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    高海拔地區(qū)血液篩查核酸檢測系統(tǒng)性能驗證結(jié)果評價*

    2023-12-02 10:08:06臧亮周磊多吉林豪白睿楊梅旦超范亞欣
    中國輸血雜志 2023年10期
    關(guān)鍵詞:低濃度海拔核酸

    臧亮 周磊 多吉 林豪 白睿 楊梅 旦超 范亞欣△

    (1.大連市血液中心,遼寧 大連 116001;2.那曲市中心血站)

    近年來,隨著病毒核酸檢測技術(shù)(nucleic acid testing,NAT)在血液篩查中的全面推行,大大降低了HBV/HCV/HIV 的輸血傳播風(fēng)險[1-3]。 按照《血站質(zhì)量管理規(guī)范》《血站實驗室質(zhì)量管理規(guī)范》和《血液技術(shù)操作規(guī)程(2019 版)》的要求[4-6],應(yīng)對核酸檢測系統(tǒng)進行性能驗證,確認(rèn)核酸檢測系統(tǒng)能夠滿足實驗室檢測工作的要求,確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。 目前現(xiàn)有的驗證方案與方法均是參考低海拔地區(qū)實驗室建立的,針對高海拔地區(qū)的驗證方案與方法尚未見報道。 西藏那曲地區(qū)海拔約4 450 米,高寒缺氧,氣壓低、氣候條件差,對核酸檢測系統(tǒng)的性能驗證指標(biāo)的選擇、驗證方案的標(biāo)準(zhǔn)化以及驗證結(jié)果的評價與低海拔地區(qū)的差異值得研究。 我們基于國家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn),針對高海拔地區(qū)實驗室檢測模式和實際工作特點,選擇分析靈敏度、特異性、重復(fù)性、符合率、檢測系統(tǒng)比對等關(guān)鍵指標(biāo),建立適宜高海拔地區(qū)的性能驗證方案,以保證血液檢測過程的標(biāo)準(zhǔn)化和檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性,提升高海拔地區(qū)的血液安全,同時也為其他高海拔地區(qū)的采供血機構(gòu)順利開展核酸檢測工作提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 標(biāo)本來源 核酸檢測系統(tǒng)性能驗證血清盤由國家衛(wèi)健委臨檢中心提供。 其中,NAT 血清盤C—G(分析靈敏度驗證盤)共30 份標(biāo)本,包括HBV C 型標(biāo)本5 份(C2—C6),濃度為25、12、6、3、1.5 IU/mL;HCV 2a 型標(biāo)本5 份(D2—D6),濃度為170、85、40、20、10 IU/mL;HIV CRF07_BC 型標(biāo)本5 份(E2—E6),濃度為210、105、50、25、12.5 IU/mL;HCV 1b 型標(biāo)本5 份(F2—F6),濃度為140、70、35、17、8.5 IU/mL;HCV 6a型標(biāo)本5 份(G2—G6),濃度為220、110、55、27、13 IU/mL;陰性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)5 份。 血清盤A(單檢檢測策略評估)共46 份標(biāo)本,每一編號3 支,每份標(biāo)本3 mL。

    1.2 試劑與儀器 HBV、HCV 和HIV-1 病毒核酸檢測試劑盒(達(dá)安基因公司,批號:202201001);血液核酸篩查系統(tǒng):DA3500S 全自動核酸提取儀(達(dá)安基因公司)、AGS4800 PCR擴增儀(杭州安譽公司)。

    1.3 方法

    1.3.1 靈敏度 采用國家衛(wèi)健委臨檢中心提供的NAT 血清盤C—G 進行檢測,標(biāo)本濃度覆蓋試劑說明書聲明的最低檢出限(HBV/HCV/HIV≤100 IU/mL),標(biāo)本檢測前置于室溫復(fù)融,漩渦震蕩30 s 或顛倒30 次充分混勻,為防止交叉污染,混勻后瞬時離心再打開蓋子。 每個靈敏度驗證盤分3 d進行檢測,每天每個濃度檢測≥6 次,3 d 檢測每個濃度合計檢測≥20 次。 匯總每種病毒的所有重復(fù)測試數(shù)據(jù)并采用SPSS 20.0 進行PROBIT 分析,評估該核酸檢測系統(tǒng)的LOD和雙側(cè)95%置信區(qū)間。

    1.3.2 重復(fù)性 采用國家衛(wèi)健委臨檢中心提供的濃度≤3倍LOD 的HBV DNA、HCV RNA、HIV-1 RNA 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)以及陰性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),重復(fù)單檢20 次,匯總檢測結(jié)果評價檢測系統(tǒng)的重復(fù)性。

    1.3.3 抗交叉污染 將分析靈敏度驗證盤中的5 支陽性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(C2—G2)與血清盤中配套的5 支陰性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)交叉放置于標(biāo)本架,以單檢模式進行檢測,分析陽性與陰性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的檢測情況。

    1.3.4 檢測系統(tǒng)比對評估 采用國家衛(wèi)健委臨檢中心提供的NAT 血清盤A 中46 份HBV DNA 低濃度標(biāo)本進行核酸檢測,標(biāo)本檢測前置于室溫復(fù)融,漩渦震蕩30 s 或顛倒30 次充分混勻,1 000~1 500×g 離心5 min。 所有標(biāo)本均進行單樣檢測,初次檢測僅檢測1 次,第2 次檢測為雙孔復(fù)檢。 匯總血清盤A 的標(biāo)本的檢測結(jié)果,與其他核酸檢測系統(tǒng)的檢測結(jié)果進行比較,分析該核酸檢測系統(tǒng)在高海拔地區(qū)的檢出能力,以評估當(dāng)前檢測策略。

    2 結(jié)果

    2.1 靈敏度驗證結(jié)果 見表1~5。 分別對HBV DNA、HCV RNA、HIV-1 RNA 的重復(fù)檢測數(shù)據(jù)進行PROBIT 分析,計算每種病毒的95%評估檢測下限(95% LOD)和雙側(cè)95%置信區(qū)間,結(jié)果見表6。

    表1 HBV DNA C 型分析靈敏度驗證結(jié)果

    表2 HCV RNA 2a 型分析靈敏度驗證結(jié)果

    表3 HCV RNA 1b 型分析靈敏度驗證結(jié)果

    表4 HCV RNA 6a 型分析靈敏度驗證結(jié)果

    表5 HIV-1 RNA CRF07_BC 型分析靈敏度驗證結(jié)果

    表6 不同病毒分析靈敏度的PROBIT 分析

    2.2 重復(fù)性試驗結(jié)果 見表7。

    表7 核酸檢測系統(tǒng)重復(fù)性驗證結(jié)果

    2.3 交叉污染試驗檢測結(jié)果 陰性標(biāo)本和陽性標(biāo)本交叉排列單檢結(jié)果顯示,5 個陽性標(biāo)本(含HBV DNA、HCV RNA 和HIV RNA)的檢測結(jié)果均為反應(yīng)性,陽性符合率為100%;5個陰性標(biāo)本的結(jié)果均為無反應(yīng)性,陰性符合率為100%。 未出現(xiàn)檢測標(biāo)本之間的相互交叉污染情況。

    2.4 檢測系統(tǒng)比對評估 所有標(biāo)本經(jīng)化學(xué)發(fā)光法檢測HBsAg,結(jié)果均為無反應(yīng)性,臨檢中心確證為HBV DNA 低濃度標(biāo)本,見表8。 其中,18 份經(jīng)羅氏核酸檢測系統(tǒng)檢測結(jié)果為反應(yīng)性的標(biāo)本,在本站初篩檢測結(jié)果為反應(yīng)性的有8 份,初篩陽性符合率為44.44%,復(fù)測結(jié)果為反應(yīng)性的有14 份,復(fù)檢陽性符合率為77.78%;22 份經(jīng)浩源核酸檢測系統(tǒng)檢測結(jié)果為反應(yīng)性的標(biāo)本,在本站初篩檢測結(jié)果為反應(yīng)性的有13份,初篩陽性符合率為59.09%,復(fù)測結(jié)果為反應(yīng)性的有13份,復(fù)檢陽性符合率為59.09%。 在血清學(xué)檢測HBcAb 呈反應(yīng)性的38 份標(biāo)本中,本站初篩檢出率為47.37%(18/38),復(fù)測檢出率為68.57%(24/35),有3 份標(biāo)本因標(biāo)本量不足而未對其進行復(fù)測,結(jié)果按初篩結(jié)果判定。 在對NAT 血清盤A中所有的低濃度HBV DNA 標(biāo)本的檢測結(jié)果中,本站檢測系統(tǒng)與低海拔地區(qū)檢測結(jié)果的一致性分別為77.78%和77.27%,見表9。

    表8 HBV DNA 低濃度標(biāo)本信息及在不同系統(tǒng)的檢測結(jié)果

    表9 HBV DNA 低濃度標(biāo)本在不同海拔地區(qū)系統(tǒng)的檢出情況

    3 討論

    NAT 具有高靈敏度和高特異性,能夠顯著縮短血清學(xué)檢測的“窗口期”,降低病毒經(jīng)血傳播風(fēng)險,提升血液安全[1-3]。隨著我國血液篩查核酸檢測的基本全覆蓋,如今NAT 已成為血液篩查實驗室的重要檢測手段[7]。 西藏那曲地區(qū)海拔在4 450 米以上,高寒缺氧,氣候干燥,對國產(chǎn)的核酸檢測系統(tǒng)是一個全新的挑戰(zhàn),因此其核酸檢測過程的標(biāo)準(zhǔn)化要求也與低海拔地區(qū)具有明顯差異[8]。 目前血液檢測的標(biāo)準(zhǔn)化文件以及相關(guān)的法律法規(guī),更多的是體現(xiàn)低海拔地區(qū)的特性,亟待建立符合高海拔地區(qū)特點的核酸檢測系統(tǒng)技術(shù)指標(biāo)和性能驗證方法,以確保核酸檢測工作的順利進行,提升高海拔地區(qū)的血液安全[9-11]。 我們參考國家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn),在國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心的大力支持下,結(jié)合西藏那曲血站采供血特點和血液篩查實驗室的工作實際,從多方面探索符合高海拔地區(qū)特點的核酸檢測性能驗證方案與方法。該研究選擇在4 千米以上的海拔地區(qū)進行研究,再結(jié)合其他海拔高度的數(shù)據(jù),如拉薩(海拔3 650 米)[18-19]等,可以得出該研究結(jié)果也適用于其他海拔高度的地區(qū)。

    通過對分析靈敏度血清盤多濃度多基因型HBV DNA/HCV RNA/HIV-1 RNA 標(biāo)本進行單人份檢測,對HBV DNA和HIV-1 RNA 的高濃度標(biāo)本的檢出率均為100%,對中濃度標(biāo)本的檢出率均為90%以上;對檢測結(jié)果進行分析靈敏度的PROBIT 分析顯示,該系統(tǒng)對HBV DNA 的平均95% LOD 為8.29 IU/mL,HIV-1 RNA 的平均95% LOD 為40.52 IU/mL,遠(yuǎn)低于說明書聲明的≤100 IU/mL。 由于該血清盤的標(biāo)本量無法滿足在低海拔地區(qū)再次檢測的要求,因此本研究與低海拔地區(qū)的分析靈敏度的比較無法通過該血清盤的再次檢測來實現(xiàn),但通過相關(guān)報告[20]可以看出,使用該系統(tǒng)在低海拔地區(qū)進行性能驗證的結(jié)果與高海拔地區(qū)沒有差異。

    該檢測系統(tǒng)對HBV 和HIV 的檢出能力均較好;HCV RNA 各基因型的檢出率之間差異較大,這與檢測系統(tǒng)對不同分型的HCV 檢出存在一定的差異有關(guān),不同的核酸檢測系統(tǒng)之間對于HCV 片段的模板選擇不一致,因此對于不同的分型檢出能力就不一致[13-15];2 份220 IU/mL 的HCV RNA 6a 型高濃度標(biāo)本未檢出,均發(fā)生在同1 批檢測中,原因可能與標(biāo)本處理不當(dāng)、病毒分布不均、提取過程受到抑制或操作過程中病毒核酸發(fā)生降解有關(guān),這與高海拔地區(qū)的氣壓和空氣密度的影響也有一定的關(guān)系,這就對實驗室人員的操作提出了更高的要求,因此在進行核酸檢測時的操作規(guī)范性就顯得更為重要。 低濃度標(biāo)本的檢出在不同的檢測系統(tǒng)的確存在一定的差距,但不同的檢測系統(tǒng)在某種基因型上的檢出能力上也的確可能各有不同。 從性能驗證的數(shù)據(jù)看,與低海拔地區(qū)不存在明顯的差異,因此低濃度標(biāo)本的檢出情況應(yīng)該與低海拔地區(qū)沒有明顯的差異。 但系統(tǒng)本身在HCV 不同基因型的低濃度標(biāo)本的檢出上的確存在著較大的差異,這也與HCV 病毒本身的變異較大有關(guān),不同的檢測系統(tǒng)在模板的選擇上存在著差異。 同時由于該血清盤標(biāo)本的選擇為其他系統(tǒng)檢出的低濃度標(biāo)本,因此使用在該系統(tǒng)進行檢測本身就存在一定的客觀影響,不能完全體現(xiàn)出該系統(tǒng)的檢測性能。 從HBV DNA 以及HIV-1 RNA 在低濃度的檢測數(shù)據(jù)來看,在性能上基本可以滿足實驗室檢出性能的要求。 因此總體來看,該檢測系統(tǒng)分析靈敏度基本能夠滿足實驗室實際檢測的需求。

    重復(fù)性分析結(jié)果顯示均為100%,且反應(yīng)性標(biāo)本的Ct 值變異系數(shù)波動范圍較小,符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的≤5%,說明該系統(tǒng)檢測的批內(nèi)精密度較好,完全能夠滿足當(dāng)?shù)匮九繕?biāo)本的檢測要求。 交叉污染性能驗證中,將陽性標(biāo)本和陰性標(biāo)本匯集交叉放置,按照日常檢測模式進行檢測,結(jié)果顯示標(biāo)本間沒有發(fā)生交叉污染,說明該核酸檢測系統(tǒng)具有良好的抗交叉污染的能力。

    我國西藏地區(qū)是乙型肝炎的高發(fā)地區(qū)。 由于西藏地區(qū)的交通相對閉塞,醫(yī)療資源緊缺,因此對乙肝的防治開展較晚,獻(xiàn)血人群中HBV 的感染率和漏檢率都相對較高[12]。 為了減少HBV 的輸血傳播風(fēng)險,在西藏自治區(qū)政府的支持下,血站與國家衛(wèi)健委臨檢中心合作,對HBV DNA 低濃度標(biāo)本進行多系統(tǒng)平行檢測,以評估當(dāng)前核酸檢測實驗室檢測系統(tǒng)與其他系統(tǒng)之間的差異性[16]。 結(jié)果顯示,該核酸檢測系統(tǒng)對HBV 的檢測能力較好,雖然實驗室檢測條件與低海拔地區(qū)具有一定的差異,但對弱陽性標(biāo)本的總體陽性檢出率也達(dá)到80%左右,復(fù)測陽性符合率為59.09%—77.78%,這與檢測的次數(shù)有一定的關(guān)系,檢測次數(shù)越多,檢出的概率也越高[17]。 高海拔地區(qū)的采供血量相對較少,單檢模式的篩查策略既能夠在更大程度上減少HBV 低濃度標(biāo)本的漏檢率,也符合高海拔地區(qū)核酸實驗室的日常檢測要求。

    根據(jù)國家衛(wèi)健委關(guān)于做好“組團式” 對口支援西藏采供血工作的有關(guān)部署,大連市血液中心對口支援那曲市中心血站,以充分發(fā)揮優(yōu)質(zhì)醫(yī)療衛(wèi)生資源作用。 那曲市海拔4 450米,其高海拔、低含氧量、低氣壓等特點對實驗室檢測設(shè)備、檢測技術(shù)以及檢測策略方面有不同程度的影響,與低海拔地區(qū)有著較大的差異[18-19]。 檢測設(shè)備在高海拔地區(qū)的性能驗證與低海拔地區(qū)的差異化評價是保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確的重要手段,針對不同的檢測系統(tǒng)進行性能驗證,能夠有效保證檢測過程標(biāo)準(zhǔn)化以及檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。 本研究通過對核酸檢測系統(tǒng)的分析靈敏度、重復(fù)性、防交叉污染等多項關(guān)鍵指標(biāo)進行驗證,對檢測策略進行評估,結(jié)果達(dá)到預(yù)期要求,可滿足高海拔地區(qū)實際檢測的工作需要,填補了高海拔地區(qū)血液篩查核酸檢測系統(tǒng)性能驗證的空白,有助于確保高海拔地區(qū)血液檢測過程的標(biāo)準(zhǔn)化,提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性,從而提升高海拔地區(qū)的血液安全水平,有利于提升高海拔地區(qū)的血液安全。 同時,本文提出的高海拔地區(qū)性能驗證方案和方法也能為其他高海拔地區(qū)的采供血機構(gòu)開展核酸檢測工作提供了參考。 在不同的高海拔地區(qū),可以根據(jù)本研究的方案和方法進行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整和優(yōu)化,以確保核酸檢測系統(tǒng)在各地的準(zhǔn)確性和可靠性。

    利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。

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