(xiàn)了分子熒光探針在生物應(yīng)用中的巨大潛力。

圖12 （a）探針C-SNAF 在人腫瘤異種移植小鼠模型中caspase-3/7 活性的體內(nèi)成像機(jī)制；（b）探針在細(xì)胞中自組裝熒光納米聚集體的3D-SIM 成像；（c）探針對荷瘤小鼠細(xì)胞凋亡的無創(chuàng)成像［81］。Fig.12 （a）The mechanism of imaging caspase-3/7 activity by C-SNAF in tumor xenograft mouse models.（b）3D-SIM imaging of self-assembled fluorescent nanoaggregates in cells.（c）Non-invasive imaging of apoptosis in tumor-bearing mice［81］.

Sun 團(tuán)隊(duì)利用聚乙二醇化可以精確將小分子染料NIR-Ⅱ探針從單分子組裝到納米顆粒大小，并研究了尺寸與熒光/藥代動力學(xué)之間的關(guān)系[82]。Ye 團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了基于小分子可激活近紅外熒光以及核磁共振雙模塊探針用于分子成像[83]，選用細(xì)胞膜上過度表達(dá)的堿性磷酸酶（ALP）作為靶點(diǎn)，探針可以被ALP 激活定位細(xì)胞膜組裝納米顆粒。

近期，Li 團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一種生物活性體內(nèi)組裝（Bioactivatedin vivoassembly,BIVA）熒光探針（圖13（a））[84]，該探針不僅具有主動靶向機(jī)制，而且在酶作用探針后發(fā)生聚集組裝誘導(dǎo)保留（Aggregation assembly induces retention,AIR）效應(yīng)進(jìn)行原位納米纖維組裝。該探針有以下幾個(gè)較好的設(shè)計(jì)思路：（1）將探針模塊化設(shè)計(jì)，一共設(shè)計(jì)了5 個(gè)模塊，每一個(gè)模塊對應(yīng)一個(gè)功能。該組在探針分子M1 基礎(chǔ)上對相應(yīng)模塊進(jìn)行裁剪和替換，設(shè)計(jì)出非對應(yīng)性反應(yīng)斷裂模塊分子M2、無成像模塊分子M3、斷裂模塊反應(yīng)的R-M1、非對應(yīng)性靶向模塊的M4、無斷裂模塊以及成像模塊的M5、無成像模塊并且斷裂模塊發(fā)生反應(yīng)后的R-M3，這六類分子用于各模塊功能機(jī)制證明。（2）選擇聚乙二醇作為長期循環(huán)模塊，增加了分子在水溶液中的親水性以及延長探針在血液傳輸中的保留時(shí)間，讓探針有更多的機(jī)會在腫瘤細(xì)胞周圍滲透聚集。（3）酶切作用后探針疏水性增加以及表面氫鍵暴露，促進(jìn)自組裝形成β-折疊納米結(jié)構(gòu)纖維（圖13（b）），探針納米纖維化在腫瘤細(xì)胞膜周圍附著積累，減少分子的擴(kuò)散以及代謝問題從而增加了熒光信號在腫瘤組織的保留時(shí)間，實(shí)現(xiàn)了腫瘤的原位實(shí)時(shí)成像（圖13（c）、（d））。最終結(jié)果證明，該探針雖然是模塊化設(shè)計(jì)，但最終的性能表現(xiàn)較為優(yōu)異。成纖維細(xì)胞活化蛋白-α（FAP-α）對探針分子具有高度特異性識別，有利于探針在腫瘤內(nèi)的酶切以及自組裝；相對于傳統(tǒng)主動靶向機(jī)制的熒光探針，這種主動靶向機(jī)制以及AIR 效應(yīng)的聯(lián)合作用對于延長探針成像窗口期有著一定的啟發(fā)。

圖13 （a）BIVA 探針的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其在活體中檢測機(jī)理圖；（b）探針在水溶液中自組裝結(jié)構(gòu)表征；（c）探針BIVA 與MIA PaCa-2 細(xì)胞后形成具有主動靶向性的熒光圖像；（d）探針在小鼠模型中的熒光成像及代謝情況［84］。Fig.13 （a）Chemical structure and detection mechanism of bioactivated in vivo assembly（BIVA）probe.（b）Assembled structure conformations and self-assembly behavior in aqueous solution.（c）Confocal images of the probe with active targeting property in MIA PaCa-2 cells.（d）The time-dependent NIR fluorescence image of mice bearing MIA PaCa-2 cells after intravenous administration of ICG，M2 and M1［84］.

自組裝形成納米結(jié)構(gòu)降低了小分子擴(kuò)散造成的背景信號，這種策略也逐漸應(yīng)用于光聲成像、核磁成像等領(lǐng)域[85]。隨著可控自組裝的發(fā)展，科研人員可以通過控制自組裝實(shí)現(xiàn)控制熒光信號強(qiáng)度，達(dá)到聚集誘導(dǎo)猝滅、聚集誘導(dǎo)發(fā)射、可調(diào)控的單體-外聚體轉(zhuǎn)變等熒光信號變化，一些新型自組裝分子熒光探針技術(shù)也隨之被開發(fā)[86]。該策略保留了小分子的特性，增加了探針的多功能化（如抑制腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散等），同時(shí)一定程度上避免了大分子納米探針直接注射的一些問題（如網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吸收，導(dǎo)致腫瘤組織內(nèi)分布不均，并可能對肝、脾和肺有毒性）[87]。

4 總結(jié)與展望

酶的活性與各項(xiàng)生命活動有著重要的關(guān)系，酶表達(dá)水平的變化與一些疾病有著一定的關(guān)聯(lián)，能夠?qū)⑦@種酶含量清晰直白地展現(xiàn)出來是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)一直面臨的挑戰(zhàn)。分子熒光探針的出現(xiàn)與發(fā)展為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)以及其他方向提供了一個(gè)較好的工具，理想的分子熒光探針具有靈敏度高、選擇性好、時(shí)空分辨率高、生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)，這些性質(zhì)保證了分子熒光探針可以精確地反映酶的活性和表達(dá)水平。

原位成像能力的探索是獲得優(yōu)秀時(shí)空分辨率分子熒光探針的有效策略之一，通過不同的方式（共價(jià)鍵或者非共價(jià)鍵形式）連接或者附著在活性酶及其周圍，減少分子的擴(kuò)散，增加保留時(shí)間，提高探針的原位概率。近紅外熒光染料的應(yīng)用是目前研究的熱點(diǎn)，熒光團(tuán)能激發(fā)/發(fā)射波長更長的熒光，有利于減少光損傷以及增加熒光的組織穿透深度，近紅外Ⅱ區(qū)可以進(jìn)行精細(xì)組織結(jié)構(gòu)的清晰成像[88-96]，使該領(lǐng)域得到了進(jìn)一步發(fā)展。通過現(xiàn)有已被臨床批準(zhǔn)的藥物，如亞甲基藍(lán)、吲哚菁綠等通過修飾轉(zhuǎn)化為高效的熒光探針，可能是提高探針進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)幾率的一種方案。為了解決生物組織散色光強(qiáng)烈的問題，雙光子乃至三光子分子熒光探針的設(shè)計(jì)策略受到了關(guān)注[97]。分子熒光探針的開發(fā)與發(fā)展，各種熒光成像技術(shù)的迭代更新以及核磁共振成像、超聲成像等成像技術(shù)與熒光成像技術(shù)的結(jié)合應(yīng)用，進(jìn)一步提升了酶的檢測分辨率[98]。其他的設(shè)計(jì)思路也在不斷探索中，例如光激活等雙方式激活探針、利用熒光探針進(jìn)行疾病的診斷治療一體化等。希望未來能有更多的設(shè)計(jì)策略應(yīng)用于分子熒光探針的開發(fā)，多領(lǐng)域的研究者們增加交流合作并達(dá)成共識，努力將分子熒光探針帶入臨床轉(zhuǎn)譯以及后期應(yīng)用，為人類在生命領(lǐng)域的探究提供有力的工具。

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