基于生物阻抗譜的生物細胞活性免標記檢測方法*

徐愷杰 葉 霞** 丁 力 胡松佩 姚佳烽

（1）江蘇理工學院機械工程學院，常州 213001；2）南京航空航天大學機電學院，南京 210016）

隨著現(xiàn)代生物醫(yī)學的發(fā)展，當前醫(yī)療檢測方法已經(jīng)進入細胞層面［1］。其中，細胞活性檢測在毒理學研究［2］、藥物篩選［3］、病理學［4］、腫瘤放射敏感性［5-6］等方面應用廣泛。在腫瘤細胞的研究中，為了測試藥劑對腫瘤細胞和良性細胞的靶向性和破壞性，需要時常測定惡性細胞的存活狀態(tài)及良性細胞的完整度以判斷其活性是否下降。在各類細胞培養(yǎng)過程中要隨時記錄細胞的生長狀況，也需要確定細胞的存活率。研究如何檢測細胞活性在生命科學中具有重要的研究意義及應用前景。

目前，臨床上已經(jīng)有成熟的細胞活性檢測方法。臺盼藍染色排除法（trypan blue dye exclusion，TBDE）［7］操作簡單，可以快速有效地對活性細胞和死亡細胞進行定量，但需要特定溶液間接觀察，且部分凋亡細胞有臺盼藍拒染現(xiàn)象；流式細胞術（flow cytometry，F(xiàn)CM）［8］具有速度快，能同時測試多個單位等優(yōu)點，但由于細胞在前期需要熒光標記，會在一定程度上影響細胞活性；MTT 比色分析法［9］能有效地避免由于人為操作而造成的實驗誤差，極大提高實驗結(jié)果的準確性和重現(xiàn)性，但不適合用于懸浮細胞，且測量前需要進行細胞移植和培養(yǎng)；李國曉［10］利用標量衍射理論研究出了細胞在不同狀態(tài)下的衍射指紋特征，并以此實現(xiàn)區(qū)分細胞活性的方法。這些技術雖然可以有效地區(qū)分細胞活性，但在實際操作中都會一定程度上影響被測細胞的活性。再者，這些技術需要依靠經(jīng)驗豐富的操作人員在實驗室中使用特定的試劑檢測，所以具有一定的局限性。為了進一步優(yōu)化細胞活性在醫(yī)學檢測方面的應用，醫(yī)學上亟需一種高效、免標記且適用于一般環(huán)境下的全新實時檢測方法。

生 物 阻 抗 譜 （bioelectrical impedance spectroscopy，BIS）技術是對生物組織注入安全、多頻、復阻抗的激勵電流，以此為基礎來檢測生理參數(shù)的技術［11-12］。此技術是利用多對電極向被測細胞加以微小幅值的正弦電壓或電流，以掃頻的方式從低頻到高頻來采集生物組織在各個頻率分量下的阻抗信息，再通過提取其中有效響應信號定性分析生物組織內(nèi)部的電學特性。由于介電測量具有非入侵的原位測量特點，并且生物體系服從介電增量和生物量之間存在相關性原理，從而可以獲得諸如細胞量的變化、細胞膜的狀態(tài)等豐富的生理化學信息。姚佳烽等［13］采用數(shù)值仿真的方法對單細胞進行電學特性與其結(jié)構之間的關系進行了研究，根據(jù)細胞的生理特征建立了不同種類的細胞電學模型。尹鴻潤等［14］提出一種檢測生物組織的成像方法，將目標區(qū)域可視化并精確判別種類。Sande 等［15］分析患者體液管理中的情況，使用BIS輔助調(diào)整血液透析患者的凈體重以改善高血壓。

近幾年的研究表明，BIS在檢測燙傷程度方面有了新的進展。如Edwick等［16］等使用BIS技術來評估燒傷后患者手部的水腫情況，從醫(yī)學角度評價了BIS技術作為衡量手燒傷后水腫的可靠性和有效性。其成果顯示，BIS檢測結(jié)果與水置換容量測定法的一致性較高，是衡量急性手燒傷后水腫的敏感可靠指標。此外，BIS是利用生物組織的電阻抗特性來獲取相對應的病理信息，死亡細胞相較于活性細胞有諸多特性［17］，會產(chǎn)生與活性細胞不同的響應信號。因此使用BIS技術可以有效地檢測生物細胞中的活性和死亡部分，從中提取出兩種細胞的相異電學信息來區(qū)分細胞的狀態(tài)。

局限于當前實驗條件和技術手段，本文擬引入與人類基因相似度高達87%的斑馬魚胚胎干細胞代替人體燙傷組織，用以研究人體細胞的介電特性［18］。并使用便攜式無線電阻抗譜檢測設備對各類活性細胞懸浮液、死亡細胞懸浮液和混合細胞懸浮液進行掃頻檢測，比較各類懸浮液之間的電學特性。

1 實驗設備及方法

1.1 實驗設備

本文使用了由斑馬魚胚胎干細胞制成的不同濃度的懸浮液作為實驗對象并搭建了實驗平臺（圖1a）。實驗平臺包括1臺計算機、1臺便攜式無線電阻抗譜檢測設備（PW-EIS）、1個四電極傳感器及1個帶有屏蔽裝置的自制比色皿。

圖1b 為自制比色皿結(jié)構圖。其底部含有兩對鍍金電極組成的印制電路板為測量傳感器，兩兩電極之間的間距為wc=3 mm，每個電極的感測面積為A=1.8 mm2。比色皿長度dc=10 mm，高度hc=20 mm，單次測量可容納的細胞懸浮液體積V=2 ml。在測試中將傳感器放置于含有屏蔽裝置的比色皿中進行測量，可以隔離周圍環(huán)境的電磁干擾，有效減少誤差，為降低數(shù)據(jù)采集過程中的接觸阻抗，本文選用四電極法，并在實驗前，使用無水乙醇擦拭電極表面，消除輕度氧化層。傳感器的4個鍍金電極通過4 條屏蔽線連接到PW-EIS 上，PW-EIS 捕獲探頭發(fā)出的信號后，將測量數(shù)據(jù)傳輸給PC 機進行后續(xù)的處理。

圖2為激勵區(qū)域下胚胎干細胞在傳感器中的電場和電場線分布。在COMSOL 仿真模擬研究中表明，最大頻率為1 MHz 下，電極位于底部時所產(chǎn)生的電場線能流經(jīng)胚胎干細胞，并且完全穿透，進一步驗證了數(shù)據(jù)采集的有效性和可靠性。

Fig.2 Electric field and electric field line distribution of embryo tissue at positions of the sensor under excitation areas

1.2 臺盼藍染色篩選

為了在實驗前判別所使用的斑馬魚胚胎是否具有活性，本文選用臺盼藍染色排除法來剔除已喪失活性的胚胎。正?；钚耘咛ゼ毎哂型暾募毎そY(jié)構，能夠排斥臺盼藍，使胚胎不被染色；死亡的胚胎其細胞膜結(jié)構被破壞、胞膜不完整、通透性增加，可使臺盼藍滲入將胚胎細胞染成藍色。因此，借助臺盼藍染色法可以快速地區(qū)分活性胚胎細胞和死亡胚胎細胞。如圖3 所示，使用濃度為0.4%的臺盼藍染色液與細胞懸浮液以1∶9 比例混合均勻（最終濃度為0.04%）并靜置5 min。完成染色后使用滴管將胚胎取出并放置于蓋玻片上使用光學顯微鏡（PRIMOTECH型）觀察。

活性胚胎能夠清晰地看到胚胎內(nèi)的組織（圖4）。因為活性胚胎的細胞膜完整，能夠排斥臺盼藍染料，使其不進入細胞內(nèi)，而喪失活性的細胞因細胞膜被破壞，不再完整則可被染成藍色。經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，所有被染色的胚胎外表都具有乳白色斑點。后續(xù)研究表明［19］，胚胎外表呈現(xiàn)透明狀為完成受精且具有活性，外表出現(xiàn)白色斑點則為喪失活性或未受精胚胎。下文所使用的均為外表呈現(xiàn)透明且完整的活性胚胎。

Fig.4 Embryo images

1.3 細胞懸浮液制備

為了比較活性胚胎干細胞與死亡胚胎干細胞在交流頻率范圍內(nèi)的電學特性，參照文獻［20］制備不同體積百分濃度的生物細胞懸浮液，以獲得胚胎干細胞在交流頻率范圍內(nèi)的阻抗數(shù)據(jù)。其制備過程如下：選取一批篩選后的活性斑馬魚胚胎干細胞放置于兩個含有磷酸緩沖溶液（PBS）的培養(yǎng)皿中。選取其中一個培養(yǎng)皿放置于數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-4J）中，經(jīng)56℃水浴40 min 后，可獲得已完全滅活的細胞懸浮液。將制備后的細胞懸浮液放置于一旁，靜置其至室溫后便可用于實驗測試。

1.4 實驗過程

準備一個自制比色皿，使用滴管將兩個培養(yǎng)皿中的胚胎取出，以不同比例放入比色皿中待檢測，并往比色皿中加入一定量的生理鹽水以保證掃頻電流能完全通過所有細胞。為進一步減小電極與被測組織的接觸電阻，同時減少電極與細胞組織電解液之間的極化，使用四電級法［21］測量細胞的阻抗譜。使用幅值為I=1 mA，掃頻范圍為1~106Hz 的交流電對細胞進行激勵，并檢測其兩端的電位信號。對細胞懸浮液進行掃頻，每次數(shù)據(jù)采集3 組。本組實驗完成后清洗比色皿，再更換不同體積百分濃度的細胞懸浮液進行上述操作。對每組3次采集的數(shù)據(jù)取平均值，再進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 BIS檢測結(jié)果分析

圖5a，b 給出了在1~106Hz 頻率范圍下，不同體積百分濃度下的活性胚胎干細胞懸浮液和死亡細胞懸浮液的幅值頻譜?？梢钥闯?，對于兩類不同體積百分濃度的懸浮液，其阻抗幅值的變化趨勢在整體上都是一致的，但是在相同的頻點上，其阻抗幅值大小不同。細胞懸浮液的阻抗幅值都是隨著頻率的增加而降低，具有活性細胞的懸浮液其阻抗值比滅活后的阻抗值平均高出17.25%。從前半段趨于平穩(wěn)的部分中可以看出活性細胞懸浮液的阻抗幅值相較于滅活細胞懸浮液更具波動性，這是由于滅活胚胎細胞的細胞外膜在加熱過程中受損，進而喪失高電容性。對于5%~20%體積百分濃度的活性胚胎細胞懸浮液，在0~45.25 kHz 的頻率范圍內(nèi)阻抗幅值略微下降1.12%，總體下降趨勢趨于穩(wěn)定。隨著頻率的增加，當頻率達到45.25 kHz 時，阻抗幅值大幅下降。與活性細胞懸浮液相比，體積百分濃度為5%~20%的滅活細胞懸浮液頻率達到61.08 kHz后，才會發(fā)生阻抗幅值大幅下降的趨勢。圖5c，d為弛豫頻率下細胞懸浮液的濃度-幅值擬合圖；在同一類狀態(tài)下，不同體積百分濃度對弛豫頻率的產(chǎn)生影響很小，且不同濃度下的阻抗值有明顯的規(guī)律，以此結(jié)論擬合函數(shù)，可以判斷兩類懸浮液弛豫狀態(tài)下的濃度。

Fig.5 Amplitude spectroscopy of suspension

隨著BIS的深入研究，學者們建立了各種等效模型和電路理論來分析多頻電阻抗數(shù)據(jù)。這些模型都將被測的細胞組織視為含有電阻和電容的電路。在本文中BIS 的參數(shù)映射將使用科爾模型（Cole Model）其電路的數(shù)學方程如下：

其中，Y是全導納，G是電導，j為虛數(shù)單位，B是電納。G0是零驅(qū)動頻率下的導納，G∞是驅(qū)動無限大時的導納，fyc是導納虛部達到最大值時的頻率，jf是驅(qū)動頻率，α是色散參數(shù)。

阻抗幅值在低頻區(qū)受細胞外環(huán)境影響，高頻區(qū)受細胞內(nèi)結(jié)構影響。在低頻段時，細胞組織中的阻抗成分中，主導成分為容抗。當施加給細胞懸浮液的外電場頻率較低時，由于細胞膜的高電阻性、高容抗性，在低頻時導電性差，電流難以穿過細胞，必須繞過細胞并穿過細胞外區(qū)域，此時的等效電路可視為開路，所以阻抗幅值較高；另一方面，隨著頻率的逐漸升高，由于胚胎干細胞膜的電容性質(zhì)，高頻電流能夠穿透細胞膜和細胞結(jié)構中的其他電子屏障。電流穿過細胞外液，電阻抗和細胞膜容抗緩慢降低，阻抗幅值就會隨之緩慢下降。當頻率達到一定的幅值時，細胞會逐漸處于導通狀態(tài)，此時電流可以完全通過細胞，這時與之對應的阻抗幅值隨之快速降低，阻抗幅值的變化也反應了細胞的電容性特點。同時，從圖5a，b中可以明顯看出，兩種細胞懸浮液的濃度越高，在同頻率下，其阻抗幅值越低，在0~45.25 kHz 時，阻抗幅值小幅減少，直到頻率達到45.25 kHz之后，阻抗幅值大幅下降。

細胞是構成生物的基本單元，單個細胞由細胞質(zhì)和細胞膜及細胞液構成，并分散在組織液中，而細胞膜由低電導率的磷脂雙層和蛋白質(zhì)離子組成，因此細胞膜可以等效為電容。根據(jù)Hanai細胞模型可以把胚胎干細胞有效地區(qū)分為3 個部分：細胞質(zhì)、細胞膜、細胞壁，這3個部分造成了與頻率相關的不同形式的細胞電學特性。圖6為細胞懸浮液的等效電路圖，對應細胞的生理結(jié)構。細胞質(zhì)和溶液由蛋白質(zhì)、無機鹽和水組成，這些成分都具有抗性。通常將細胞膜的等效電容和細胞質(zhì)的等效電阻串聯(lián)起來，再與細胞外液的等效電阻并聯(lián)起來，最終組合成細胞懸浮液的等效電路圖。圖中Rdl和Cdl分別是雙電層的電阻和電容，Cm是細胞膜的電容，Rcy是細胞質(zhì)的電阻，Rs是組織液（細胞外液）的電阻?？紤]到實際測量過程中，界面極化對細胞檢測結(jié)果的影響，引入界面極化電阻和界面極化電容。參照細胞懸浮液的等效電路圖，建立了等效電路的阻抗-頻率響應函數(shù)模型：

Fig.6 Equivalent circuit diagram of suspension

等效電路中出現(xiàn)的細胞膜電容和雙電層電容使得細胞懸浮液的阻抗下降趨勢趨于平緩，而頻率達到45 kHz 后，抗幅值快速減小，這意味著此時的頻率就是細胞懸浮液的弛豫頻率，可以用科特模型的弛豫參數(shù)模型來表示，其數(shù)學公式如下：

式中，εh是介電常數(shù)的高頻極限值，Δεn是介電增量，ε1是介電常數(shù)的低頻值，τn是弛豫時間，kl是低頻電導率，fn是特征頻率，j是虛數(shù)單位，ω是外加電場的角頻率，βn是科特參數(shù)，ε0是真空介電常數(shù)。

2.2 細胞懸浮液的特性分析

為了探究和分析在同等體積百分濃度下多種細胞活性程度是否會對懸浮液的弛豫頻率和虛部阻抗值產(chǎn)生影響。通過實驗獲得了4類不同體積百分濃度的混合懸浮液在變頻條件下虛部阻抗幅值的變化趨勢，并與同體積百分濃度下的純活性和純滅活細胞懸浮液進行對比。

從圖7整體來看，同等體積百分濃度下各個細胞懸浮液的阻抗幅值都是隨著頻率的增加而上升，直到某一時刻頻率達到了弛豫時間，阻抗幅值的趨勢才發(fā)生了轉(zhuǎn)變，開始下降。這是因為在同等體積百分濃度下，純活性懸浮液中細胞完整度高，細胞膜具有較高的阻抗特性。其中，純活性細胞懸浮液的阻抗幅值整體來看大于另外兩種細胞懸浮液。如表1 所列，其弛豫頻率發(fā)生的時間早于另外兩類，隨著濃度的增加，同類懸浮液之間的阻抗幅值也相繼減小，而混合濃度細胞懸浮液的阻抗幅值在3類中整體來看是最小的。另外，從表1 中可以看出，相較于混合濃度懸浮液，純滅活細胞懸浮液的弛豫頻率雖然先產(chǎn)生，但兩者弛豫頻率的間隔相差很小只有4.18%~4.73%。圖8 為斑馬魚胚胎干細胞懸浮液、雄豬生殖細胞懸浮液、酵母菌細胞懸浮液在不同濃度時頻率和虛部阻抗幅值的離散度。對于3種細胞懸浮液，在弛豫頻率下可以清楚的區(qū)分為兩大類聚類區(qū)域。聚類分析表明純活性細胞懸浮液可以與純滅活和混合懸浮液相區(qū)分，從而鑒別懸浮液中是否具有死亡細胞，進一步驗證BIS技術可以為醫(yī)學檢測細胞活性方面提供有效幫助。

Fig.7 Electrical impedance imaginary part of cell suspension

Table 1 Relaxation point parameters for three types of cell suspensions

Fig.8 Dispersion of magnitude versus phase of cell suspension

3 結(jié) 論

本文根據(jù)臺盼藍染色排除法篩選出的斑馬魚胚胎制成斑馬魚胚胎干細胞懸浮液，采用BIS方法對各類不同濃度、不同活性的干細胞懸浮液進行了電學特性研究，比較發(fā)現(xiàn)干細胞懸浮液的阻抗幅值在各類不同狀態(tài)下有較為明顯的差異。在同等濃度下，活性細胞的阻抗幅值大于死亡細胞17.25%，在頻率為45.25 kHz 時，活性細胞達到了弛豫，且其弛豫時間早于死亡細胞25%。

本文研究方法無需樣品預處理，操作簡單，可以通過PW-EIS 直接進行檢測。在研究了各類不同狀態(tài)的細胞懸浮液，了解了細胞懸浮液在電學特性方面存在的差異后，可以通過弛豫時間、頻率和阻抗，采用BIS技術來區(qū)分和辨別生物細胞組織的存活狀態(tài)，并為后續(xù)研究生物細胞的準確濃度和活性奠定了基礎。