海洋褐藻多糖的復(fù)雜結(jié)構(gòu)、降解酶系以及生物學(xué)功能*

李 雪 吳秀蕓 李穎杰 王祿山

（山東大學(xué)微生物技術(shù)國家重點實驗室，青島 266237）

海洋生態(tài)系統(tǒng)約占地球表面積的71%，是地球上最大的碳匯系統(tǒng)。據(jù)統(tǒng)計，海洋生態(tài)系統(tǒng)中大型藻類（包括褐藻、紅藻和綠藻）、紅樹林和鹽沼植物等“藍碳”植物的碳封存量是陸地生態(tài)系統(tǒng)的10 倍［1］。大型海藻等初級生產(chǎn)者在碳循環(huán)中發(fā)揮重要作用，除了作為移動碳匯之外，它們還可通過光合作用捕獲碳元素并長久儲存在沉積環(huán)境中，或經(jīng)過生物轉(zhuǎn)化形成惰性溶解有機碳，在某些條件下，海藻中的有機碳會發(fā)生礦化，其生成的可溶性無機碳也是重要的藍色碳匯之一［2-3］。大型海藻的全球年產(chǎn)量超過3 000 萬噸，具有生物質(zhì)產(chǎn)量高、生長速度快和多糖含量高等特點，并且在生長過程中不占用耕地和淡水資源［4］。與主要由葡聚糖組成的綠藻相比，紅藻所含的3,6-脫水-L-半乳糖（3,6-anhydro-L-galactose，L-AHG）和褐藻所含的褐藻酸鹽等主要多糖組分不容易發(fā)酵，從而導(dǎo)致紅藻和褐藻的利用相對更加困難［5］。2021 年，中國褐藻（包括海帶、裙帶菜和羊棲菜等）海水養(yǎng)殖產(chǎn)量約為190萬噸，遠高于其他經(jīng)濟藻類的產(chǎn)量［6］。褐藻除了可以直接作為食品消費外，還是生物煉制過程中的重要原料，可用于生產(chǎn)各種化學(xué)品、藥品以及制備生物燃料，在未來的生物經(jīng)濟中扮演重要角色。有數(shù)據(jù)表明，褐藻生態(tài)系統(tǒng)占據(jù)了全球約25%的海岸線，其每年產(chǎn)生的價值高達上千億美元［7-8］。值得注意的是，褐藻中碳水化合物含量高達60%，其含有的褐藻多糖及其衍生物具有抗腫瘤、抗凝血、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性［9］。

自2014年以來，隨著人們對碳水化合物結(jié)構(gòu)、相關(guān)降解酶及純化方法研究的深入，利用代謝工程等新一代生物技術(shù)將褐藻多糖轉(zhuǎn)化為高附加值的產(chǎn)品已成為可能［10］。制備海藻低聚糖的傳統(tǒng)技術(shù)主要是化學(xué)法，該方法提取率低，并且在過程中產(chǎn)生的殘留物容易造成環(huán)境污染。相比之下，生物酶法更為綠色環(huán)保，制備條件溫和，催化效率高，可形成生物相容的活性產(chǎn)物。來自海洋微生物的碳水化合物降解酶在海洋碳循環(huán)過程中可充當穩(wěn)定的酶庫，對海洋多糖的降解發(fā)揮重要作用［11］。因此，充分認識褐藻多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)、降解酶系及其活性架構(gòu)特征，有助于揭示酶和底物特異性識別的物質(zhì)基礎(chǔ)，推動褐藻多糖的高效生物降解轉(zhuǎn)化，對精準定制生物活性寡糖、形成綠色環(huán)保的工業(yè)化生產(chǎn)工藝具有重要意義。

1 褐藻的系統(tǒng)發(fā)育及形態(tài)結(jié)構(gòu)

褐藻門與陸地植物、綠藻和紅藻具有某些共同的特征，均能夠進行光合作用且具有細胞壁結(jié)構(gòu)。系統(tǒng)發(fā)育表明，褐藻隸屬于真核生物冠群不等鞭毛生物，它在進化上不同于紅藻、綠藻和陸生植物等原始色素體生物，也不同于真菌和動物等后鞭毛生物［12］。獨立的進化過程使得褐藻具有獨特的代謝、生理、細胞和生態(tài)特征，包括鹵素的代謝、特有的細胞壁多糖和對滲透脅迫現(xiàn)象的高耐受性［13］。褐藻綱成員共包含20 個目、285 個屬、2 098 個種，其中，酸藻目（Desmarestiales） 和部分水云目（Ectocarpales）的藻體類型相對簡單，為單列細胞組成的異絲體結(jié)構(gòu)，而海帶目（Laminariales）、線翼藻目（Tilopteridales）、墨角藻目（Fucales）和部分水云目的結(jié)構(gòu)相對復(fù)雜，已分化出類似根、莖、葉或氣囊等組織（圖1a）。藻類形態(tài)結(jié)構(gòu)最復(fù)雜的是海帶目， 最具代表性的就是海帶（Laminaria japonica），海帶的孢子體由固著器（假根）、柄和葉片三部分組成（圖1b）［14］。固著器位于海帶基部，類似于植物的根，起錨定作用，可吸附在棕繩或巖石上，但內(nèi)部無維管組織和根冠的分化。柄是連接固著器和葉片的部分，在海帶幼期呈現(xiàn)圓柱形，表面光滑，藻體成熟后則呈扁圓形。葉狀體呈褐色帶狀，革質(zhì)有光澤，藻體一般長2~ 4 m，葉片邊緣生長速度快于中部。海帶的生長方式為居間生長，分生組織位于海帶的基部，即柄與葉片連接處，該部位細胞具有很強的分裂能力［15］。

2 褐藻的碳水化合物組分

褐藻不同的起源與進化過程使得其存在獨特的生物活性物質(zhì)，主要包括碳水化合物、鹵化物和酚類物質(zhì)等［20］。從褐藻中分離提取的碳水化合物統(tǒng)稱為褐藻多糖，主要包括褐藻膠（alginate）、巖藻多糖（fucoidan）、昆布多糖（laminarin）、纖維素和半纖維素等，其中褐藻膠、巖藻多糖和纖維素為結(jié)構(gòu)型多糖，主要存在于褐藻細胞壁中，昆布多糖為儲存型多糖，位于葉綠體和液泡中（圖1c）。纖維素和半纖維素是陸生植物細胞壁的主要成分，但是在褐藻細胞中含量很低，褐藻多糖以陰離子酸性多糖為主［18，21］。下面就褐藻中特有的碳水化合物成分加以介紹。

2.1 褐藻膠

褐藻膠是一類線性的陰離子酸性多糖，最初是從褐藻細胞壁中分離得到，約占細胞干重的40%~50%，隨后又在假單胞菌（Pseudomonas）、固氮菌屬（Azotobacter）等細菌中觀察到褐藻膠的存在，充當細菌生物膜的主要成分。目前商業(yè)化褐藻膠主要 來 源 于 泡 葉 藻 （Ascophyllum）、 海 帶（Laminaria）、 巨 藻（Macrocystis） 和 馬 尾 藻（Sargassum）等海洋藻類［22］。褐藻膠由β-D-甘露糖醛酸（β-D-mannuronic acid，M）和α-L-古羅糖醛酸（α-L-guluronic acid，G）兩種單體組成，M和G互為差向異構(gòu)體，它們的差異僅在于C-5位羧基的構(gòu)象［23］。兩類單體通過1,4-O-糖苷鍵連接形成MM、MG、GG和GM 4種二糖單元，并進一步以均聚方式形成多聚M （PolyM） 或多聚G（PolyG）嵌段，或以雜聚的方式隨即交替形成PolyMG嵌段，結(jié)構(gòu)上的混雜性使得褐藻膠是相對難降解的海洋多糖之一［24］（圖1d）。褐藻膠單體的排列方式、M/G 比例、分子質(zhì)量和乙?；潭鹊纫蛩鼐鶗绊懰慕Y(jié)構(gòu)，也決定了其理化性質(zhì)，如黏度、溶膠/凝膠性質(zhì)和吸水率等［25］。例如，富含G的褐藻膠單元剛性更強，具有更高的熱穩(wěn)定性和持水能力，容易形成孔隙較大的水凝膠，便于固定化生物組分從聚合物網(wǎng)絡(luò)中擴散［26］，而富含M 的單元柔軟且有彈性，適合制備低滲透率的微膠囊等遞送材料［27］。此外，褐藻膠G 嵌段對陽離子的親和力大于M 嵌段，與果膠“蛋盒”模型類似，兩個相鄰G單體的羧基易與二價金屬離子（如Ca2+或Ba2+等）相互作用，鈣依賴性凝膠化主要依靠靜電相互作用，Ca2+可與褐藻膠的羧基相互作用，使得分子鏈間交聯(lián)，減少分子間的靜電排斥，有助于凝膠結(jié)構(gòu)的形成［28-29］。據(jù)報道，褐藻膠具有生物相容性、無毒性和高穩(wěn)定性等多種理化性質(zhì)，是組織工程中理想的生物惰性基質(zhì)，廣泛用于藥物遞送、組織工程和基因治療等領(lǐng)域，并且還可作為膠凝劑和增稠劑應(yīng)用于化妝品行業(yè)和食品工業(yè)中［30-31］。目前，各種化學(xué)改性褐藻膠的結(jié)構(gòu)和相應(yīng)性質(zhì)已有報道，包括乙?；衷逅猁}、硫酸化褐藻酸鹽、疏水改性褐藻酸鹽和共價交聯(lián)褐藻酸鹽等。通過改變褐藻酸鹽的結(jié)構(gòu)，可以定制溶解度、疏水性、機械性能和物理化學(xué)穩(wěn)定性等性質(zhì)，構(gòu)建特定用途的理想材料，為生物活性成分的遞送提供了新的方向［32-33］。

2.2 巖藻多糖

巖藻多糖又稱巖藻多糖硫酸酯，是一類天然的硫酸化雜多糖，主要從褐藻細胞壁和細胞間質(zhì)中分離得到，作為細胞壁的支撐結(jié)構(gòu)和“親水涂層”，能夠維持細胞濕潤的環(huán)境，抵御過度光照對藻體的破壞［34］。此外，巖藻多糖也存在于少量海洋無脊椎動物（如海膽和海參）中。1913年，Kylin［35］首次從掌狀海帶（Laminaria digitata）中提取出這類多糖，經(jīng)水解確定其主要單體為L-巖藻糖。隨著鑒定和純化分離方法的發(fā)展，人們對巖藻多糖結(jié)構(gòu)的研究日趨深入。研究發(fā)現(xiàn)，除了L-巖藻糖和硫酸鹽基團組成的核心骨架結(jié)構(gòu)之外，巖藻多糖還含有葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、木糖、甘露糖和葡萄糖醛酸殘基等分支結(jié)構(gòu)，少數(shù)還存在乙?；?6］。巖藻多糖的結(jié)構(gòu)和組成、取代基位置與其來源、部位和分離提取方法密切相關(guān)，有研究表明從墨角藻（Fucus vesiculosus）中分離的巖藻多糖含有84%巖藻糖、6%木糖、7.3%半乳糖和2%的甘露糖，而從Fucus distichus中發(fā)現(xiàn)的巖藻多糖由51.6%巖藻糖、2.7%木糖、1.5%半乳糖、0.7%甘露糖和0.2%葡萄糖組成［37-38］。來自墨角藻（F.vesiculosus）和繩藻（Chorda filum）的巖藻多糖主鏈雖然均由α-1,3-糖苷鍵連接，但它們發(fā)生硫酸化取代的位置明顯不同，前者主要取代C-4位置，而后者的硫酸基主要位于O-4位上，部分位于O-2位上［39-40］。巖藻多糖的異質(zhì)性使得人們很難從整體上對其進行研究，Cumashi 等［41］研究發(fā)現(xiàn)，巖藻多糖主鏈的骨架結(jié)構(gòu)可作為分類的物質(zhì)基礎(chǔ)，復(fù)雜多變的主鏈結(jié)構(gòu)大致可分為兩種類型，包括以1,3-α-L-巖藻糖為重復(fù)單元的I 型主鏈結(jié)構(gòu)，和以交替的1,3-α-L-巖藻糖和1,4-α-L-巖藻糖為重復(fù)單元的II 型主鏈結(jié)構(gòu)（圖1d）。據(jù)報道，來自海帶目和水云目的巖藻多糖多為I型結(jié)構(gòu)，而從墨角藻目中分離出的巖藻多糖往往含有主鏈重復(fù)單元［42］。巖藻多糖的生物活性與它的結(jié)構(gòu)特征密切相關(guān)，如多糖的分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)、硫酸基的含量和位置，以及是否存在其他取代基等，但到目前為止，巖藻多糖的精細結(jié)構(gòu)尚未完全闡明，結(jié)構(gòu)與特定生物活性功能之間的構(gòu)效關(guān)系有待深入探究［43-44］。

2.3 昆布多糖

昆布多糖又稱海帶淀粉、褐藻淀粉，主要來源于海帶目（例如Laminaria、Saccharina和Undaria） 和 墨 角 藻 目（例 如Ascophyllum和Fucus），廣泛存在于胞內(nèi)葉綠體和液泡中。作為褐藻的儲存型碳水化合物，昆布多糖含量隨季節(jié)變化顯著，在藻類快速生長的春季含量極低，主要在生長的中后期積累［45］。與其他海洋多糖相比，昆布多糖的結(jié)構(gòu)簡單且平均分子質(zhì)量低，化學(xué)結(jié)構(gòu)由β-1,3-O-糖苷鍵連接的D-葡萄糖殘基主鏈和β-1,6-O-糖苷鍵連接的D-葡萄糖側(cè)鏈組成（圖1d），分子質(zhì)量約為5 ku，聚合度在20~30之間。根據(jù)聚合鏈末端結(jié)構(gòu)的不同，昆布多糖分為兩大類，在主鏈還原端含有D-甘露醇殘基的稱為M 鏈；反之，還原端被葡萄糖殘基取代而不含甘露醇殘基的鏈稱為G 鏈［46］。多糖中主鏈和側(cè)鏈的比例與褐藻種類和環(huán)境因素（棲息地、水溫、鹽度、海流和季節(jié)）密切相關(guān)，通常在1∶1 至10∶1 之間［19］。例如，來自網(wǎng)地藻（Dictyota dichotoma）的昆布多糖含有重復(fù)四糖結(jié)構(gòu)單元，主側(cè)鏈比為3∶1，但從糖海帶（Saccharina cichorioides）分離出的昆布多糖結(jié)構(gòu)并不規(guī)律，分子中β-1,6-O-連接的葡萄糖殘基主要集中在非還原末端附近［47］。更為復(fù)雜的是，從墨角藻（F.evanescens）中分離的昆布多糖，C-6處的分支不僅是單個葡萄糖殘基組成，而是β-1,6-O-連接的葡萄糖殘基短鏈組成［48］。有研究表明，昆布多糖的分支度決定了溶解性，來自Turbinariaconoides昆布多糖的β-1,6-支鏈含量約為1%~2%，僅在溫水（60~80℃）中可溶，而分支度高的昆布多糖可以在冷水中完全溶解，結(jié)構(gòu)的分支度不僅會影響多糖的理化性質(zhì)，還可能影響其生物活性功能［49-50］。與其他海洋多糖（例如褐藻膠，瓊膠和卡拉膠）不同，昆布多糖不具有增稠和凝膠特性。但大量研究表明，作為天然的β-1,3-葡聚糖聚合物之一，昆布多糖具有的潛在的生物活性，并且通過輻照、硫酸化、氧化和還原等多種手段可改善多糖的理化和機械性能［51］。

3 褐藻多糖降解酶系及其活性架構(gòu)

3.1 褐藻膠裂解酶及其活性架構(gòu)

褐藻膠的生物降解由褐藻膠裂解酶（alginate lyase）催化完成，該類酶采用β-消除機制使褐藻膠多糖的β-1,4-O-糖苷鍵斷裂，形成在非還原端糖環(huán)的C-4 和C-5 間帶有不飽和鍵的寡糖或單糖4-脫氧-L- 赤-5- 己 糖 醛 酸 （4-deoxy-L-erythro-5-hexoseulose uronic acid，DEH）。在具有褐藻酸鹽代謝功能的微生物中，DEH 在還原酶作用下生成2- 酮-3- 脫 氧 葡 糖 酸（2-keto-3-deoxygluconate，KDG），然后通過激酶磷酸化為2-酮-3-脫氧-磷酸 葡 糖 酸 （2-keto-3-deoxy-phosphogluconate，KDPG），該產(chǎn)物隨后進入Entner-Doudoroff 途徑，產(chǎn)生丙酮酸和3-磷酸甘油醛［52］（圖2a，b）。目前，褐藻膠裂解酶已從各種細菌、真菌、病毒、海藻和海洋軟體動物中分離得到，基于對一級結(jié)構(gòu)的聚類分析，褐藻膠裂解酶共分為14 個家族（PL5、PL6、 PL7、 PL8、 PL14、 PL15、 PL17、 PL18、PL31、PL32、PL34、PL36、PL39 和PL41）［53］。根據(jù)底物特異性，褐藻膠裂解酶可分為甘露糖醛酸特異性裂解酶（PolyM 裂解酶，EC 4.2.2.3）、古羅糖醛酸特異性裂解酶（PolyG裂解酶，EC 4.2.2.11）和雙功能裂解酶（PolyMG 裂解酶，EC 4.2.2.-）（表1）。此外，褐藻膠裂解酶還可根據(jù)作用方式分為內(nèi)切酶和外切酶，前者從聚合物鏈內(nèi)切割糖苷鍵并釋放出不同聚合度的不飽和褐藻酸鹽低聚糖，外切酶只能作用于聚合物末端降解產(chǎn)生單體或二聚體，大多數(shù)已表征的裂解酶為內(nèi)切酶［54-55］。

Fig.2 Schematic diagram of multi-enzyme synergistic degradation and microbial metabolism of marine polysaccharides［51，55-57］圖2 多酶協(xié)同降解及微生物代謝海洋多糖示意圖［51，55-57］

隨著已表征蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)數(shù)量的增加，褐藻膠裂解酶在結(jié)構(gòu)上大致分為4 類：（α/α）n桶狀（PL5）、β果凍卷（PL7、PL14、PL18、PL36）、平行β 螺旋（PL6、PL31）和（α/α）n桶狀反接平行β折疊（PL8、PL15、PL17）［61］。β 果凍卷是最常見的構(gòu)象，該結(jié)構(gòu)由兩個彎曲的反平行β 片（SA 和SB）組成，催化位點由內(nèi)凹片（SA）形成的裂隙所包圍，以該構(gòu)象中表征數(shù)量最多的PL7 家族為例，SA片中心的3個β鏈排列有序，主要識別底物還原端內(nèi)側(cè)基團。PL7 家族的酶具有混雜性，其中，AlyC3（PDB：7C8F）以寡聚甘露糖醛酸為底物，主要識別底物-1 和+1 亞位點，活性中心的保守殘基Arg78 和Gln125 與底物羧基形成相互作用［62］。而來自鞘氨醇單胞菌（Sphingomonassp.）的褐藻膠裂解酶（PDB：2ZAB）以寡聚古羅糖醛酸為底物，該類褐藻膠裂解酶活性中心序列圖譜表明，His191、Gln189 和Tyr284 氨基酸殘基構(gòu)成催化中心，其中His 和Tyr 分別作為酶促反應(yīng)的催化堿和催化酸，其余保守氨基酸殘基分布于+1 和+2亞位點且均為極性氨基酸殘基［63］（圖3）。（α/α）n是由n個反平行α螺旋形成的桶狀結(jié)構(gòu)（n從3~7不等），其中PL5 家族是單結(jié)構(gòu)域蛋白，對PolyM 底物具有專一性。A1-III是PL5家族第一個報道采用（α/α）n折疊的褐藻酸鹽裂解酶，底物分子可伸入隧道裝裂隙中，在6 個內(nèi)螺旋包圍下與催化殘基Tyr246相互作用［5，64］。然而，PL15和PL17家族除了催化結(jié)構(gòu)域外，一般還包含1~2 個額外結(jié)構(gòu)域，并且-1亞位點只能容納1個糖環(huán)，以外切形式發(fā)揮作用［65］。值得注意的是，最新表征的PL39家族褐藻膠裂解酶Dp0100，它的催化結(jié)構(gòu)域與PL15 和PL17 家族相似，但它與五糖復(fù)合結(jié)構(gòu)表明，Dp0100 的底物結(jié)合裂隙深而長，以內(nèi)切方式發(fā)揮作用［66］。β螺旋包含二聚體和單體催化模式，如來自PL6 家族的AlyGC 為同型二聚體，催化斷鍵需要金屬離子的輔助，Ca2+通過與褐藻膠的羧基相互作用激活C-5 質(zhì)子，同時Lys220 和Arg241 分別作為質(zhì)子供體和質(zhì)子受體發(fā)揮功能［67］。而在PL6 家族的AlyF 中，水分子可以部分替代金屬離子的功能，在穩(wěn)定褐藻膠C-5位置羧基的定向過程中發(fā)揮了重要作用［68］。

Fig.3 Conservation of amino acids in the active architecture of some alginate-degrading enzymes and the interaction network with substrates圖3 部分褐藻膠降解酶系活性架構(gòu)氨基酸保守性及與底物形成相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

3.2 巖藻多糖降解酶及其活性架構(gòu)

巖藻多糖降解酶系主要分布于海洋細菌中，少數(shù)海洋無脊椎動物和真菌也能夠降解巖藻多糖［69］。根據(jù)CAZy數(shù)據(jù)庫最新統(tǒng)計，巖藻多糖降解相關(guān)酶系包含GH29、GH95、GH107、GH141、GH151和GH168 家族，根據(jù)其作用位點的不同，可分為α-1,3-L-巖藻糖苷酶（EC 3.2.1.111和EC 3.2.1.211）、α-1,4-L-巖藻糖苷酶（EC 3.2.1.51 和EC 3.2.1.212）和α-1,2-L-巖藻糖苷酶（EC 3.2.1.63）［70］（表1）。值得注意的是，巖藻多糖高度硫酸化且具有支鏈，其修飾作用會阻礙糖苷鍵的斷裂，因此支鏈水解酶和硫酸酯酶需要先發(fā)揮作用。如圖2b 所示，內(nèi)切α-1,4-巖藻多糖酶首先作用于α-1,3/1,4-交替連接的L-巖藻糖主鏈（C-2 位硫酸化修飾），該類酶底物特異性高，只能水解特定的骨架生成硫酸化巖藻寡糖。隨后，在S1 家族外切硫酸酯酶的作用下，硫酸化巖藻寡糖通過酯交換機制釋放C-2位置的硫酸基團，經(jīng)脫硫作用后多糖結(jié)構(gòu)進一步簡化。最后，α-1,3-L-巖藻糖苷酶將寡糖水解成L-巖藻糖，在異構(gòu)酶修飾后進入三羧酸循環(huán)（圖2b）［53］。

與其他海洋多糖相比，巖藻多糖底物的結(jié)構(gòu)相對復(fù)雜，因此已表征和解析的巖藻多糖降解酶數(shù)量有限，目前研究主要集中于GH29、GH95 和GH107 3 個家族。GH107 和GH168 屬于內(nèi)切型巖藻多糖酶，其他家族均以外切方式發(fā)揮作用。相比之下，GH29 家族是目前最大的巖藻糖苷酶家族，具有廣泛的底物特異性。該家族酶催化中心高度保守，Asp 和Glu 分別作為親核試劑和質(zhì)子供體，通過雙取代反應(yīng)催化α-L-巖藻糖基殘基的水解，可切割不同類型的糖苷鍵，包括糖綴合物中由α-1,2-、α-1,3-、α-1,4-和α-1,6-連接的L-巖藻糖和N-乙酰葡糖胺殘基之間的鍵［71-72］。Sakurama等［73］根據(jù)其底物特異性和系統(tǒng)發(fā)育分析將GH29家族分為兩個亞家族。亞家族A的巖藻糖苷酶（EC 3.2.1.51）保守氨基酸殘基主要集中于-1 亞位點，底物特異性較為寬松，而亞家族B（EC 3.2.1.111）的巖藻糖苷酶主要識別-1 和+2 亞位點，可容納半乳糖殘基的存在，特異性水解非還原末端的α-1,3 糖苷鍵。與GH29類似，GH95家族作用于糖鏈的非還原末端，釋放L-巖藻糖，但其催化機制與GH29不同，該家族的α-1,4-L-巖藻糖苷酶和α-1,2-L-巖藻糖苷酶采用單取代催化機制。Glu 作為質(zhì)子供體在GH95 家族內(nèi)高度保守，Asn 通過激活水分子對C-1 原子進行親核攻擊［74］。此外，巖藻多糖降解酶的結(jié)合位點往往存在Trp 和Tyr 等芳香族氨基酸，芳香族氨基酸的苯環(huán)與吡喃糖環(huán)平行，起到穩(wěn)定殘基的作用，使得酶分子在執(zhí)行功能時能夠精準定位于糖鏈［75］（圖4）。GH139和GH141家族中某些成員可以特異性識別果膠中特定的α-L-巖藻糖基序，GH151巖藻糖苷酶未詳細表征［76］。

Fig.4 Conservation of amino acids in the active architecture of some fucoidan-degrading enzymes and the interaction network with substrates圖4 部分巖藻多糖降解酶系活性架構(gòu)氨基酸保守性及與底物形成相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

3.3 昆布多糖降解酶系及其活性架構(gòu)

昆布多糖中不同糖苷鍵的比例和支鏈結(jié)構(gòu)隨藻類的種類和收獲季節(jié)而變化，因此昆布多糖的生物降解需要主鏈和側(cè)鏈糖苷水解酶的共同參與，該降解酶系廣泛存在于真菌、酵母、細菌和海洋無脊椎動物等多種生物體中［77］。昆布多糖降解酶系根據(jù)作用方式不同，可分為內(nèi)切-β-1,3-葡聚糖酶（EC 3.2.1.6 和EC 3.2.1.39）、外切-β-1,3-葡聚糖酶（EC 3.2.1.58）和β-1,6-葡聚糖酶（EC 3.2.1.75）（表1）。內(nèi)切-β-1,3-葡聚糖酶主要分布在GH5、GH8、GH9、GH16、GH17、GH64、GH128、GH152、GH157 和GH158 家族，它們可隨機切割昆布多糖中β-1,3-鍵連接的骨架部分并釋放葡萄糖和β-1,6-鍵連接的寡糖［54］（圖2c）。外切β-1,3-葡聚糖酶作用于糖鏈的非還原性末端將昆布寡糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖，從土星擬威爾酵母（Williopsis saturnus）中分離的WsEXG1 和從白假絲酵母（Candida albicans）中純化的Xog1p 均發(fā)揮該功能［77］，該類酶主要分布于GH5 和GH55 家族。此外，β-1,6-葡聚糖酶也是水解昆布多糖必需的酶，可隨機裂解昆布多糖分支中的β-1,6-糖苷鍵。

據(jù)統(tǒng)計，已解析的昆布多糖降解酶的結(jié)構(gòu)數(shù)量分別為GH16 家族13 個，GH17 家族5 個，GH128家 族4 個，GH5 和GH55 家 族 各3 個，GH30、GH64 和GH158 家族各1 個。糖苷水解酶家族成員通過一步反轉(zhuǎn)或兩步保留水解機制作用于底物，大多數(shù)昆布多糖降解酶（如GH16、GH17、GH128、GH5、GH30、GH158）通過保留機制進行水解，GH55 和GH64 家族則通過反轉(zhuǎn)機制進行水解［78］。來自GH16 家族的成員采用典型的β 果凍卷構(gòu)象，其催化殘基（兩個Glu）雖然在家族內(nèi)部相對保守，但在進化過程中發(fā)展出不同的底物特異性。與其他GH16家族的酶相比，ZgLamA含有一個17個氨基酸組成的附加環(huán)，使酶的底物結(jié)合口袋呈彎曲形狀，與U型構(gòu)象的底物糖鏈相適應(yīng)［79］。GH16家族的Lam16A具有底物混雜性，除了可催化昆布多糖之外，還可作用于β-1,4-連接的地衣多糖［80］，該蛋白質(zhì)中存在一段富含色氨酸殘基的保守序列，Trp110 和Trp257 殘基充當疏水平臺，分別與-2 和+2 位葡萄糖殘基對齊，有助于底物正確定向和結(jié)合［81］。GH17、GH128 和GH158 家族均為（α/α）8桶狀構(gòu)型且催化機制保守。GH17家族GluB晶體結(jié)構(gòu)表明，該類蛋白質(zhì)具有深而寬的裂隙允許酶分子以內(nèi)切形式作用于長鏈底物，氨基酸殘基的保守程度從催化位點向兩端延伸，與糖鏈的結(jié)合能相對均勻［82-83］。GH5 家族成員的催化酸堿氨基酸殘基均為Glu，值得注意的是，該家族Exg 蛋白的底物結(jié)合口袋入口處存在一對反平行的苯丙氨酸殘基（F144 和F258），可與β-1,3-葡聚糖基質(zhì)相互作用［84］（圖5）。GH55 家族的催化機制為反轉(zhuǎn)型，SacteLam55A的整體結(jié)構(gòu)由兩個右旋β 螺旋結(jié)構(gòu)域組成，其中Glu520為催化酸，水分子為親核試劑，親核試劑被四個氨基酸殘基組成的質(zhì)子傳遞網(wǎng)絡(luò)激活［85］。LPHase 是GH64 家族的成員，它由桶狀結(jié)構(gòu)域和（α/β）混合結(jié)構(gòu)域組成，兩個結(jié)構(gòu)域之間存在一段較寬裂隙，整體結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)新月狀（crescent like fold），裂隙內(nèi)部的Glu154 和Asp170分別作為酸催化劑和堿催化劑發(fā)揮作用［86］。

Fig.5 Conservation of amino acids in the active architecture of some laminarin-degrading enzymes and the interaction network with substrates圖5 部分昆布多糖降解酶系活性架構(gòu)氨基酸保守性及與底物形成相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

4 褐藻多糖及寡糖的生物學(xué)功能

4.1 褐藻膠寡糖的生物活性研究

通過酶解法制備的褐藻膠寡糖（alginate oligosaccharide，AOS）表現(xiàn)出獨特的理化性質(zhì)，Liu 等［87］將AOS 與人體健康相關(guān)的生物活性和潛在應(yīng)用進行了詳細的綜述，主要包括免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗糖尿病、抗高血壓、抗腫瘤、抗炎癥和抗凝血活性等。酶解產(chǎn)生的不飽和褐藻膠寡聚物（M3-9 和G3-9）能夠以結(jié)構(gòu)依賴性的方式誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細胞分泌腫瘤壞死因子α（TNF-α），而通過酸水解制備的飽和褐藻膠寡聚物只顯示出相當?shù)偷纳锘钚裕@暗示著寡聚物非還原端的不飽和結(jié)構(gòu)在某些信號通路的誘導(dǎo)中起著關(guān)鍵作用［88］。Fang等［89］進一步闡明了該細胞中GAOS的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，Toll 樣受體（TLR）4 作為TLR 家族的重要成員，是激活先天免疫細胞和觸發(fā)炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能膜表面受體，GAOS 經(jīng)TLR4 識別可以激活MAPK 途徑，使JNK 磷酸化，隨后激活下游轉(zhuǎn)錄因子AP-1。另一方面，GAOS還可激活PI3K通路，誘導(dǎo)Akt 磷酸化并觸發(fā)IκB 激酶，釋放出NF-κB 易位進入細胞核內(nèi)，最終通過級聯(lián)反應(yīng)啟動靶基因表達并誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，包括一氧化氮合酶和TNF-α 等促炎細胞因子（圖6a）。mTOR 通路參與細胞骨架重塑和細胞遷移，當巨噬細胞經(jīng)GAOS處理后，偽足延長且相對細胞面積增加，有助于巨噬細胞與周圍病原體的接觸，促進吞噬作用［90］。在抗氧化方面，AOS 可以顯著增強人靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）中自由基清除劑和抗氧化酶的活性，包括超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽（GSH）［91］。AOS還能夠以濃度依賴性的方式清除超氧化物和羥基自由基，有趣的是，GAOS 誘導(dǎo)巨噬細胞產(chǎn)生一氧化氮（NO）的水平顯著強于MAOS，這與二者分子構(gòu)象的差異密切相關(guān)［92］。此外，寡聚甘露糖醛酸及其鉻（III）復(fù)合物可增強C2C12 骨骼肌細胞細胞對胰島素的敏感性，提高細胞中葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白和胰島素受體的表達水平［93］。

Fig.6 Bioactivity and mechanism of fucoidan oligosaccharides圖6 褐藻寡糖生物活性及其作用信號通路

4.2 巖藻多糖及其衍生寡糖的生物活性研究

近年來，海洋天然產(chǎn)物的開發(fā)推動了多糖藥物研究領(lǐng)域的發(fā)展，巖藻多糖具有調(diào)節(jié)機體免疫、抗凝血、抗腫瘤、降血脂、抗病毒和抗炎等生物學(xué)活性，使得其成為新的研究熱點。在目前已表征的多種巖藻多糖生物活性中，國內(nèi)外學(xué)者對其抗腫瘤作用的相關(guān)研究最為深入。巖藻多糖及其衍生寡糖對多種類型的癌細胞和腫瘤細胞的作用機制主要分為以下4個方面。首先，抑制癌細胞有絲分裂、調(diào)節(jié)細胞周期，巖藻多糖處理肝癌細胞系（Huh7）可能導(dǎo)致G0/G1 細胞積累并誘導(dǎo)其他細胞周期停滯［19］。其次，巖藻寡糖可以激活癌細胞的凋亡信號。Zhang 等［94］研究發(fā)現(xiàn)，使用820 mg/L 低分子質(zhì)量的巖藻寡糖處理乳腺癌細胞MDA-MB231 后，抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-xl 和Mcl-1）的表達量顯著降低，促凋亡蛋白（如Bax、Bid 和Bak）的表達水平有所提高，最終激活效應(yīng)物Caspase-3/7導(dǎo)致細胞的內(nèi)源性凋亡（圖6b）。此外，巖藻寡糖可通過死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物（FADD）激活胞內(nèi)凋亡機制，但是目前關(guān)于巖藻寡糖與腫瘤細胞作用的受體靶點尚無報道［95］。另一方面，巖藻寡糖可調(diào)節(jié)自噬關(guān)鍵激酶mTORC1 活性，誘發(fā)自噬作用并激活自噬調(diào)控關(guān)鍵蛋白Beclin-1的表達，過度的自噬作用觸發(fā)非凋亡程序性細胞死亡［96-97］。第三，血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）可特異性識別巖藻寡糖FP08S2 上的硫酸化基團，競爭性阻斷ERK/VEGF/VEGFR信號通路，切斷腫瘤細胞營養(yǎng)和氧氣的供應(yīng)［98］。第四，巖藻寡糖通過與巨噬細胞和樹突細胞膜上特定的糖蛋白受體結(jié)合激活MAPK 信號通路，調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)［99］。最新研究表明，來自海帶（L.japonica）的巖藻寡糖可以顯著減輕頭孢哌酮誘導(dǎo)的腸道損傷，調(diào)節(jié)小鼠腸道的微生物菌群，且它的誘導(dǎo)活性與分子質(zhì)量相關(guān)，中等分子質(zhì)量巖藻寡糖（mid-molecular-weight fucoidans，MF）（MW=26.7 ku）的誘導(dǎo)效果優(yōu)于低分子質(zhì)量巖藻寡糖（low-molecular-weight fucoidans， LF） （MW=1.13 ku）［100］。巖藻寡糖在心腦血管疾病的治療中也具有應(yīng)用潛力，它可加快膽固醇的反向轉(zhuǎn)運過程，抑制脂質(zhì)合成并提高脂質(zhì)的代謝［101］。

4.3 昆布多糖及其衍生寡糖的生物活性研究

昆布多糖及其衍生寡糖作為天然的β-1,3-葡萄糖聚合物之一，具有廣泛的生物活性，已有文獻報道該類物質(zhì)能夠激活先天性免疫反應(yīng)，刺激抗腫瘤反應(yīng)，抑制細胞凋亡并促進傷口修復(fù)［102-103］。昆布多糖與真菌細胞壁成分β-1,3-葡聚糖分子結(jié)構(gòu)相似，是先天性免疫反應(yīng)中的重要配體，可與葡聚糖特異性識別受體Dectin-1相互作用［104］。Dectin-1與配體結(jié)合后，可招募脾酪氨酸激酶激活轉(zhuǎn)錄因子NFAT，進而誘導(dǎo)環(huán)氧合酶2（COX-2）和白介素-2（IL-2）等細胞因子的分泌，增強機體免疫力［105］（圖6c）。作為免疫刺激劑，昆布多糖可誘導(dǎo)魚類激活非特異性先天免疫，增強魚類對細菌或病毒感染的抵抗力［106］。此外，昆布多糖衍生物可通過誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡從而實現(xiàn)抗腫瘤的作用。有研究指出，昆布寡糖可通過線粒體介導(dǎo)的細胞凋亡途徑抑制人結(jié)腸癌細胞LoVo 增殖，其信號傳導(dǎo)過程與巖藻寡糖激活的內(nèi)源性凋亡途徑類似［107］。Huang等［108］指出，與昆布寡糖相比，45.92%硫酸化的寡糖（LAMS）能更顯著地抑制LoVo細胞的生長，這表明LAMS具有更好的抗腫瘤活性，分子修飾技術(shù)為生產(chǎn)具有高抗腫瘤活性的昆布寡糖提供了新的思路。有研究表明，昆布多糖對人體上消化道中的水解酶存在抗性，其可作為益生元調(diào)節(jié)人類腸道健康。在小鼠飲食中添加昆布多糖可明顯降低腸道中厚壁菌門與擬桿菌門的比例，增強腸道菌群的代謝能力。另一方面，昆布多糖有利于動物雙歧桿菌和干酪乳桿菌的生長，使得乳酸和乙酸等短鏈脂肪酸產(chǎn)量提高，有助于維護腸道的功能、緩解高脂飲食帶來的副作用［109］。

5 展 望

海洋藻類產(chǎn)量巨大并且蘊含著豐富的生物質(zhì)資源，隨著海洋生物技術(shù)的進步和發(fā)展，海藻的高值化利用已成為新興的研究領(lǐng)域，海藻衍生生物活性物質(zhì)在生物醫(yī)學(xué)和食品工業(yè)中展現(xiàn)出巨大的潛力。然而，目前海藻的高效降解和高值轉(zhuǎn)化過程還存在許多問題與挑戰(zhàn)。一方面，海洋多糖具有復(fù)雜的異質(zhì)結(jié)構(gòu)，如褐藻膠和巖藻多糖的結(jié)構(gòu)多樣且高度可變，相關(guān)降解酶和底物的特異識別作用機制尚未完全闡明。在商業(yè)應(yīng)用方面，海洋多糖降解酶的穩(wěn)定性和有效性往往不能滿足工業(yè)應(yīng)用的要求，未來除了尋找具有合適特性的新型海洋多糖降解酶之外，還可通過定向進化或理性設(shè)計等蛋白質(zhì)工程修飾現(xiàn)已表征的酶，以期獲得高穩(wěn)定性、高活性和適合工業(yè)應(yīng)用的底物特異性酶。此外，各多糖降解酶家族的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)數(shù)量有限，GH168 和PL32 等新家族的拓撲結(jié)構(gòu)尚未解析。近年來，隨著AlphaFold2 等新一代蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測技術(shù)的出現(xiàn)，大量結(jié)構(gòu)未知的蛋白質(zhì)可被精準預(yù)測，2022 年7月，DeepMind宣布AlphaFold數(shù)據(jù)庫已從100萬個結(jié)構(gòu)拓展到2億個結(jié)構(gòu)，基本涵蓋了地球上所有已進行過基因組測序的植物、細菌、動物和其他生物的結(jié)構(gòu)［110］。這些新技術(shù)有助于快速精確定位酶分子的活性架構(gòu)、定量分析酶與底物作用的潛在靶位點及構(gòu)效關(guān)系，并且使得預(yù)測免疫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中細胞受體結(jié)構(gòu)和其與配體特異性識別的作用機制成為可能，加速了相關(guān)藥物研發(fā)的進程。另一方面，大型藻類生物碳可用于生物精煉技術(shù)，海洋多糖降解酶和相關(guān)代謝途徑在生物精煉中的潛力已得到證實，可將生物質(zhì)資源轉(zhuǎn)化為燃料、化學(xué)品及部分藥品［111］。但目前關(guān)于利用綠色工業(yè)微生物轉(zhuǎn)化褐藻生物質(zhì)的系統(tǒng)研究較少，其原因是海洋多糖降解酶等生物大分子結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系仍不明確，相關(guān)降解微生物的遺傳操作方法和調(diào)控模型仍不清楚，使得探究微生物藻類多糖降解代謝途徑仍較困難，尚未形成工業(yè)化藻類生物轉(zhuǎn)化的通用方法。隨著結(jié)構(gòu)與組學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，利用合成生物學(xué)技術(shù)可有目的地設(shè)計并精確配制酶系，基于所選底盤微生物建立合理高效的體內(nèi)代謝途徑，構(gòu)建可實現(xiàn)特定功能的合成微生物組，這些新型技術(shù)的出現(xiàn)為未來大型藻類的高效生物轉(zhuǎn)化提供了更多可能，海洋生物質(zhì)資源的集約化開發(fā)和海洋低聚糖的商業(yè)化生產(chǎn)具有廣闊的發(fā)展前景［112］。