趨化因子CCL11-糖胺聚糖-趨化因子受體CCR3的相互作用研究*

李冠霖 劉恒姮 丁彥之 李計強(qiáng) 葛保勝

（中國石油大學(xué)（華東）化學(xué)工程學(xué)院生物工程與技術(shù)中心，重質(zhì)油國家重點(diǎn)實(shí)驗室，青島 266580）

趨化因子是一種能夠誘使免疫細(xì)胞產(chǎn)生趨化作用的細(xì)胞因子總稱，其通過與相對應(yīng)趨化因子受體及內(nèi)皮細(xì)胞表面的糖胺聚糖（glycosaminoglycans，GAGs）相互作用行使生物學(xué)功能，在細(xì)胞發(fā)育、腫瘤發(fā)生、血管生成、炎癥反應(yīng)、傷口修復(fù)和神經(jīng)再生等［1］重要細(xì)胞生理過程中發(fā)揮著重要作用。許多疾病的發(fā)生都與趨化因子及其受體的表達(dá)或調(diào)控異常相關(guān)［2］，因此，趨化因子及其受體多年來一直是疾病治療和藥物設(shè)計的重要作用靶點(diǎn)。

據(jù)報道，大多數(shù)趨化因子及其受體均有形成二聚體或寡聚體的傾向［3］。然而，文獻(xiàn)同時證實(shí)，趨化因子單體是對其受體具有最高親和力和促進(jìn)細(xì)胞遷移的形式［4］。那么趨化因子寡聚的目的是什么？為了探究趨化因子寡聚的生理學(xué)意義，Proudfoot 等［4］設(shè) 計 了 趨 化 因 子 單 體 突 變 體（RANTES （CCL5）、MCP-1 （CCL2） 和MIP-1b（CCL4）），并研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞遷移需要趨化因子寡聚。同樣，GAGs結(jié)合缺陷突變體研究表明，趨化因子在體內(nèi)行使功能也需要與GAGs結(jié)合［5］，這提示趨化因子可以在GAGs 鏈上聚集并發(fā)揮作用［6］。在細(xì)胞遷移過程中，趨化因子通過在GAGs 上聚集，使其形成濃度梯度，提供牽引趨化細(xì)胞所需的親和力，特別是存在血流剪切力的情況下［7-8］。然而，Joseph 等［9］提出，只有游離趨化因子以及延伸的趨化梯度，才能驅(qū)動中性粒細(xì)胞從循環(huán)到組織的運(yùn)輸，GAGs 結(jié)合趨化因子不能激活受體。并且，CC 型趨化因子二聚體中，對受體激活至關(guān)重要的殘基被埋入二聚體內(nèi)部，且二聚體結(jié)構(gòu)與受體結(jié)合空間不相容，因此，CC 型趨化因子二聚體不能激活受體，誘導(dǎo)細(xì)胞遷移［10］。目前為止，對于趨化因子-糖胺聚糖GAG-G 蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptors，GPCR）受體三者之間的作用關(guān)系，以及趨化因子或其受體聚集在其中發(fā)揮的作用如何都還不清楚。探究闡明趨化因子、趨化因子受體及GAGs三者之間相互作用過程及機(jī)制對于深入理解趨化因子受體的激活及其發(fā)揮功能的作用機(jī)制具有重要意義。

趨化因子CCL11是Eotaxins家族的成員，最早發(fā)現(xiàn)于致敏豚鼠抗原刺激后的支氣管肺泡灌溉液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中，CCL11與其受體CCR3 的結(jié)合［11］會觸發(fā)一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件，包括細(xì)胞骨架重排、蛋白激酶C的激活以及受體的長期內(nèi)化等［12］。CCL11 及CCR3 被認(rèn)為是抗哮喘藥物的可能靶點(diǎn)，在變應(yīng)性和非變應(yīng)性的炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用［13-14］，此外，CCL11 還參與局部缺血誘導(dǎo)的血管壁重塑，在許多疾病中起著潛在的作用。細(xì)胞表面最普遍的GAGs是硫酸乙酰肝 素（heparan sulfate， HS） 與 硫 酸 軟 骨 素（chondroitin sulfate，CS）。CS 以蛋白聚糖側(cè)鏈的形式廣泛存在于各種細(xì)胞間基質(zhì)及細(xì)胞表面中［15］，在多種生化反應(yīng)中起到極為重要的作用。例如，參與神經(jīng)系統(tǒng)的生長、胞質(zhì)分離、病毒黏附、形態(tài)形成、生長因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等［16］。Culley等［17］研究發(fā)現(xiàn)，GAGs（如肝素）會抑制嗜酸性粒細(xì)胞對CCL11的趨化反應(yīng)以及抑制細(xì)胞內(nèi)的鈣通量，同時抑制CCL11與CCR3的結(jié)合。趨化因子也可以與可溶性GAG 或細(xì)胞表面受體形成復(fù)合物，該可溶性GAG-趨化因子復(fù)合物無法再與趨化因子受體結(jié)合，導(dǎo)致生物活性被阻斷［18］。Culley等［17］研究證明硫酸乙酰肝素可在體外抑制趨化因子誘導(dǎo)的嗜酸性粒細(xì)胞活化。

本文以CCL11-GAGs-CCR3為研究體系，構(gòu)建了單分子表達(dá)水平的CCR3-EGFP 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，選擇3 種GAGs（硫酸軟骨素1~3，鏈長依次增加），利用全內(nèi)反射熒光成像（total internal reflection fluorescence，TIRF）、等溫滴定量熱（isothermal titration calorimetry，ITC）和細(xì)胞趨化等技術(shù)探究GAGs與CCL11的相互作用，以及GAGs-CCL11對CCR3-EGFP 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞趨化行為的調(diào)控及CCR3-EGFP 在細(xì)胞膜上聚集狀態(tài)的影響，以期為闡明CCL11-GAGs-CCR3三者之間的作用關(guān)系及相關(guān)藥物的設(shè)計和疾病治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

中國倉鼠卵巢細(xì)胞（Chinese hamster ovary cell，CHO） 購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。CCL11-MKO 融合蛋白表達(dá)載體pET-28a-ccl11-MKO和CCR3-EGFP 表達(dá) 載體pcDNA3.1-ccr3-egfp質(zhì) 粒均由本實(shí)驗室構(gòu)建并保存；鼠抗anti-His單克隆抗體，HRP-labeled Goat Anti-Mouse lgG 購自上海生工公司；硫酸軟骨素1（0.5 ku）購自Aladdin 公司；硫酸軟骨素2（5~20 ku）購自Solarbio 公司；硫酸軟骨素3（50~100 ku）購自BBI 公司；兔抗CCR3 單克隆抗體購自Abcam公司；Amersham ECL顯色試劑盒購自GE healthcare （GE） 公司；Transwell Chambers趨化小室購自Corning公司；多聚甲醛購自源葉生物公司。

1.2 方法

1.2.1 利用ITC探究GAGs與CCL11的相互作用

使用Malvern公司Microcal ITC200儀器進(jìn)行等溫滴定量熱實(shí)驗。GAGs放置于滴定針內(nèi)，空白溶液和CCL11樣品溶液放置于樣品池內(nèi)。先用GAGs溶液滴定緩沖液作為空白對照，再使用不同分子質(zhì)量的硫酸軟骨素溶液滴定CCL11。其中樣品池中樣品為350 μl，進(jìn)樣器中樣品為100 μl。ITC 實(shí)驗過程中，參比池、樣品池及上樣針每次實(shí)驗使用前必須多次清洗干凈保證無其他雜質(zhì)，加樣時保證無氣泡，且所有樣品均用0.45 μm濾膜過濾，參比池中加入超純水。不同樣品濃度及配比的滴定實(shí)驗參數(shù)的設(shè)定如表1所示：

Table 1 Parameter settings in ITC experiment

1.2.2 單分子成像技術(shù)考察GAGs對CCL11-MKO聚集狀態(tài)的影響

將不同分子質(zhì)量大小的GAGs 與CCL11-MKO（C-C motif chemokine 11-monomeric Kusabira Orange，CCL11-MKO）（文檔S1）分別按照1∶1、10∶1、100∶1的比例進(jìn)行混合孵育，并稀釋至蛋白質(zhì)濃度為10-10mol/L，靜置20 min后，采用單分子pull-down 技術(shù)將樣品固定在組裝的潔凈樣品池中，使用532 nm 激光對樣品進(jìn)行激發(fā)，通過激發(fā)濾光片R532 nm 和發(fā)射濾光片582/75 nm 采集相應(yīng)波長范圍的信號。采用熒光猝滅階數(shù)分析技術(shù)［19］，考察不同GAG處理后CCL11-MKO的聚集變化。

1.2.3 細(xì)胞趨化實(shí)驗

將實(shí)驗室前期構(gòu)建好的CCR3-EGFP 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞復(fù)蘇后懸浮于含有0.5% 胎牛血清（FBS） 的DMEM 培養(yǎng)基中，分別取100 μl（1×106/ml）接種于Transwell Chambers 上層小室，對應(yīng)下層小室分別添加500 μl含0.5% FBS的DMEM培養(yǎng)基及終濃度為50 nmol/L 的CCL11 與CCL11-MKO，于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育5 h。趨化結(jié)束后用多聚甲醛室溫固定15 min，上室膜晾干后加入終濃度為0.1%結(jié)晶紫，室溫染色20 min，蒸餾水漂洗3次，用棉簽將上室頂層細(xì)胞擦掉，在顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，每組設(shè)3次平行試驗。

1.2.4 CCL11-GAG作用下CCR3-EGFP的活細(xì)胞單分子成像

將所構(gòu)建的穩(wěn)定表達(dá)CCR3-EGFP 的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株均勻接種至細(xì)胞培養(yǎng)皿（2 cm）中，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%左右時，吸出培養(yǎng)基，加入摩爾比為1∶1、10∶1、100∶1 的硫酸軟骨素3 與CCL11 混合溶液（CCL11 終濃度均為1 000 nmol/L），4℃孵育15 min，吸出培養(yǎng)基并用0.22 μm 無菌濾膜過濾處理的1×PBS 輕輕漂洗3 遍，加入150 μl DMEM無酚紅培養(yǎng)基，利用TIRF 技術(shù)進(jìn)行單分子成像，將成像結(jié)果用ImageJ處理，并用Matlab進(jìn)行分析。對每一幀熒光點(diǎn)的熒光強(qiáng)度進(jìn)行統(tǒng)計，取所選點(diǎn)前3 幀的平均熒光強(qiáng)度，得到強(qiáng)度分布圖用Origin 進(jìn)行高斯擬合［20-21］，考察不同CCL11-GAG復(fù)合體對CCR3-EGFP在活細(xì)胞膜上聚集作用的影響。

2 結(jié) 果

2.1 利用ITC研究GAGs與CCL11相互作用

研究表明，趨化因子-GAGs 的相互作用對于CCL11 介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)具有重要影響，缺乏寡聚能力或與GAGs結(jié)合能力的趨化因子突變體在體內(nèi)無法行使正常功能［22］，故趨化因子寡聚及趨化因子與GAGs 相互作用可能是偶聯(lián)的。本文利用ITC技術(shù)研究了CCL11與GAGs的相互作用。不同長度的硫酸軟骨素可與CCL11結(jié)合，硫酸軟骨素1號由于分子質(zhì)量較小，分子鏈較短，其與CCL11 可以看出有明顯相互作用，但由于滴定放熱過少，數(shù)據(jù)無法有效擬合（圖1）。通過Origin軟件對其他兩種GAGs與CCL11溶液的滴定數(shù)據(jù)擬合后得到各項熱力學(xué)常數(shù)（表2）。分析實(shí)驗結(jié)果可知，隨著硫酸軟骨素鏈長的增加，結(jié)合放熱增加，表明其相互作用增強(qiáng)，硫酸軟骨素與CCL11 的結(jié)合常數(shù)（Ka）由2.15×106±4.66×105增大至3.72×107±7.48×106。經(jīng)計算，硫酸軟骨素2 與CCL11 的結(jié)合比為1∶1，即平均約1 個硫酸軟骨素結(jié)合1 個CCL11，硫酸軟骨素3 則逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)? 個硫酸軟骨素結(jié)合約16 個CCL11。

Fig.1 Interaction analysis of chondroitin sulfate with CCL11 using ITC technique

Table 2 The fitting data of interactions between Chondroitin sulfate and CCL11

2.2 不同GAGs對CCL11-MKO體外聚集狀態(tài)的影響

為了進(jìn)一步探究不同GAGs對CCL11體外聚集狀態(tài)的影響，利用單分子熒光TIRF 成像技術(shù)（圖2a，b），研究了不同GAGs 對CCL11-MKO 聚集狀態(tài)的影響。圖2c 為pH=7、20 mmol/L NaCl 條件下的熒光強(qiáng)度擬合結(jié)果，從圖中可以得出pH=7 時，溶液中CCL11-MKO 單體比例約為73%（P<0.01），寡聚體約為27%（P<0.05），說明在pH=7 情況下CCL11-MKO主要以單體形式存在，也存在部分二聚體形式。同時采用熒光階數(shù)漂白分析技術(shù)進(jìn)一步驗證該方法的可靠性（圖2d），熒光強(qiáng)度125 時約為一階漂白，即表示CCL11單體，熒光強(qiáng)度160時約為二階漂白，表示此時CCL11 為二聚體。同樣可以證實(shí)，大部分的CCL11-MKO熒光顆粒以單體形式存在且熒光強(qiáng)度在110~140之間，單體比例約占73%。

將GAGs 與CCL11-MKO 混合孵育后進(jìn)行單分子成像，并根據(jù)其熒光強(qiáng)度擬合及熒光漂白階數(shù)分析對其聚集狀態(tài)進(jìn)行統(tǒng)計（圖2e）。隨著硫酸軟骨素1 比例的增加，其顯示出對CCL11-MKO 的聚集有少量的促進(jìn)作用。而硫酸軟骨素2在物質(zhì)的量比例為1∶1 和10∶1 時，隨著比例的增加，其對CCL11-MKO 的聚集有著顯著促進(jìn)作用。CCL11-MKO 的寡聚體量在GAGs 與CCL11-MKO 摩爾比為10∶1時達(dá)到了48%。但令人意外的是，硫酸軟骨素2 在GAGs 與CCL11-MKO 比例達(dá)到100∶1時，CCL11-MKO聚集狀態(tài)反而有所降低，說明隨著硫酸軟骨素2號比例的增加，過多的硫酸軟骨素競爭結(jié)合CCL11-MKO，反而不利于CCL11-MKO聚集體的形成。同樣，硫酸軟骨素3 號在1∶1 時，CCL11-MKO 聚集體就達(dá)到了最大值，隨著GAGs與CCL11-MKO 比例增加，CCL11-MKO 聚集體反而降低。這表明，隨著GAGs 鏈的加長，GAGs 與CCL11的相互作用增強(qiáng)，傾向于形成GAGs-CCL11復(fù)合物，同時對CCL11 聚集體的形成有一定促進(jìn)作用，所以推測，在體內(nèi)血液流動的條件下，長鏈GAGs對CCL11在內(nèi)皮細(xì)胞表面特定部位的停留貢獻(xiàn)更高。

Fig.2 Total internal reflection fluorescence imaging and aggregation analysis of CCL11-MKO

2.3 GAGs-CCL11聚集體對CCR3-EGFP穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞趨化作用的影響

CCL11 對CCR3 表達(dá)細(xì)胞具有典型的趨化作用，為探究GAGs-CCL11形成的復(fù)合體與CCR3的相互作用，本實(shí)驗室構(gòu)建了CCR3-EGFP 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞細(xì)胞系，并以此為基礎(chǔ)考察了CCL11-GAGs 聚集體對CCR3-EGFP 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞趨化作用的影響（圖3）。硫酸軟骨素3的加入會對CCL11誘導(dǎo)的趨化作用產(chǎn)生抑制。不同比例的硫酸軟骨素3與CCL11對CCR3-EGFP 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞趨化實(shí)驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，硫酸軟骨素3 加入比例為1∶1 時，CCL11 對CCR3-EGFP穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的趨化能力顯著降低，再增加GAGs-CCL11 比例，CCL11 的趨化能力再沒有出現(xiàn)顯著變化，提示該比例下，已基本實(shí)現(xiàn)了對CCR3-EGFP穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞趨化的最大抑制能力。針對不同分子質(zhì)量大小的GAGs實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，在加入比例為1∶1條件下，隨著硫酸軟骨素鏈長的增加，趨化抑制現(xiàn)象逐漸增強(qiáng)，由硫酸軟骨素1 的10%左右的抑制率，增強(qiáng)到硫酸軟骨素3的60%左右。結(jié)合上述單分子實(shí)驗分析結(jié)果分析，這提示硫酸軟骨素的添加促進(jìn)了CCL11 的聚集，導(dǎo)致趨化因子對受體激活至關(guān)重要的殘基不再暴露，從而抑制了CCL11 對CCR3-EGFP穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的趨化作用。

Fig.3 Chemotaxis analysis of CCL11 on CCR3-EGFP stable transfected cells

2.4 GAGs-CCL11對活細(xì)胞膜上CCR3-EGFP聚集狀態(tài)的影響

為探究GAGs-CCL11 復(fù)合物對活細(xì)胞膜上趨化因子受體CCR3聚集狀態(tài)的影響，首先分析所構(gòu)建的CCR3-EGFP 是否適合單分子成像。將所構(gòu)建的CCR3-EGFP 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株接種至底部透明培養(yǎng)皿中，進(jìn)行TIRF 單分子成像（圖4a）。CCR3-EGFP穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞輪廓清晰，CCR3-EGFP 熒光斑點(diǎn)均勻分散在細(xì)胞膜表面。利用ImageJ 軟件提取每個點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，并取前3幀圖片中每個熒光點(diǎn)強(qiáng)度的平均值，利用Origin軟件做出熒光強(qiáng)度分布圖并進(jìn)行高斯擬合。通過高斯擬合峰的數(shù)量和峰值之間的關(guān)系可以推斷CCR3-EGFP 熒光顆粒的聚集狀態(tài)（圖4b），同時結(jié)合熒光強(qiáng)度與階數(shù)漂白對應(yīng)關(guān)系（圖4c）進(jìn)行統(tǒng)計分析。經(jīng)統(tǒng)計337 個CCR3-EGFP 顆粒分析可知，大部分CCR3-EGFP 熒光顆粒以單體形式存在且熒光強(qiáng)度在25~55之間，單體約占83%（P<0.01）。這表明所構(gòu)建篩選的CCR3-EGFP 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株適合于進(jìn)一步的細(xì)胞膜上單分子成像分析。

Fig.4 Aggregation state statistics of CCR3-EGFP on CHO cell membrane

為探究CCL11-GAGs 對CCR3-EGFP 聚集狀態(tài)的影響，將GAGs 與CCL11 共同孵育后作用于CCR3-EGFP穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，通過TIRF進(jìn)行單分子成像，對細(xì)胞膜上CCR3-EGFP 聚集狀態(tài)進(jìn)行統(tǒng)計。CCL11 與硫酸軟骨素3 共同作用時CCR3-EGFP 在細(xì)胞膜上聚集狀態(tài)統(tǒng)計結(jié)果（圖5a，b）為：單獨(dú)加入CCL11 時，CCR3-EGFP 在細(xì)胞膜上的聚集狀態(tài)約在33%左右。隨著硫酸軟骨素3 的加入，CCR3-EGFP 的寡聚體降低，在硫酸軟骨素3 號與CCL11 為1∶1 時，CCR3-EGFP 在細(xì)胞膜上的聚集體由33%降為18%，后續(xù)增加硫酸軟骨素3 比例，對CCR3-EGFP在細(xì)胞膜上的聚集狀態(tài)影響不顯著。還考察了不同分子質(zhì)量大小GAGs與CCL11共同作用下（比例設(shè)為1∶1）CCR3-EGFP 聚集狀態(tài)進(jìn)行統(tǒng)計，圖5c 為結(jié)晶紫染色后趨化細(xì)胞成像，實(shí)驗結(jié)果表明：隨著硫酸軟骨素鏈長的增加，其對CCL11 引起的CCR3-EGFP 在細(xì)胞膜上聚集現(xiàn)象的抑制作用增強(qiáng)。綜合以上分析，硫酸軟骨素的加入，會在一定程度上促進(jìn)CCL11 的聚集，但該聚集受到GAGs長度等因素的影響。CCL11-GAGs復(fù)合體會抑制CCL11 誘導(dǎo)的細(xì)胞膜上CCR3-EGFP 的聚集，并對CCL11 誘導(dǎo)的細(xì)胞趨化作用產(chǎn)生負(fù)面影響。

Fig.5 Statistics of CCR3-EGFP aggregation status upon binding of GAGs-CCL11

3 討 論

趨化因子是能使免疫細(xì)胞發(fā)生趨化作用的細(xì)胞因子的總稱，其參與調(diào)節(jié)細(xì)胞在一系列發(fā)育、穩(wěn)態(tài)和炎癥過程中的遷移，并在介導(dǎo)白細(xì)胞黏附和細(xì)胞遷移中發(fā)揮關(guān)鍵作用［23-24］。趨化因子通常與免疫細(xì)胞表面的趨化因子受體及內(nèi)皮細(xì)胞表面的GAGs相互作用，從而牽引免疫細(xì)胞到達(dá)相應(yīng)的病灶部位并發(fā)揮作用。研究表明，趨化因子與GAGs的相互作用是其在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)功能必不可少的，二者之間的相互作用非常重要［25-26］。趨化因子CCL11 是參與嗜酸性粒細(xì)胞募集和介導(dǎo)哮喘相關(guān)組織損傷的主要趨化因子，其與受體CCR3相互作用能夠介導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞在寄生蟲感染和過敏反應(yīng)部位的遷移和積累，CCR3參與炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展過程，已經(jīng)被作為治療炎癥反應(yīng)相關(guān)疾病的重要治療靶點(diǎn)［27-28］。因此深入探究CCL11 與GAGs 及其受體CCR3的相互作用，有助于全面理解CCL11-GAGs-CCR3介導(dǎo)的相關(guān)疾病發(fā)病機(jī)理及其治療途徑。

本文首先利用ITC 及TIRF 技術(shù)探究了GAGs與CCL11 之間的相互作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同長度的GAGs均可以與CCL11體外結(jié)合。隨著硫酸軟骨素鏈長的增加，結(jié)合放熱增加，相互作用增強(qiáng)，由1個硫酸軟骨素結(jié)合1 個CCL11，逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)? 個硫酸軟骨素結(jié)合多個CCL11。同時單分子熒光成像實(shí)驗表明，隨著硫酸軟骨素鏈長的增加，其在一定程度上對CCL11-MKO聚集作用增強(qiáng)，但是聚集程度并不會隨著GAGs鏈長的增加線性提升，而是存在飽和效應(yīng)，這與Ellyard 等［29］報道結(jié)果一致：GAGs可以但并不一定顯著促進(jìn)CCL11聚集體的生成。因此，CCL11 在血流剪切力的情況下形成濃度梯度從而誘導(dǎo)并牽引CCR3細(xì)胞的關(guān)鍵因素，可能不是CCL11 聚集體的形成，可能是CCL11 單體與GAGs 相互作用的結(jié)果，且長鏈的GAGs 與CCL11 的相互作用更強(qiáng)，從而對CCL11 在特定位點(diǎn)的停留有更強(qiáng)的穩(wěn)定效應(yīng)。

趨化因子受體與趨化因子結(jié)合并被激活的過程可以調(diào)節(jié)多種生理作用，包括白細(xì)胞運(yùn)輸、增殖、分化和腫瘤轉(zhuǎn)移等。趨化因子受體CCR3屬于A類GPCRs，在過敏反應(yīng)和其他免疫介導(dǎo)的炎癥疾病中起關(guān)鍵作用。CCR3參與哮喘、關(guān)節(jié)炎以及特異性皮膚炎等過敏性炎癥的發(fā)展過程，同時也是HIV-1病毒感染人體免疫細(xì)胞的輔助受體［30］以及老年性黃斑病變的有效藥物靶點(diǎn)［31］。CCL11 與其受體CCR3相互作用能夠介導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞在寄生蟲感染和過敏反應(yīng)部位的遷移和積累，被認(rèn)為是抗哮喘藥物的可能靶點(diǎn)。本文通過考察CCL11-GAGs 共同作用下對CCR3-EGFP 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞趨化效應(yīng)的影響發(fā)現(xiàn)，GAGs 的加入會抑制CCL11 對CCR3-EGFP穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的趨化效應(yīng)，且隨著硫酸軟骨素鏈長的增加，抑制作用增強(qiáng)。此現(xiàn)象與GAGs與CCL11相互作用相符，隨著硫酸軟骨素鏈長增加，其與CCL11相互作用增強(qiáng)，使溶液中游離CCL11 減少，聚集體增多，趨化效應(yīng)相應(yīng)降低。

研究表明，趨化因子受體能夠發(fā)生自聚形成同源寡聚體，也可以與其他趨化因子受體結(jié)合形成異源寡聚體），或與其他的非趨化因子受體相互作用［32］，趨化因子受體寡聚體的形成對其功能具有諸多影響。CCR5 的同源聚集被認(rèn)為可以減少HIV感染，而CCL5 作為CCR5 的激動劑，可使受體CCR5二聚體更穩(wěn)定［33-34］。Hauser等［35］研究表明，CCR7二聚體和其他高階低聚物形成了一個穩(wěn)定復(fù)合體，能夠整合G蛋白和Src依賴的信號通路，從而有效地實(shí)現(xiàn)細(xì)胞遷移。趨化因子受體CXCR4 被認(rèn)為是通過形成二聚體以獲得適當(dāng)?shù)纳锘钚裕?6］。實(shí)驗室前期的研究及本實(shí)驗均發(fā)現(xiàn)，CCR3 以單體、二聚體和寡聚體的混合狀態(tài)存在于細(xì)胞膜上，CCR3 的寡聚體狀態(tài)可以由其結(jié)合配體CCL11 調(diào)節(jié)。同時活細(xì)胞單分子實(shí)驗表明，GAGs的加入會抑制CCL11 誘導(dǎo)的CCR3-EGFP 聚集效應(yīng)，隨著硫酸軟骨素長度的增加，抑制能力隨之增強(qiáng)。這與上述趨化實(shí)驗結(jié)果相符，隨著硫酸軟骨素鏈長的增加，其與CCL11 相互作用增強(qiáng)，在相同濃度下游離的CCL11 單體比例減少，從而大幅降低了對CCR3-EGFP聚集的誘導(dǎo)作用。

基于以上實(shí)驗結(jié)果推測，炎癥反應(yīng)釋放的趨化因子CCL11最初被細(xì)胞表面的GAGs所捕獲，通過CCL11與GAGs的相互作用，可以調(diào)控CCL11的聚集，從而保證趨化因子在血流剪切力存在的條件下能夠在某一個部位形成濃度梯度，并牽引白細(xì)胞逆趨化因子濃度梯度到達(dá)炎癥部位（圖6）。此外，GAGs 密度也較為關(guān)鍵，過高的GAGs 密度會導(dǎo)致趨化因子從GAGs 上解離下來后又再次與GAGs 結(jié)合，不易于趨化因子釋放到血液中。“云”模型［37-38］認(rèn)為，趨化因子可以被細(xì)胞表面的GAGs所捕獲，然后再以可溶性單體形式釋放并與白細(xì)胞上的受體結(jié)合，GAGs的主要作用是將趨化因子集中在某一位置，這些相互作用是動態(tài)的，趨化因子經(jīng)歷多輪結(jié)合、分離，再重新結(jié)合到GAGs上，形成一個趨化因子“云”［37］。趨化因子的可逆結(jié)合動力學(xué)將使它們在從GAGs鏈釋放時易于獲得，以便與白細(xì)胞上的受體相互作用，并且在“云”內(nèi)多次與GAG 再結(jié)合可防止它們因血液剪切力而擴(kuò)散。值得注意的是，體內(nèi)趨化因子CCL11-GAGs-CCR3相互作用機(jī)制將會是一個更為復(fù)雜的過程，該過程中還可能會有其他趨化因子、GAGs及趨化因子受體的聚集等因素參與，對該過程的深入研究以及該信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中下游cAMP、鈣流及受體磷酸化等系列級聯(lián)反應(yīng)的闡明，將為深入理解趨化因子-GAGs-趨化因子受體之間的相互作用關(guān)系及其作用機(jī)制提供重要的理論和實(shí)驗基礎(chǔ)（圖6）。

Fig.6 Schematic diagram of chemokine（CC）-GAGS-chemokine receptor interaction

4 結(jié) 論

本文利用基于TIRF 的單分子熒光技術(shù)及活細(xì)胞趨化實(shí)驗系統(tǒng)探究了三者之間的相互作用關(guān)系，主要發(fā)現(xiàn) GAGs 的類型及數(shù)量均對CCL11 聚集及其與CCR3 的相互作用產(chǎn)生重要影響，GAGs 可以通過調(diào)控CCL11的聚集程度，影響CCL11與CCR3的相互作用及其引起的細(xì)胞趨化作用，從而在炎癥發(fā)生過程中的細(xì)胞生理反應(yīng)起到重要的參與調(diào)控作用。

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