卡痛葉中生物堿類活性成分研究進展

李玉靜，何洪源*，李潤康，趙 霞

（1.中國人民公安大學 偵查學院，北京 100038；2.中國民用航空中南地區(qū)管理局公安局，廣東 廣州 510545；3.國家毒品實驗室北京分中心，北京 100164）

卡痛樹是原產(chǎn)于東南亞的茜草科熱帶植物［1］，馬來西亞和泰國稱之為kratom、biak-biak或ketum［2］，美國稱之為mitragyna speciosa?？ㄍ慈~屬于植物類天然毒品，含有數(shù)十種吲哚類和羥吲哚類生物堿，具有興奮和鎮(zhèn)痛效果，長期攝入可使人產(chǎn)生嚴重依賴。早期東南亞的體力勞動者通過咀嚼新鮮的卡痛葉或飲用卡痛茶來緩解疲勞和提高體力?？ㄍ慈~的提取物可治療腹瀉、疼痛、咳嗽和發(fā)燒［3-4］，也用于抑制阿片類毒品戒斷癥狀或作為鴉片的替代品［5］。有些罹患精神障礙和慢性疼痛的人將卡痛制品替代處方藥，用于“自我治療”［6］。近年來，卡痛制品逐漸在歐美地區(qū)興起［7］，多為卡痛葉的濃縮提取物，是年輕人群體中較為流行的新精神活性物質［8］。隨著全球范圍內卡痛葉或卡痛制品濫用人數(shù)的急劇增加，因此而導致的中毒或死亡案件時有發(fā)生［7，9-10］，許多國家已將卡痛葉列為非法物質。

在Web of Science 核心合集中，將“mitragyna speciosa”或“kratom”或“mitragynine”作為主題詞，以“article”和“review”作為目標文獻類型進行檢索，整理得到607 篇相關文獻。使用可視化分析工具CiteSpace 6.1.R6結合Excel對卡痛葉研究現(xiàn)狀進行分析。如圖1A所示，卡痛葉相關文獻的年度發(fā)文量總體呈上升趨勢，其中，2018年到2022年該領域發(fā)展迅速，文獻發(fā)文量急劇增加，卡痛葉相關研究越來越受到關注。運用CiteSpace 進行關鍵詞共現(xiàn)分析（圖1B），頻次較高的關鍵詞有“alkaloid”“pharmacology”“abuse”“opioid receptor”，表明卡痛葉生物堿性質與藥物濫用是該領域的研究熱點問題。鑒于此，本文綜述了卡痛葉生物堿類活性成分的藥理毒理作用、體內代謝過程及檢驗方法的最新研究進展，以為卡痛葉生物堿類活性成分的準確鑒定提供技術參考。

圖1 卡痛葉研究的年度發(fā)文量趨勢圖（A）和關鍵詞共現(xiàn)圖（B）Fig.1 Annual publication trend chart（A） and visualization of co-occurrence keywords（B） of the kratom study

1 卡痛葉中的生物堿類活性成分

帽柱木堿（Mitragynine）和7-羥基帽柱木堿（7-Hydroxymitragynine）是卡痛葉的主要生物堿類活性成分。Mitragynine 是卡痛葉的主要生物堿，約占卡痛葉總生物堿含量的66%（質量分數(shù)），由Ellen field 在1921 年首次分離，是具有單萜結構的吲哚類生物堿［8］，mitragynine 的非對映異構體有speciogynine、speciociliatine、mitraciliatine，其在C3、C15、C20 上的空間排列不同。受種植季節(jié)、光照強度、相對濕度、土壤類型等環(huán)境因素［11］的影響，不同產(chǎn)地卡痛葉中mitragynine 的含量不同，東南亞地區(qū)的mitragynine含量往往更高［12］。7-Hydroxymitragynine是卡痛葉的次要生物堿，僅占總生物堿含量的2%（質量分數(shù)），但其突出的藥理學表現(xiàn)使之被廣泛關注。7-Hydroxymitragynine 是mitragynine 在C7 位上的氧化衍生物，可由mitragynine代謝產(chǎn)生。

卡痛葉中還存在speciogynine、speciociliatine、paynantheine 等50 余種生物堿，相關活性有待進一步研究，其中的常見生物堿結構如圖2所示。

圖2 卡痛葉中的常見生物堿結構式圖Fig.2 Structure diagrams of alkaloids in kratom

2 卡痛葉中生物堿類活性成分的藥理、毒理作用及體內代謝過程

2.1 藥理作用

卡痛葉中生物堿類活性成分的藥理作用主要包括抗炎作用、抗抑郁作用和胃腸道作用。

Utar等［13］在研究mitragynine 抗炎作用時發(fā)現(xiàn)，低濃度時，mitragynine 抑制環(huán)氧化酶COX-2的表達，對環(huán)氧化酶COX-1無影響；高濃度時，mitragynine能夠同時抑制COX-1和COX-2的表達，減少炎癥介質前列腺素E2的形成，從而發(fā)揮mitragynine的抗炎作用。Shaik等［14］研究認為mitragynine的抗炎作用通過抑制促炎介質釋放和改善血管通透性共同實現(xiàn)。

Mitragynine 也具有抗抑郁作用。下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸系統(tǒng)功能障礙或亢進是確診抑郁的重要指標，人類表現(xiàn)為皮質醇分泌多，嚙齒動物表現(xiàn)為皮質酮分泌多［15］。Idayu等［16］在小鼠強迫游泳試驗（FST）和懸尾試驗（TST）中發(fā)現(xiàn)，mitragynine 可以顯著縮短小鼠的靜止時間，減少小鼠體內的皮質酮分泌，這表明mitragynine的抗抑郁功能是通過與HPA軸系統(tǒng)的相互作用實現(xiàn)的。

在對mitragynine 的胃腸道作用研究中，Matsumoto 等［17］發(fā)現(xiàn)mitragynine 和7-hydroxymitragynine 能夠抑制小鼠的胃腸道運轉。Tsuchiya等［18］將mitragynine注射到大鼠的第四腦室，發(fā)現(xiàn)mitragynine可以通過阿片受體作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，從而抑制胃酸分泌。Chittrakarn 等［19］發(fā)現(xiàn)卡痛葉提取物對蓖麻油引起的大鼠腹瀉具有緩解作用。糖尿病患者血糖波動過大可直接損害胃腸道功能，Purintrapiban 等［20］在研究卡痛葉對肌肉細胞的葡萄糖轉運作用時，發(fā)現(xiàn)卡痛葉可顯著提高葡萄糖攝取率以及葡萄糖轉運蛋白質水平，具有抗糖尿病作用。

2.2 毒理作用

卡痛葉中的生物堿類活性成分有兩種作用機制，一是Mitragynine 與μ-阿片受體（MOR）和δ-阿片受體（DOR）相結合，7-hydroxymitragynine 與MOR 和κ-阿片受體（KOR）相結合，從而產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用［7］；二是mitragynine阻斷神經(jīng)元上鈣離子的反向通道，抑制神經(jīng)遞質的釋放［21］，進而抑制痛覺信號的傳導［22］，從而達到止痛效果。Mitragynine 和7-hydroxymitragynine 具有較高的親脂性，比嗎啡更容易突破血腦屏障，進入大腦產(chǎn)生藥效［17］，等劑量攝入時，mitragynine 和7-hydroxymitragynine 的鎮(zhèn)痛作用分別為嗎啡的13倍和4倍［23］。

卡痛葉的毒理學效應與攝入劑量有關。攝入低至中等劑量（1～5 g）卡痛葉使人精力充沛、精神愉悅，具有減緩身體疲勞、提高社交能力和性能力的功效，起效時間一般在10 min以內并能維持1～1.5 h；攝入中等至高劑量（5～15 g）卡痛葉則能產(chǎn)生類似于鴉片的興奮效應［23］；攝入高劑量（15 g以上）卡痛葉能立即大量出汗、頭暈、惡心和煩躁等，隨后產(chǎn)生與嗎啡類似的鎮(zhèn)靜、麻醉效應，藥效可維持6 h左右［24］。長期高劑量攝入卡痛葉，能使人產(chǎn)生焦慮、易怒、厭食、精神錯亂和暴力傾向，突然中止攝入還會引起呼吸抑制、幻覺、惡心、自制困難等一系列戒斷癥狀［25］。Trakulsrichai 等［26］通過對10 名飲用卡痛茶的男性受試者進行觀察，發(fā)現(xiàn)所有受試者均出現(xiàn)了舌頭麻痹、血壓升高和心率加快的生理現(xiàn)象。

2.3 體內代謝過程

Mitragynine 具有復雜的體內代謝過程，其多種代謝物（如7-hydroxymitragynine、9-O-demethyl mitragynine）仍具有阿片活性，在體內發(fā)揮毒理作用。Philipp 等［27］首次報道了mitragynine 的體內代謝過程，檢測了鼠尿和人尿中的mitragynine Ⅰ相代謝和Ⅱ相代謝產(chǎn)物，見表1。Mitragynine的代謝主要在肝臟中進行，代謝物主要為4 種單氧化物（包括7-hydroxymitragynine）和1 種去甲基化代謝物（9-O-demethyl mitragynine）［28］，主要代謝途徑（圖3）包括C7位上的羥基化、C16位上甲基的水解、C9上甲氧基團的O-脫甲基化、葡萄糖醛酸化和硫酸化等。其代謝過程受到4 種細胞色素P450（CYP450）酶CYP3A4、CYP2C19、CYP2C18、CYP2D6 的影響，CYP3A4 主要負責7-hydroxymitragynine 的生成，CYP2C19、CYP3A4 和CYP2D6 共同催化9-O-demethyl mitragynine 的生成，CYP2D6、CYP2C19 和CYP2C18 共同催化16-carboxy mitragynine 的生成，CYP2C19 主要負責9-O-demethyl-16-carboxy mitragynine 的生成［29］。此外，7-hydroxymitragynine 在人血漿中不穩(wěn)定，可進一步轉化為更有效的MOR 激動劑mitragynine pseudoindoxyl［30］，也可在體內代謝產(chǎn)生少量的mitragynine［31］。

表1 Mitragynine的體內代謝產(chǎn)物Table 1 Metabolites of mitragynine in vivo

圖3 Mitragynine與7-hydroxymitragynine的主要代謝途徑Fig.3 Metabolic pathways of mitragynine and 7-hydroxymitragynine

3 卡痛葉生物堿類活性成分的檢驗方法

3.1 常規(guī)檢驗方法

氣相色譜-質譜聯(lián)用法、高效液相色譜法、液相色譜-質譜聯(lián)用法等是毒品的常規(guī)檢驗方法［32］，廣泛用于可疑卡痛葉樣品的鑒定和卡痛葉濫用案件中生物檢材的檢驗，詳見表2。

表2 卡痛葉主要生物堿類活性成分及代謝物的常規(guī)檢驗方法Table 2 Routine detection methods for the main alkaloid active ingredients and metabolites of kratom

3.1.1 氣相色譜-質譜聯(lián)用法2005 年氣相色譜-質譜聯(lián)用法（GC-MS）被首次用于卡痛葉生物堿類活性成分的檢驗［41］，Philipp等［42］應用GC-MS檢驗尿液中的卡痛葉生物堿類活性成分及其代謝物，在處理尿液樣品時，以固相萃取提取目標物并使用雙（三甲基硅基）三氟乙酰胺（BSTFA）進行衍生化，mitragynine的檢出限（LOD）為100 ng/mL。GC-MS操作簡單，維護成本較低，是實驗室檢驗卡痛葉生物堿類活性成分的常用方法，但其有一定局限性，如樣品必須經(jīng)過復雜的衍生化處理［43］，mitragynine 與其非對映異構體較難分離等。

3.1.2 高效液相色譜法液相色譜法分離效率高，通常使用C18色譜柱，常用檢測器為二極管陣列檢測器（DAD）和紫外檢測器（UV），可滿足生物檢材中卡痛葉生物堿類活性成分及代謝物定性定量檢測的需求。Neng等［44］應用高效液相色譜（HPLC）結合二極管陣列檢測器（DAD）檢驗尿液中的mitragynine，采用棒吸附微萃取技術（BAμE）進行樣本前處理，以改性N-乙烯基吡咯烷酮聚合物作為吸附劑提取目標物，方法回收率為97.7%～108%，線性范圍為0.6～24 ng/mL，LOD 為0.1 ng/mL，定量下限（LOQ）為0.33 ng/mL。除易于操作和環(huán)境友好外，新的萃取技術不僅可提高mitragynine 的選擇性，且在痕量水平上具有較高靈敏度。Sim等［45］應用HPLC法結合紫外檢測器（UV）檢驗組織液中的mitragynine，采用優(yōu)化的梯度洗脫方案，有效縮短了mitragynine 的出峰時間，改善了峰形，在0.5～10 μg/mL 線性范圍內，方法的LOD 和LOQ 分別為0.47、1.43 μg/mL；在10～175 μg/mL 線性范圍內，LOD 和LOQ 分別為4.29、13.01 μg/mL。該法性能穩(wěn)定，相對標準偏差（RSD）小于2.0%。

3.1.3 液相色譜-質譜聯(lián)用法液相色譜-串聯(lián)質譜法（LC-MS/MS）和液相色譜-高分辨質譜法（LCHRMS）廣泛用于復雜基質的藥物分析。串聯(lián)質譜（MS/MS）可實現(xiàn)目標物的多級確認，高分辨質譜（HRMS）可提供精確質量數(shù)，是液相色譜-質譜聯(lián)用法中常用的分析技術。mitragynine 與其非對映異構體的裂解方式相同，使用常規(guī)液相色譜-質譜聯(lián)用法檢驗卡痛葉生物堿類活性成分時，speciogynine、speciociliatine 與mitragynine 共洗脫，不利于mitragynine 的定量分析和陽性認定。Helander 等［46］通過改進梯度洗脫程序優(yōu)化了LC-HRMS 方法，實現(xiàn)了mitragynine與其3種非對映異構體的基線分離（圖4）。該方法的線性范圍可達2 000 ng/mL，LOQ 為1 ng/mL。Basiliere 等［33］采用固相萃取和液相色譜-四極桿飛行時間質譜法（LC-Q/TOF MS）檢驗尿液中的mitragynine、7-hydroxymitragynine 等5 種生物堿，實現(xiàn)了mitragynine 與其非對映異構體的完全分離，對mitragynine 的LOD 為0.25 ng/mL，LOQ 為0.5 ng/mL；為研究mitragynine 的Ⅱ相代謝物對Ⅰ相代謝物濃度的影響，該課題組［47］分別采用化學水解法和酶水解法處理尿液，并采用已建立的LC-Q/TOF MS 法進行檢驗。結果表明，酶水解法僅增加了16-carboxymitragyine 的濃度，化學水解則破壞了尿液中游離的Ⅰ相代謝物。

圖4 目標物梯度洗脫流程圖及標準樣品色譜圖［46］Fig.4 The gradient elution flow chart of the targets and chromatogram of the standard sample［46］

3.2 快速檢驗方法

3.2.1 質譜法常規(guī)的氣相色譜-質譜聯(lián)用法、高效液相色譜法、液相色譜-質譜聯(lián)用法儀器設備復雜，對操作人員有較高的專業(yè)和技術要求，樣品前處理步驟也增加了整體分析時間。敞開式電離質譜（AIMS）工作流程簡便，無需或僅需簡單樣品前處理，簡化了工作程序和分析時間，顯著提高了分析效率。Voelker等［48］分別采用便攜式實時熱解吸質譜儀（DART-TD-MS）和手持式質譜儀（MX908）檢驗卡痛葉粉末樣品。實時直接分析（DART）技術作為一種原位電離技術無需樣品前處理，只需將樣品收集器按壓在卡痛葉粉末樣品包裝內部即可進行樣品分析，對mitragynine 的最低檢測水平（MDL）可達200 ng，數(shù)據(jù)采集時間為20 s，數(shù)據(jù)處理用時為30 s，是一種快速的現(xiàn)場篩查技術；手持式MX908 由樣品導入模塊、常壓化學電離源和小型化離子阱質量分析器組成，具有板載數(shù)據(jù)存儲和處理功能，設備體積小、功耗低，但由于檢測時直接進樣會導致背景信號增強，因此需要用氯仿溶解粉末樣品，再進行渦旋離心過濾，MX908檢測mitragynine的MDL可達80 ng，樣品分析用時僅需45 s。

目前，便攜式質譜儀在卡痛葉生物堿類活性成分檢驗時尚存在一定的誤檢率，可通過與便攜式傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR）或便攜式離子遷移譜聯(lián)合使用［48］，有效驗證分析結果，提高現(xiàn)場檢測的可靠性。

3.2.2 免疫分析法免疫分析法利用抗原與抗體之間的特異性親和反應來檢驗目標物。Mitragynine缺乏免疫表位，需要首先與載體蛋白（如陽離子牛血清白蛋白（sBSA）、卵清蛋白（OVA）等）結合形成免疫原，之后將其注射到家兔或小鼠體內以獲得單克隆或多克隆抗體。Limsuwanchote 等［49］將mitragynine 的羧酸化衍生物（MGA）與載體蛋白BSA 偶聯(lián)制備免疫原，通過基質輔助激光解析電離飛行時間質譜（MALDI-TOF MS）測定半抗原數(shù)量驗證了MGA-BSA 具有良好的免疫原性。用MGA-BSA 免疫小鼠并構建雜交瘤1A6 產(chǎn)生抗體MAb 1A6，研究表明，該抗體與生物堿speciogynine、paynantheine 和mitraciliatine 的交叉反應活性分別為30.54%、24.83%和8.63%。利用該抗體建立測定mitragynine 的間接競爭酶聯(lián)免疫吸附法（icELISA），方法線性范圍為32.92～250 μg/mL，LOD為32.47 μg/mL，其定量結果與高效液相色譜法具有良好的相關性（r2= 0.994），是檢測卡痛葉中mitragynine 的有效工具；四年后，該課題組又研發(fā)了競爭性的側流免疫層析試紙［50］，將抗mitragynine 單克隆抗體與膠體金的結合物作為識別探針，在試紙條上固定mitragynine 與卵清蛋白的偶聯(lián)物作為測試區(qū)，羊抗鼠IgG 抗體作為對照區(qū)，待測樣品中mitragynine 的含量與測試區(qū)顏色強度呈反比，見圖5。該試紙條的檢測靈敏度低于icELISA，僅為1 mg/mL，在低溫（4 ℃）下可穩(wěn)定保存兩個月，具有便攜、結果直觀、易解釋等優(yōu)點。

圖5 Mitragynine免疫層析試紙示意圖［50］Fig.5 Schematic description of the mitragynine immunochromatographic strip［50］

多克隆抗體具有同時檢測多個表位的能力，可實現(xiàn)更穩(wěn)健的檢測和更高的靈敏度。Mustafa等［51］使用多克隆抗體建立了檢測mitragynine 的icELISA，在制備抗體時比較了不同的抗體修飾策略，發(fā)現(xiàn)抗體在C22-MG-cBSA 上表現(xiàn)出更高的結合親和力，靈敏度顯著提高。該方法的線性范圍為0.01～10.00 μg/mL，LOD 和LOQ分別為0.041 2、0.124 μg/mL。

3.2.3 其他快檢方法近幾年，便攜式光譜儀器因體積輕便、操作簡單、分析快速，受到研究人員的廣泛關注。手持式拉曼光譜儀無需樣品暴露，場地適應性強，是繳獲樣品現(xiàn)場分析的有力工具。Lanzarotta 等［52］使用5 臺手持式拉曼光譜儀（1 064 nm）結合表面增強拉曼光譜（SERS）技術檢驗卡痛葉粉末樣品中的mitragynine，SERS顯著增強了mitragynine 的光譜信號，該方法的LOD 小于342 ng/mL，真陽性率為99.3%，真陰性率為97.9%。FTIR 掃描速度快，光譜范圍寬，光通量大，具有較高的準確度和靈敏度。Voelker等［48］評估了Nicolet iS5便攜式FTIR 對卡痛葉粉末的鑒別能力，樣品經(jīng)氯仿提取后檢驗，檢測的含量范圍為12.7～69.3 mg/g，儀器的識別準確率為99.5%。

免疫傳感器是以抗體或抗原作為敏感元件的生物傳感器，將傳統(tǒng)的免疫測試和生物傳感技術結合，減少了分析時間，提高了測試精度，具有高度特異性、穩(wěn)定性、小型化以及基于光學、質量或電化學技術的不同檢測器的應用靈活性。Mustafa 等［53］利用抗mitragynine 多克隆抗體開發(fā)了基于icELISA 的電化學免疫傳感器，并首次用于現(xiàn)場尿液中mitragynine 的檢驗，采用多壁碳納米管（MWCNT）/殼聚糖（CS）納米復合材料用作傳感器制造的改性劑，顯著提高了電極性能，并通過酶促反應產(chǎn)生電化學信號。該方法的線性范圍為0.001～10 μg/mL，LOD為0.018 μg/mL，LOQ為0.06 μg/mL。

4 結 語

目前，卡痛葉在全球范圍內流行，濫用形勢愈發(fā)嚴峻，對其生物堿類活性成分的檢驗和鑒定具有越來越重要的意義。本文綜述了卡痛葉生物堿類活性成分的藥理毒理作用、體內代謝過程以及檢驗方法的最新研究進展?？ㄍ慈~的主要生物堿類活性成分為mitragynine 和7-hydroxymitragynine，通過與體內阿片受體結合產(chǎn)生作用，具有多種代謝途徑和代謝產(chǎn)物。其常用的檢驗方法有氣相色譜-質譜聯(lián)用法、高效液相色譜法和液相色譜-質譜聯(lián)用法。質譜法、免疫分析法、便攜式光譜儀和免疫傳感器可用于卡痛葉的現(xiàn)場快速分析，其中AIMS是一種新型質譜技術，具有實時、原位、高通量、簡便快速等優(yōu)點；ELISA 是目前最流行的免疫分析法，設備體積小、線性范圍寬、安全性好，但抗體可能與其他結構類似物產(chǎn)生交叉反應；相同的抗體條件下，電化學免疫傳感器的靈敏度比ELISA 高10倍，檢測速度更快，試劑用量少，更適用于卡痛葉的現(xiàn)場檢測。

在今后的研究中應注重開展以下工作：一是提高對mitragynine 及其結構類似物的分離能力，不斷優(yōu)化色譜條件，或建立超臨界流體色譜（SFC）等手性分離能力更好的實驗室分析方法；二是關注卡痛葉中的其他相關生物堿，研究其藥理毒理作用，通過分析體內代謝途徑及各種藥物代謝酶的關系，預測潛在的藥物相互作用，分析代謝產(chǎn)物對人體產(chǎn)生的影響；三是開發(fā)現(xiàn)場快速檢測卡痛葉生物堿類活性成分的AIMS方法，改進電離方式，降低誤檢率，提高對生物檢材的分析能力；四是通過結合先進納米材料和逆反射光學信號標簽等先進傳感元件，進一步研發(fā)適用于卡痛葉現(xiàn)場分析的高靈敏度和特異性的免疫傳感器。