硒對平菇胞外酶活性的影響

沈彩奕,黎玉婷,劉曉敏,王溢華,馮光志,石 玉

(武漢設(shè)計(jì)工程學(xué)院食品與生物科技學(xué)院,湖北武漢 430205)

硒是人體必需微量元素,硒在人體中可編碼 25 種硒蛋白,具有多種生化功能,缺硒可導(dǎo)致心臟功能障礙、炎癥、肝病甚至癌癥等 40 種生理疾病[1-2]。然而,根據(jù)中國營養(yǎng)學(xué)會(huì)發(fā)表的資料顯示,在我國許多地區(qū)人體硒元素存在不同程度的缺乏,長期攝入量的不足,必將耗盡體內(nèi)的儲(chǔ)存,從而影響身體健康,甚至導(dǎo)致疾病的發(fā)生[3]。為了滿足人們對硒的需求,近些年科研工作者致力于開發(fā)富硒產(chǎn)品,包括富硒酵母、富硒茶、富硒藻類、富硒蔬菜、富硒水果和富硒大米等,取得了一定的效益,但遠(yuǎn)不能滿足市場需求。食用菌具有很高的營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值,深受廣大消費(fèi)者青睞,食用菌產(chǎn)業(yè)經(jīng)過多年的發(fā)展,已成為我國產(chǎn)業(yè)中僅次于糧、油、蔬、果的第五大產(chǎn)業(yè),食用菌產(chǎn)品也成為我國國民餐桌上習(xí)以為常的美味佳肴[4-8]。平菇(Pleurotusostreatus) 又稱糙皮側(cè)耳,是我國栽培最為廣泛的食用菌[9],研究表明,平菇具有吸收和富集金屬元素的生物學(xué)特性[10-13],平菇對有益微量元素的富集,可以促進(jìn)食用菌的生長,增加食用菌營養(yǎng)價(jià)值與功能活性成分[14-15]。同時(shí),以游離態(tài)存在的硒,具有一定毒性,也不易被人體吸收,通過平菇的富集作用,將無機(jī)形態(tài)的硒,與平菇體內(nèi)的生物分子結(jié)合,形成易于人體吸收且毒性小的有機(jī)硒,更有利于硒的免疫功能和平菇保健功能的發(fā)揮。

平菇在生長發(fā)育過程中產(chǎn)生胞外酶,胞外酶可以分解培養(yǎng)料使多糖、蛋白質(zhì)、核酸等天然高聚物裂解成食用菌菌絲和子實(shí)體便于吸收的小分子物質(zhì),為平菇菌絲生長、原基形成、子實(shí)體生長提供營養(yǎng)物質(zhì)[16],平菇胞外酶活性與平菇的生長發(fā)育息息相關(guān)。有益元素在平菇生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用,顯著影響平菇的菌絲生長,以及營養(yǎng)價(jià)值與功能活性成分[17]。同時(shí),有益元素還會(huì)一定程度的在平菇子實(shí)體中富集,進(jìn)而提高平菇品質(zhì)。然而,金屬元素的過度使用,又會(huì)對平菇的生長發(fā)育產(chǎn)生抑制,甚至造成平菇的重金屬污染。為此,筆者通過袋料栽培研究不同濃度硒對平菇生長和胞外酶活性的影響,確定平菇栽培最適硒濃度,以期為進(jìn)一步開發(fā)富硒食用菌產(chǎn)品提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器供試平菇菌種保藏于武漢設(shè)計(jì)工程學(xué)院食品與生物科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心。

亞硒酸鈉、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、可溶性淀粉、濾紙、葡萄糖、木糖、3,5-二硝基水楊酸( DNS) 、酒石酸鉀鈉、結(jié)晶酚、無水亞硫酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、一水合檸檬酸、二水合檸檬酸三鈉,均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,木聚糖購自sigma公司。

AL104電子天平、722型紫外可見分光光度計(jì)、SW-CJ-ZG超凈工作臺(tái)、BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌器、TG16-WS 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、HH-S6 恒溫水浴鍋。

1.2 培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基為PDA固體培養(yǎng)基。基礎(chǔ)袋料培養(yǎng)基為玉米芯58%,麥麩20%,秸稈20%,石膏1%,石灰1%,與水以質(zhì)量比1∶1.2混合均勻,分裝于培養(yǎng)袋中,每袋裝樣量180 g。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1富硒平菇的接種栽培。在基礎(chǔ)袋料培養(yǎng)基中添加亞硒酸鈉,使硒終濃度分別為0、200、300、400 mg/kg,在無菌條件下,將在斜面培養(yǎng)基中活化好的平菇菌絲以1 cm2菌塊大小接種到基礎(chǔ)袋料培養(yǎng)基中,每個(gè)濃度設(shè)3 個(gè)平行。

1.3.2粗酶液的制備。在平菇生長的7個(gè)時(shí)期(菌絲半袋、菌絲滿袋、滿袋后熟、菌芽期、伸長期、成熟期、采后,編號(hào)依次為1～7),無菌條件下,分別從培養(yǎng)袋中稱取1 g菌絲混合后置于研缽中,加入10 mL去離子水冰上研磨,然后轉(zhuǎn)移至離心管中,再量取5 mL去離子水洗滌研缽,一并轉(zhuǎn)移至離心管中,4 ℃、8 000 r/min離心10 min,離心后的上清液即為粗酶液。

1.4 測定項(xiàng)目與方法

1.4.1羧甲基纖維素鈉酶活(CMCase)的測定。取200 μL粗酶液與800 μL底物(1% 羧甲基纖維素鈉)混勻后35 ℃水浴30 min,立即加入1.5 mL DNS試劑,沸水浴5 min,冷卻后,蒸餾水定容至10 mL,在 540 nm下測定含糖量,以沸水滅活的粗酶液作為對照,設(shè)3次重復(fù)。酶活定義為1 min轉(zhuǎn)化葡萄糖的毫克數(shù)。

1.4.2木聚糖酶活的測定。取200 μL粗酶液與800 μL底物(1% 木聚糖)反應(yīng),方法參照“1.4.1”。酶活定義為1 min 轉(zhuǎn)化木糖的毫克數(shù)。

1.4.3淀粉酶活的測定。取200 μL粗酶液與800 μL底物(1% 可溶性淀粉)反應(yīng),方法參照“1.4.1”。酶活定義為1 min轉(zhuǎn)化葡萄糖的毫克數(shù)。

1.4.4濾紙酶活的測定。取200 μL粗酶液、800 μL緩沖液、3片直徑1 cm的小濾紙片混勻后反應(yīng),方法參照“1.4.1”。酶活定義為1 min轉(zhuǎn)化葡萄糖的毫克數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 硒對平菇生長發(fā)育的影響不同質(zhì)量濃度硒對平菇生長發(fā)育有顯著影響。隨著硒質(zhì)量濃度的增加,菌絲生長速度加快,說明添加適量硒會(huì)促進(jìn)平菇菌絲生長。當(dāng)硒質(zhì)量濃度為 300 mg/kg 時(shí),平菇菌絲生長最快。隨著硒質(zhì)量濃度的進(jìn)一步增大,菌絲生長速度又逐漸下降。從菌絲形態(tài)、生長勢和滿袋時(shí)間看,添加300 mg/kg 硒處理的平菇菌絲潔白、濃密、粗壯且平菇菌絲提前長滿菌袋。

2.2 硒對CMC酶分泌的影響從圖1可以看出,在平菇生長發(fā)育的前4個(gè)時(shí)期,不同濃度的硒添加量對平菇胞外羧甲基纖維素酶活性的影響較小,在子實(shí)體伸長期后,不同硒添加量的胞外羧甲基纖維素酶活性迅速提高,且在子實(shí)體成熟期達(dá)到峰值,活性大小表現(xiàn)為300 mg/kg Se>400 mg/kg Se>200 mg/kg Se>0 mg/kg Se,分別為13.81、12.73、11.35、10.94 U/g,子實(shí)體采摘后纖維素酶活性呈下降趨勢。

圖1 不同硒添加量平菇纖維素酶活性變化Fig.1 Changes of CMCase activity in Pleurotus ostreatus under different selenium additions

2.3 硒對木聚糖酶分泌的影響從圖2可以看出,在平菇菌絲生長階段,不同硒添加量培養(yǎng)料的木聚糖酶活性基本保持不變,菌芽期到子實(shí)體成熟期,酶活大幅度提高,在子實(shí)體成熟期,木聚糖酶活性最高的是300 mg/kg 硒培養(yǎng)料,酶活性為15.84 U/g,其余由大到小依次為200 mg/kg Se>0 mg/kg Se>400 mg/kg Se,最大值分別為14.68、13.11、11.46 U/g,子實(shí)體采摘后降低。

圖2 不同硒添加量平菇木聚糖酶活性變化Fig.2 Changes of xylanase activity in Pleurotus ostreatus under different selenium additions

2.4 硒對濾紙酶分泌的影響由圖3可知,平菇生長的菌芽期以前,不同硒添加量的平菇胞外濾紙酶均維持較低的活性,菌芽期后開始逐漸升高,在子實(shí)體成熟前,不同硒添加量的胞外濾紙酶活性快速提高,成熟期均達(dá)到最大,其中活性最高的是300 mg/kg Se,為5.98 U/g,其余由大到小依次為200 mg/kg Se >0 mg/kg Se >400 mg/kg Se,最大值分別為5.30、4.57、2.62 U/g。子實(shí)體采摘后迅速降低。

圖3 不同硒添加量平菇濾紙酶活性變化Fig.3 Changes of FPase activity in Pleurotus ostreatus under different selenium additions

2.5 硒對淀粉酶分泌的影響由圖4可知,在平菇菌絲生長時(shí)期,不同硒添加量的平菇胞外淀粉酶均維持較低的活性,進(jìn)入后熟期后酶活性開始迅速提高,在子實(shí)體成熟期胞外淀粉酶活性最高,其中300 mg/kg Se 培養(yǎng)料活性最大值為14.47 U/g,其余由大到小依次為200 mg/kg Se >0 mg/kg Se >400 mg/kg Se,最大值分別為12.79、12.19、9.12 U/g,采摘子實(shí)體后開始逐漸下降。

圖4 不同硒添加量平菇淀粉酶活性變化Fig.4 Changes of amylase activity in Pleurotus ostreatus under different selenium additions

3 討論

食用菌胞外酶活性反映菌株對基質(zhì)的降解能力,影響食用菌的生長周期。早在1977年,Wood等[18]研究發(fā)現(xiàn)雙孢菇的產(chǎn)量與纖維素酶的活性密切相關(guān),隨后,Claydon 等[19]也證實(shí)了這個(gè)結(jié)論。目前,一些學(xué)者對這些胞外酶與食用菌生長發(fā)育的關(guān)系進(jìn)行了研究。主要包括2個(gè)方面:一是培養(yǎng)基質(zhì)對食用菌胞外酶活性的影響,另一個(gè)方面是金屬元素對食用菌胞外酶活性的影響。關(guān)于培養(yǎng)基質(zhì)方面的研究較多,高芮等[20]研究了工業(yè)生產(chǎn)上常用的5種配方對金頂側(cè)耳生育期間的營養(yǎng)利用及胞外酶活性的影響,結(jié)果表明,不同配方培養(yǎng)料中菌絲對營養(yǎng)物質(zhì)的降解利用能力不同。賀春玲等[21]利用葡萄木屑代替常用配方木屑栽培香菇,篩選出葡萄木屑栽培香菇高效配方 D1,配方 D1香菇子實(shí)體農(nóng)藝性狀優(yōu)于對照,但配方 D1 轉(zhuǎn)色及采收時(shí)間比對照晚 2 d 左右,且隨著葡萄木屑添加量的增加,香菇菌絲漆酶活性呈逐漸降低趨勢?？梢?食用菌培養(yǎng)基質(zhì)對食用菌的胞外酶分泌以及食用菌的生長發(fā)育有較大影響,選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基質(zhì),既可以降低成本,也可以調(diào)節(jié)食用菌的胞外酶活性,改善食用菌品質(zhì),縮短食用菌的培養(yǎng)周期。隨著對食用菌研究的不斷深入,許多科研工作者發(fā)現(xiàn),金屬元素在食用菌生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用,主要包括兩類金屬元素:一類是食用菌生長以及人體所必需的某些金屬元素,如鉀、鈣、鋅、硒、鐵、碘等元素,它們對于食用菌的生長發(fā)育具有一定的促進(jìn)作用,另一類是對食用菌生長以及人體有害的元素,主要有鉛、砷、鎘、汞等,這些金屬可能帶來食用菌產(chǎn)品的質(zhì)量安全問題。目前關(guān)于這些有害元素的報(bào)道較多,熊曉斌等[22]研究了鉛、砷、鎘、汞對食用菌菌絲生長的影響,結(jié)果表明培養(yǎng)料添加重金屬質(zhì)量濃度小于 1 mg/kg時(shí),菌絲生長速度變慢,重金屬質(zhì)量濃度大于 1 mg/kg時(shí),會(huì)明顯抑制菌絲的生長。對于有害金屬元素的研究主要集中于重金屬對食用菌的富集而引起的食用菌產(chǎn)品污染。隨著人們對健康飲食的日益重視,富硒富鋅食品備受人們推崇,硒、鋅等有益元素對食用菌生長發(fā)育的研究逐漸增多,楊慧等[23]采用液體搖瓶培養(yǎng)方法,比較了鐵、鋅和鈣離子對食用菌生長的影響,表明鐵、鋅和鈣離子可以在香菇、金針菇和刺芹側(cè)耳菌絲中富集,適當(dāng)濃度的金屬離子能夠促進(jìn)菌絲生長。趙金鳳等[24]通過含有不同硒濃度液體培養(yǎng)基培養(yǎng)茶樹菇,研究了菌絲胞外酶的活性變化,表明硒對菌絲胞外酶活性有一定的影響,添加適宜濃度的硒對茶樹菇菌絲胞外酶活性均有促進(jìn)作用。該研究通過添加不同濃度硒進(jìn)行袋料栽培平菇,考察菌體生長及培養(yǎng)基中纖維素酶、木聚糖酶、濾紙酶、淀粉酶活性的變化,為開發(fā)富硒平菇和工廠化富硒栽培提供最直接的數(shù)據(jù)。

富硒食用菌產(chǎn)品開發(fā)的關(guān)鍵在于控制金屬元素含量。適量的金屬離子對提高食用菌產(chǎn)量、改善食用菌品質(zhì)、開發(fā)新的食用菌產(chǎn)品、推動(dòng)食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展,都具有積極意義,但金屬元素的過度使用,又會(huì)抑制食用菌的生長,甚至造成食用菌的重金屬污染,對人體健康產(chǎn)生潛在危害。該研究通過向秸稈基質(zhì)中添加不同濃度的硒,研究硒對平菇生長和胞外酶分泌的影響,發(fā)現(xiàn)硒能夠促進(jìn)平菇菌絲生長、縮短出菇時(shí)間。不同質(zhì)量濃度硒對平菇分泌的同種胞外酶,其活性在各生長發(fā)育階段不同,但不影響平菇胞外酶活性的變化趨勢。不同質(zhì)量濃度硒對平菇胞外酶活性有較大影響,該研究中添加的300 mg/kg 硒,有效促進(jìn)了平菇胞外酶的分泌,促進(jìn)了平菇菌絲生長,縮短了平菇生產(chǎn)周期,對平菇的富硒栽培具有一定的指導(dǎo)意義。