基于三通道的超分辨率顯微鏡成像

俞珠穎 吉 凡 郭京雨 魯統(tǒng)一 夏兆廈 張寧博 孫耀杰* 王 瑜*

（1）復(fù)旦大學(xué)信息科學(xué)與工程學(xué)院光源與照明工程系，上海 200433；2）寧波力顯智能科技有限公司，寧波 315000）

自2014 年超分辨率顯微成像技術(shù)榮獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)以來，該領(lǐng)域技術(shù)研發(fā)進(jìn)程快速發(fā)展，并且實(shí)現(xiàn)了大量的技術(shù)產(chǎn)業(yè)化。由于超分辨率顯微鏡將成像分辨率提升到20 nm［1］，可以提供更多的生物信息數(shù)據(jù)，不僅可以用于生命科學(xué)基本問題以及生物學(xué)過程的前沿研究，也可以在諸如納米給藥機(jī)制研究及納米藥物與核酸疫苗生產(chǎn)質(zhì)量控制等領(lǐng)域中發(fā)揮出重要的應(yīng)用價(jià)值。細(xì)胞內(nèi)生物大分子的觀測除了要提高分辨率外，還需要提高觀測數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，增加生物信息的提取量，因此通過多通道共定位成像也起到了一定的輔助作用。本文主要總結(jié)了超分辨率顯微鏡的發(fā)展歷程、基于分光成像技術(shù)的三通道顯微成像技術(shù)，以及將兩項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用到細(xì)胞和金納米粒子的成像，證明這兩項(xiàng)技術(shù)對生物大分子觀測效果具有質(zhì)的提升。

1 超分辨顯微鏡的發(fā)展

1873 年恩斯特阿貝爾（Ernst Abbe）提出了光學(xué)衍射極限準(zhǔn)則［2］，認(rèn)為能夠區(qū)分艾里斑的最小距離受可見光波長的影響。根據(jù)瑞利判斷，光學(xué)顯微鏡能夠分辨兩點(diǎn)間的最小距離，即光學(xué)顯微鏡的分辨極限為：

d表示分辨率，λ是發(fā)射光的波長，NA是物鏡數(shù)值孔徑。由于可見光波長的波長范圍在390~780 nm，NA代表的數(shù)值孔徑一般為1，根據(jù)介質(zhì)折射率的不同，可以達(dá)到更高［3］。在這些條件下，橫向分辨率達(dá)到的極限在200 nm 左右，軸向分辨率在500 nm 左右［4］?？梢阅：胤直娉黾?xì)胞的輪廓，但不能將分辨率提高到生物大分子的大小范圍內(nèi)，對細(xì)胞間生物大分子生命活動的研究造成了一定的阻礙。根據(jù)光學(xué)衍射極限，許多科研人員在減小照射光波長和增大物鏡的數(shù)值孔徑中下功夫，一直沒有太大的突破。

由于生物、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域?qū)ξ⒂^粒子觀測的需求，以及軸向分辨率遠(yuǎn)小于橫向分辨率的情況，1992 年，斯特凡·W·赫爾（Stefan W.Hell）［5］研發(fā)了4pi顯微鏡，基于干涉原理，采用兩個(gè)焦點(diǎn)一致的大孔徑物鏡進(jìn)行聚焦，分別放置在樣品前后，產(chǎn)生全空間立體角（圖1），整體分辨率均得到提高。

Fig.1 Schematic of a 4pi microscope圖1 4pi顯微鏡示意圖

橫向分辨率減小到100 nm 以內(nèi)，軸向分辨率提高4~7倍，從而實(shí)現(xiàn)超分辨率顯微成像。除此之外，斯特凡·W·赫爾還研發(fā)出了受激發(fā)射損耗顯微 術(shù)（stimulated emission depletion microscopy，STED）［6］。通過激發(fā)光和損耗光將熒光分子分別進(jìn)行激發(fā)和以受激發(fā)射的方式回到基態(tài)［7］，有效減小熒光分子激發(fā)的范圍，從而提高成像分辨率。該方法能夠?qū)M向成像分辨率提高到50 nm左右。

在STED顯微成像技術(shù)問世以后，該領(lǐng)域中的科研進(jìn)展有了突飛猛進(jìn)的勢頭，全球多項(xiàng)超分辨率顯微成像技術(shù)如雨后春筍般層出不窮，其中就有結(jié)構(gòu) 光 照 明 顯 微 鏡 （structured-illumination microscopy，SIM）［8］。SIM顯微成像技術(shù)是基于莫爾條紋的原理，在顯微成像的光路中插入產(chǎn)生結(jié)構(gòu)光的設(shè)備，通過調(diào)制照射光，形成拍攝圖像。將該圖像以旋轉(zhuǎn)、平移等多種設(shè)定方式掃描完整個(gè)視野，采用計(jì)算機(jī)及相應(yīng)算法，重構(gòu)出完整圖像［9］。

在對顯微鏡結(jié)構(gòu)和圖像成像原理上進(jìn)行成像分辨率突破外，威廉·E·莫納爾（William E.Moerner）觀察到了單個(gè)熒光分子，發(fā)現(xiàn)熒光分子能夠通過不同波長的激光呈現(xiàn)出亮態(tài)和暗態(tài)，為實(shí)現(xiàn)超分辨率顯微成像提供了新的思路［10］。埃里克·白茲格（Eric Betzig）在威廉·E·莫納爾（William E.Moerner）的研究基礎(chǔ)上，研發(fā)出了光敏定位顯微鏡（photoactivated localization microscopy，PALM）［11］。光激活熒光蛋白和目標(biāo)分子結(jié)合，先用適當(dāng)?shù)募す怆S機(jī)激活一部分熒光蛋白，再用另一種適當(dāng)波長的激光激發(fā)熒光。采集完數(shù)據(jù)之后，需要將熒光蛋白進(jìn)行光漂白，直到完全失活，再激活其他部分的熒光蛋白，進(jìn)行定位數(shù)據(jù)采集。同一時(shí)間段內(nèi)被激發(fā)的熒光蛋白的數(shù)量少且間隔大于最大分辨率，因此將這些圖像進(jìn)行重構(gòu)，就能超越光學(xué)衍射極限。與之原理相近的就是隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微術(shù)（stochastic optical reconstruction microscopy，STORM）［4］，與光敏定位顯微鏡相似均采用熒光分子激發(fā)熒光成像，但存在的偏差是，STORM 是利用可反復(fù)激活的熒光探針對樣品進(jìn)行標(biāo)記。采用的照射光強(qiáng)度很小，不需要將熒光分子進(jìn)行光漂白，橫向成像分辨率可以達(dá)到10 nm左右［1］。

2017年時(shí)，Balzarotti等［12］研發(fā)了一種不同于高斯擬合算法的超分辨成像方法——基于最少光子數(shù)的納米尺度定位（nanoscopy with minimal photon fluxes，MINFLUX）技術(shù)。該方法將差分思想與照明光位置的空間偏移相結(jié)合，通過熒光分子的相對偏移信息，構(gòu)建概率分布模型。將樣本放置在視野正中間和圓周三等分點(diǎn)處。不同的觀測位置會有不同的光強(qiáng)，因此同一個(gè)熒光分子可以產(chǎn)生4種強(qiáng)度的熒光，光子數(shù)較少的情況下，也能獲得單分子定位的準(zhǔn)確信息，分辨率可達(dá)1 nm，光子利用率高。MINFLUX技術(shù)和結(jié)構(gòu)光照明、高斯擬合相結(jié)合，衍生出了結(jié)合結(jié)構(gòu)光照明技術(shù)的MINFLUX 技 術(shù) 變 體（SIMFLUX）［13］技 術(shù)。SIMFLUX 先采用高斯擬合確定視野中的熒光分子位置，再通過2個(gè)反向傳播的倏逝波構(gòu)成的正弦照明模式分別在X和Y上的3 次幅度移動，1 個(gè)熒光分子即可產(chǎn)生6 種強(qiáng)度的熒光，6 幀的高斯擬合估計(jì)以及與模式偏移相關(guān)的光子計(jì)數(shù)相結(jié)合，可以在原基礎(chǔ)上將定位精度提高1倍。由于存在視野位置偏移，這兩種方法數(shù)據(jù)采集時(shí)間長，迭代次數(shù)多，圖像重構(gòu)時(shí)計(jì)算時(shí)間長。

綜上所述，超分辨率成像顯微技術(shù)目前包含STED、 SIM、 PALM、 STORM、 MINFLUX、SIMFLUX 技術(shù)等。根據(jù)實(shí)驗(yàn)成像需求，可以選擇需要的顯微成像技術(shù)。一般進(jìn)行顯微觀測時(shí)，需要考慮熒光分子信號采集的信噪比，實(shí)驗(yàn)時(shí)間短，激光引起的光漂白少，并且成像分辨率盡可能大，STORM 顯微成像技術(shù)變成了首選。本文通過金納米粒子和細(xì)胞樣本的顯微成像，綜合說明STORM技術(shù)的優(yōu)越性。

2 三通道成像

一般情況下，顯微鏡都采用單通道，進(jìn)行成像采樣。這樣只能觀察細(xì)胞內(nèi)的單一物質(zhì)，而無法觀測細(xì)胞中生命運(yùn)動的多樣性，不能滿足生物、醫(yī)藥等相關(guān)領(lǐng)域的研究需求。因此為了更加明確細(xì)胞中存在的物質(zhì)多樣性，這些物質(zhì)是怎樣進(jìn)行相互運(yùn)動的，產(chǎn)生了多種多色成像技術(shù)［14］?，F(xiàn)有多色成像技術(shù)路線大致包含熒光激發(fā)、熒光激活、熒光猝滅、分光技術(shù)、光譜技術(shù)、點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)等。目前在超分辨率領(lǐng)域多色成像研究中，能夠?qū)崿F(xiàn)最多色彩成像數(shù)的為四色成像，由加州大學(xué)伯克利分校徐克老師研究完成［15］。該四色成像采用了三棱鏡分光的光譜技術(shù)，結(jié)合雙物鏡進(jìn)行雙通道信息提取，能夠?qū)崿F(xiàn)更高的信噪比（圖2）。但由于需要將三棱鏡分光路徑和超分辨熒光信息提取路徑中拍攝的圖像進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，復(fù)雜度比較高。

Fig.2 Four color imaging optical path diagram圖2 四色成像光路圖

由于分光成像技術(shù)信號采集效率高，不需額外進(jìn)行特點(diǎn)矯正，數(shù)據(jù)處理簡單，對使用者來說比較友好、容易上手，因此選擇分光成像技術(shù)進(jìn)行多色成像。熒光分子通過激光激發(fā)，可以產(chǎn)生暗態(tài)和亮態(tài)兩種形態(tài)［16］，不同的熒光分子由不同波長的激光進(jìn)行特異性激發(fā)［17］，目前比較常用的波段為488、561、647、750 nm。該方法是依次照射不同波長的熒光，順序成像導(dǎo)致成像存在時(shí)間差，由于液體移動，拍攝的熒光數(shù)據(jù)不在同一視野中產(chǎn)生誤差。在此基礎(chǔ)上研發(fā)了將不同波長激光合成到同一光纖傳輸，通過二向色鏡分出不同光路通道，按照透射和反射的比例分出不同顏色的激光照射下的數(shù)據(jù)，經(jīng)過一系列數(shù)據(jù)處理，能夠形成多色成像。由于該項(xiàng)技術(shù)進(jìn)行區(qū)分激光顏色是通過激光透射和反射比例計(jì)算的，激光的光譜存在重疊，其串色現(xiàn)象會比較嚴(yán)重，而且二向色鏡、透鏡等光學(xué)硬件存在器件誤差，會反映在數(shù)據(jù)采集時(shí)不同波長的激光產(chǎn)生的數(shù)據(jù)之間存在一定的位置偏移。且透鏡等存在曲率，不同地方的位置偏移量不同，需要進(jìn)行算法對齊。為了達(dá)到更好的成像效果，目前只采用3種波長的激光進(jìn)行成像，也就是三通道成像，其光路原理見圖3，然后通過算法減小串色和位置偏移的干擾。

Fig.3 Three channel principle圖3 三通道原理

串色問題通過將單個(gè)激光在寬場中進(jìn)行三通道拍攝，獲得單個(gè)激光在每個(gè)通道的平均強(qiáng)度（圖4），為金納米粒子拍攝。將每個(gè)激光對應(yīng)成像通道內(nèi)的總強(qiáng)度除去其他激光在該通道上的平均強(qiáng)度，即可消除串色影響。而位置偏移問題，采用了將圖像直接進(jìn)行三通道的超分辨成像，將各通道的圖像進(jìn)行兩兩四次多項(xiàng)式擬合，進(jìn)行成像光斑中心對齊的方法，能夠?qū)⒊上裾`差縮小到20 nm 以內(nèi)（圖5），也就是超分辨率顯微鏡誤差。

Fig.4 Polychromatic imaging圖4 三色成像

Fig.5 Three channel imaging alignment圖5 三通道成像對齊

3 顯微鏡成像系統(tǒng)

綜上采用STORM顯微成像技術(shù)和三通道成像的超分辨率顯微鏡成像系統(tǒng)主要包含主體、三通道成像系統(tǒng)、TIRF 照明系統(tǒng)、激光和控制器系統(tǒng)、光學(xué)平臺和成像工作站（圖6）。

Fig.6 STORM based three channel super-resolution microscope imaging system圖6 基于STORM的三通道超分辨率顯微鏡成像系統(tǒng)

主體由基本顯微鏡主體構(gòu)成，并包括主動式鎖定系統(tǒng)、PI 平移臺、顯微鏡成像控制器等零部件。顯微鏡成像控制器主要用來調(diào)節(jié)物鏡上下高度、聚焦平面深度也就是確認(rèn)成像視野的Z軸位置等，PI平移臺是用來操縱載玻片成像視野。而主動式鎖定系統(tǒng)則是為了減少細(xì)胞因環(huán)境因素造成抖動產(chǎn)生的位置偏移量，其將某一聚苯乙烯凝珠作為參考系，實(shí)時(shí)進(jìn)行位置偏移量校準(zhǔn)。成像相機(jī)采用探測靈敏度高的EMCCD相機(jī)，能夠提高信噪比。成像工作站也就是計(jì)算機(jī)處理器。

由于顯微鏡成像過程中，顯微鏡本身具備一些硬件精度的缺陷，例如分光器不能將不同波長的激光完全分離開，會導(dǎo)致成像中存在串色情況；分光器造成的光路偏移，導(dǎo)致三束光之間存在位置偏移量，需要進(jìn)行對齊等算法上的優(yōu)化操作。處理算法原理見第2節(jié)。

4 超分辨率顯微鏡成像實(shí)測

COS-7細(xì)胞來源于非洲綠猴腎成纖維細(xì)胞并經(jīng)SV40 病毒基因轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系，一般用于病毒和轉(zhuǎn)染研究以及對細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄的研究。為了測試經(jīng)過算法優(yōu)化后的三通道超分辨率顯微鏡的成像效果，現(xiàn)通過COS-7細(xì)胞進(jìn)行實(shí)際測試。

實(shí)驗(yàn)測試時(shí)，需要進(jìn)行2步配置操作：a.聚苯乙烯載玻片；b.COS-7細(xì)胞樣本配置。用鬼筆環(huán)肽標(biāo)記微絲，Tom20標(biāo)記線粒體，Tublin標(biāo)記微管蛋白，并采用561、647、750 nm 的激光進(jìn)行激發(fā)，在寬場和超高分辨率條件分別成像（圖7）。

Fig.7 Wide field imaging of COS-7 cell sample圖7 COS-7細(xì)胞樣本寬場成像

COS-7 細(xì)胞內(nèi)鬼筆環(huán)肽、Tom20、Tublin 在受到激光激發(fā)后，將在不同的通道上產(chǎn)生不同的圖像。在受激發(fā)的過程中，并不是所有的熒光分子都會同時(shí)發(fā)光，而是會有隨機(jī)性的發(fā)光一部分，但是另一部分不發(fā)光。本系統(tǒng)應(yīng)用的3個(gè)通道都會同時(shí)產(chǎn)生COS-7 細(xì)胞的受激發(fā)光現(xiàn)象，但是由于每次發(fā)光的粒子不同，本系統(tǒng)可以時(shí)間交換分辨率的方式，在不同的時(shí)間上拍攝不同的COS-7細(xì)胞樣本，從而對COS-7細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記的3種物質(zhì)位置獲取更詳細(xì)的信息。在設(shè)定的拍攝時(shí)間之后，再將所有的拍攝圖片重新合成，這樣就可以獲得更高分辨率的圖像（圖8）。

Fig.8 Super-resolution imaging of COS-7 cell sample圖8 COS-7細(xì)胞超高分辨率成像

從圖像中可見，圖8在超高分辨率熒光顯微鏡下的圖片成像分辨率高于圖7，實(shí)現(xiàn)了超高分辨率顯微鏡的成像分辨率超越光學(xué)衍射極限的基本目標(biāo)。圖8 的光斑大小明顯小于圖7，使光斑中心點(diǎn)位置提取的精確度提高。進(jìn)行三通道位置對齊后，即可確定各熒光分子的位置。為了將三通道對齊能普遍適用于每一次檢測過程中，需要進(jìn)行多次實(shí)驗(yàn)，將參數(shù)值進(jìn)行實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)調(diào)節(jié)，保證每一次對齊誤差在超分辨率顯微鏡的分辨率20 nm以內(nèi)。

5 總 結(jié)

以STORM顯微成像技術(shù)為基礎(chǔ)的超分辨率顯微成像系統(tǒng)，現(xiàn)已能達(dá)到20 nm 分辨率。通過COS-7細(xì)胞樣本成像，可以觀測出比寬場有更好的成像效果，光斑尺寸明顯減小。通過三通道成像，熒光分子位置確定更加的精確，提供更準(zhǔn)確的生物信息。通過初步驗(yàn)證，此項(xiàng)技術(shù)對生物醫(yī)藥領(lǐng)域研究有很好的技術(shù)支持作用，其他場景的應(yīng)用情況需要更多的生物樣本測試和反饋調(diào)節(jié)。