熒光PCR探針熔解曲線技術(shù)檢測(cè)痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥性的研究

王嫩寒 趙琰楓 田麗麗 陳雙雙 陳昊 任怡宣 李傳友 代小偉

北京市疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室（北京 100035）

異煙肼是重要的抗結(jié)核藥物［1］。目前，由于沒(méi)有耐受性良好的抗結(jié)核藥物出現(xiàn)，異煙肼仍作為重要的一線抗結(jié)核藥物在使用［2］。異煙肼被結(jié)核分枝桿菌（Mycobacteriumtuberculosis，MTB）的過(guò)氧化氫-過(guò)氧化物酶KatG過(guò)氧化活化為異煙堿?；杂苫梢耘c烯?；€原酶-NAD復(fù)合體（MTB細(xì)胞壁的主要成分——分枝菌酸的生化合成途徑中的關(guān)鍵成分）相結(jié)合，從而抑制其活性，最終通過(guò)影響MTB細(xì)胞壁的正常合成途徑，使MTB喪失增殖等功能而達(dá)到抑菌的目的［3-4］。2018年，WHO的一份研究報(bào)道，據(jù)估計(jì)，全世界約8%的結(jié)核病患者為異煙肼耐藥結(jié)核?。?］。2020年，全球結(jié)核病報(bào)告中指出，在活動(dòng)性肺結(jié)核患者中，異煙肼耐藥肺結(jié)核占15%，需盡快發(fā)現(xiàn)這部分患者，并選擇合適的替代治療方案［6］。然而，異煙肼耐藥比單利福平耐藥更常見(jiàn)，并可能嚴(yán)重影響抗結(jié)核治療［7］。

傳統(tǒng)的藥敏試驗(yàn)建立在患者標(biāo)本培養(yǎng)陽(yáng)性的基礎(chǔ)上，耗時(shí)長(zhǎng)，易延誤治療。近年來(lái)，利用分子生物學(xué)方法檢測(cè)耐藥的技術(shù)迅速發(fā)展，但大多選擇菌株進(jìn)行檢測(cè)，時(shí)效性較差。若能直接檢測(cè)患者標(biāo)本，則能及時(shí)得到藥敏結(jié)果，為患者制定個(gè)體化治療方案贏取寶貴時(shí)間。本研究應(yīng)用MeltPro技術(shù)對(duì)痰標(biāo)本直接進(jìn)行MTB異煙肼耐藥檢測(cè)，評(píng)價(jià)該方法直接對(duì)肺結(jié)核患者痰標(biāo)本進(jìn)行MTB異煙肼耐藥篩查的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2021年5月至2022年5月在北京市疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病門診就診的初治肺結(jié)核患者痰標(biāo)本，納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)結(jié)果MTB陽(yáng)性；（2）痰標(biāo)本量＞ 3 mL。對(duì)收集到的痰標(biāo)本進(jìn)行涂片鏡檢及分枝桿菌分離培養(yǎng)，培養(yǎng)陽(yáng)性菌株進(jìn)行異煙肼比例法藥敏檢測(cè)；用MeltPro技術(shù)及Hain試驗(yàn)對(duì)痰標(biāo)本直接進(jìn)行MTB異煙肼耐藥檢測(cè)。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 涂片鏡檢按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》［8］，選取適量痰標(biāo)本進(jìn)行涂片，隨后進(jìn)行萋-尼氏抗酸染色（染液由珠海貝索生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)），100倍油鏡下進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分級(jí)，即“陰性”、“1 ～ 8條/300視野”、“1+”、“2+”、“3+”、“4+”。

1.2.2 分枝桿菌分離培養(yǎng)按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》，吸取1 nL痰標(biāo)本放入前處理管中，加入1 ～ 2倍體積4% NaOH，旋緊處理管螺旋蓋，震蕩混勻，使痰標(biāo)本充分液化，室溫下靜置15 min后，均勻接種于酸性羅氏培養(yǎng)基（河南賽諾特生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)）上，每支0.1 ～ 0.15 mL，旋緊螺旋蓋，在（36 ± 1）℃孵育，直至長(zhǎng)出可視菌落，記錄生長(zhǎng)情況。培養(yǎng)8周無(wú)菌落生長(zhǎng)者報(bào)告“陰性”。

1.2.3 結(jié)核分枝桿菌比例法藥敏試驗(yàn)參照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》的結(jié)核分枝桿菌固體藥敏試驗(yàn)操作，使用細(xì)菌超聲分散計(jì)數(shù)儀BAC spreader 1100C（廣東希格生物科技有限公司）、中性羅氏培養(yǎng)基、含藥培養(yǎng)基（異煙肼，0.2 μg/nL），對(duì)培養(yǎng)陽(yáng)性菌株進(jìn)行異煙肼比例法藥敏試驗(yàn)，同時(shí)用對(duì)硝基苯甲酸/噻吩-2羥酸肼（PNB/TCH）培養(yǎng)基鑒定是否為結(jié)核分枝桿菌。所用培養(yǎng)基均由河南賽諾特生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。TCH培養(yǎng)基上有菌落生長(zhǎng)，PNB培養(yǎng)基上無(wú)菌落生長(zhǎng)者為結(jié)核分枝桿菌；PNB培養(yǎng)基上有菌落生長(zhǎng)，TCH培養(yǎng)基上無(wú)菌落生長(zhǎng)者為非結(jié)核分枝桿菌。耐藥百分比（%）=含藥培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落數(shù)/對(duì)照培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落數(shù)×100%。若耐藥百分比＞ 1%，則認(rèn)為受試菌對(duì)該藥耐藥。

1.2.4 MeltPro技術(shù)耐藥檢測(cè)使用廈門致善生物科技股份有限公司生產(chǎn)的結(jié)核分枝桿菌耐藥試劑盒，以及SLAN-96S Real-Time PCR System（上海宏石醫(yī)療科技有限公司）進(jìn)行MTB異煙肼耐藥檢測(cè)及結(jié)果分析。吸取1 mL痰標(biāo)本加入到50 mL圓底離心管內(nèi)，再加入1 ～ 2 mL前處理液（NALC-NaOH），室溫下震蕩混勻15 min，加入40 mL磷酸鹽緩沖液（PBS）中和離心（3 000 ×g離心18 min），棄上清，加1 mL的PBS進(jìn)行重懸沉淀，10 000 ×g離心1 min，棄上清。在沉淀中加入300 μL試劑盒中提供的TB-DNA提取液，90 ℃加熱10 min，10 000 ×g離心1 min，吸取上清液，得到結(jié)核分枝桿菌DNA。按說(shuō)明書要求配置PCR反應(yīng)液，在20 μL反應(yīng)液中加入5 μL結(jié)核分枝桿菌DNA，使用SLAN-96S Real-Time PCR System進(jìn)行MTB異煙肼的耐藥檢測(cè)及結(jié)果分析，反應(yīng)程序參照說(shuō)明書。通過(guò)比較所檢測(cè)樣本與陽(yáng)性對(duì)照樣本之間熔解曲線熔點(diǎn)（Tm）值的差異判斷樣本是否發(fā)生突變：樣本的熔點(diǎn)與陽(yáng)性對(duì)照的熔點(diǎn)一致，誤差不超過(guò)1 ℃時(shí)，判定為野生型，待檢樣本對(duì)所檢測(cè)藥物敏感；樣本的熔點(diǎn)低于陽(yáng)性對(duì)照2 ℃及以上時(shí)（ΔTm≥ 2 ℃），判定為突變型，待檢樣本對(duì)所測(cè)藥物耐藥。若結(jié)果為結(jié)核分枝桿菌未檢出或耐藥不明確，則檢測(cè)不成功，需重復(fù)檢測(cè)。

1.2.5 Hain試驗(yàn)用德國(guó)海因生命科學(xué)有限公司生產(chǎn)的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群及耐藥基因突變檢測(cè)試劑盒（PCR-線性雜交酶顯色法）試劑盒以及生物梅里埃公司的GT-Biot48結(jié)核分枝桿菌耐藥快速檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行Hain試驗(yàn)。將方法4中提取的結(jié)核分枝桿菌DNA 5 μL加入45 μL擴(kuò)增混合物中，按照說(shuō)明書的擴(kuò)增程序進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增完成后取20 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雜交，雜交過(guò)程包括化學(xué)變性、雜交孵育、洗滌、偶聯(lián)和顯色等。根據(jù)顯色結(jié)果進(jìn)行耐藥情況的判讀。判讀標(biāo)準(zhǔn)：所有野生條帶均顯色且突變條帶無(wú)顯色時(shí)為敏感；野生條帶缺失不顯色或突變條帶顯色為耐藥。

1.2.6 GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)儀及試劑盒由美國(guó)賽沛公司生產(chǎn)。按照GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)說(shuō)明書要求操作，取1 nL痰標(biāo)本置于螺旋蓋前處理管中，加入2倍體積的檢測(cè)樣品試劑，旋緊前處理管，室溫下振蕩混勻15 min，使痰標(biāo)本充分液化，打開(kāi)檢測(cè)匣，取2 mL處理后的樣品，由加樣孔緩慢加入檢測(cè)匣中，放置到檢測(cè)模塊，儀器開(kāi)始自動(dòng)化檢測(cè)。該技術(shù)針對(duì)rpoB基因81 bp利福平耐藥核心區(qū)間（RRDR）設(shè)計(jì)引物和探針，檢測(cè)其是否發(fā)生突變，用于輔助診斷是否為結(jié)核分枝桿菌，以及是否對(duì)利福平耐藥?；跇颖局蠱TB的Ct值，MTB結(jié)果以高、中、低和極低顯示，Ct值 ＜ 16為MTB含量高，Ct值在16 ～22之間為MTB含量中等，Ct值在22 ～ 28之間為MTB含量低，Ct值 ＞ 28為MTB含量極低。

1.3 質(zhì)量控制按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》相關(guān)規(guī)定，完成涂片鏡檢及分枝桿菌分離培養(yǎng)的質(zhì)量評(píng)估，項(xiàng)目質(zhì)量合格。藥敏試驗(yàn)所用培養(yǎng)基均用標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv進(jìn)行含藥培養(yǎng)基質(zhì)量控制。實(shí)驗(yàn)室每年參加中國(guó)疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室組織的藥敏試驗(yàn)熟練度測(cè)試，成績(jī)優(yōu)秀。MeltPro技術(shù)耐藥性檢測(cè)選用含有相應(yīng)野生型靶擴(kuò)增基因的質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照，既完成了結(jié)果的判讀，又保證了檢測(cè)的質(zhì)量。每次Hain試驗(yàn)都用標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv與其他標(biāo)本一起完成檢測(cè)。每個(gè)測(cè)試條都包含5個(gè)質(zhì)控條帶：（1）標(biāo)記物質(zhì)控帶：用于確認(rèn)探針試紙條上的標(biāo)記物結(jié)合情況及正確的顯色反應(yīng)；（2）擴(kuò)增質(zhì)控帶：用于確認(rèn)PCR擴(kuò)增反應(yīng)是否成功；（3）3個(gè)基因位點(diǎn)質(zhì)控帶，用于確認(rèn)每個(gè)基因位點(diǎn)反應(yīng)的最佳敏感度。GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)每個(gè)檢測(cè)匣包括樣本處理質(zhì)控（SPC），確保樣品經(jīng)過(guò)正確處理；以及探針檢查質(zhì)控（PCC），保證探針檢查合格。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料呈偏態(tài)分布時(shí)以［M（Q1，Q3）］描述，計(jì)數(shù)資料以“例數(shù)”和“百分率/構(gòu)成比（%）”描述，采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法及Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異的比較，以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以比例法藥敏結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算MeltPro技術(shù)檢測(cè)異煙肼的靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值和Kappa值。Kappa值用于一致性檢測(cè)，0 ～ 0.2為一致性極低，0.21 ～ 0.4為一致性一般，0.41 ～ 0.60為中等一致，0.61 ～ 0.80為基本一致，0.81 ～ 1.00為幾乎完全一致。

2 結(jié)果

2.1 一般情況本研究共收集157例MTB陽(yáng)性痰標(biāo)本，其中男115（73.2%）例，女42（26.8%）例。年齡范圍16 ～ 88歲，年齡中位數(shù)（四分位）為46（31，64）歲。157例MTB陽(yáng)性的痰標(biāo)本，經(jīng)分枝桿菌分離培養(yǎng)，獲得陽(yáng)性菌株130株，培養(yǎng)陽(yáng)性率為82.8%（130/157）。培養(yǎng)陰性19例，污染8例。污染率為5.1%（8/157）。130株陽(yáng)性菌株均進(jìn)行了比例法異煙肼藥敏試驗(yàn)。用MeltPro技術(shù)進(jìn)行異煙肼耐藥篩查，檢測(cè)成功132例，失敗25例，檢測(cè)成功率為84.1%（132/157）。Hain試驗(yàn)異煙肼耐藥檢測(cè)成功125例，失敗32例，檢測(cè)成功率為79.6%（125/157）。同時(shí)有MeltPro技術(shù)異煙肼耐藥檢測(cè)和比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果的115例；同時(shí)有Hain試驗(yàn)異煙肼耐藥檢測(cè)和比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果的109例。在27例培養(yǎng)陰性的標(biāo)本中，MeltPro技術(shù)檢測(cè)MTB異煙肼耐藥基因突變9例，敏感8例，檢測(cè)不成功10例。見(jiàn)圖1。

圖1 標(biāo)本檢測(cè)情況Fig.1 Sample testing process

2.2 痰標(biāo)本荷菌量對(duì)MeltPro技術(shù)耐藥檢測(cè)的影響157例MTB陽(yáng)性的痰標(biāo)本中，MeltPro技術(shù)異煙肼耐藥檢測(cè)成功的比例隨著痰涂片結(jié)果等級(jí)的升高而升高，各等級(jí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=24.169，P= 0.000）。見(jiàn)表1。檢測(cè)成功率也隨著GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌等級(jí)的升高而升高，各等級(jí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H= 27.763，P= 0.000），見(jiàn)表2。

表1 痰涂片不同等級(jí)與MeltPro技術(shù)異煙肼耐藥檢測(cè)成功的關(guān)系Tab.1 The relationship between different grades of sputum smear and the success of Isoniazid resistance detection by MeltPro technique例（%）

表2 GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)MTB不同等級(jí)與MeltPro技術(shù)異煙肼耐藥檢測(cè)的關(guān)系Tab.2 The relationship between the different grades of MTB detected by GeneXpert MTB/RIF and the detection of Isoniazid resistance by MeltPro technique例（%）

2.3 MeltPro技術(shù)異煙肼耐藥基因突變的檢測(cè)效能MeltPro技術(shù)的異煙肼耐藥檢出率為22.0%（29/132），Hain試驗(yàn)的異煙肼耐藥檢出率為15.3%（19/124），比例法的異煙肼耐藥檢出率為14.6%（19/130），三者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2= 2.997，P= 0.223）。

以比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果為金標(biāo)，MeltPro技術(shù)檢測(cè)異煙肼耐藥的靈敏度為84.6%（11/13），特異度為91.2%（93/102），陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為55%（11/20），陰性預(yù)測(cè)值為97.9%（93/95），MeltPro技術(shù)檢測(cè)異煙肼耐藥與比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果一致性Kappa值0.614，為基本一致。見(jiàn)表3。

表3 MeltPro技術(shù)和Hain 試驗(yàn)檢測(cè)異煙肼耐藥性的效能Tab.3 Efficacy of MeltPro technique and Hain test in detecting Isoniazid resistance

2.4 異煙肼耐藥基因突變情況157例（份）標(biāo)本中，MeltPro技術(shù)檢測(cè)異煙肼耐藥基因突變29例，Hain試驗(yàn)檢測(cè)異煙肼耐藥基因突變19例，具體突變位點(diǎn)見(jiàn)表4。異煙肼耐藥基因突變而比例法藥敏結(jié)果敏感的12例，耐藥基因無(wú)突變而比例法藥敏結(jié)果耐藥的7例。

表4 異煙肼耐藥突變位點(diǎn)及藥敏試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Isoniazid resistance mutation site and drug sensitivity test results

3 討論

表型藥敏試驗(yàn)包括固體藥敏和液體藥敏（MGIT960藥敏試驗(yàn)和優(yōu)化肉湯微孔板法藥敏試驗(yàn)）。固體藥敏試驗(yàn)需4周以上得到藥敏結(jié)果，液體藥敏試驗(yàn)也需要7 ～ 21 d才能得到結(jié)果，耗時(shí)均較長(zhǎng)［9］。MeltPro技術(shù)是一種快速檢測(cè)耐藥基因突變的方法，檢測(cè)利福平和異煙肼耐藥的試劑平均成本約200元/人份，耗時(shí)約3 h。大大縮短了檢測(cè)時(shí)間。2008年，WHO推薦使用第一代線性探針技術(shù)進(jìn)行快速耐多藥診斷［10］。Hain試驗(yàn)可同時(shí)檢測(cè)異煙肼和利福平耐藥情況，試劑平均成本約230元/人份，檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)約6 h。與之相比，MeltPro技術(shù)可同時(shí)檢測(cè)異煙肼、利福平、氟喹諾酮類藥物、鏈霉素及乙胺丁醇的耐藥情況，能更快篩查出MDR-TB及Pre-XDR-TB。為臨床醫(yī)生因人施治提供依據(jù)。

本研究選用157例MTB陽(yáng)性的痰標(biāo)本進(jìn)行MeltPro耐藥檢測(cè)，涂片陰性痰標(biāo)本檢測(cè)成功率64.8%，涂片1 ～ 8條/300視野痰標(biāo)本檢測(cè)成功率89.5%，涂片“1+”痰標(biāo)本檢測(cè)成功率89.7%，涂片“2+”痰標(biāo)本檢測(cè)成功率96.9%，涂片“3+”及“4+”痰標(biāo)本檢測(cè)成功率均100%，隨著涂片陽(yáng)性等級(jí)升高，檢測(cè)成功的比例相應(yīng)升高。涂片陽(yáng)性痰標(biāo)本檢測(cè)成功率較高，能獲得可靠的耐藥信息。與趙國(guó)連等［11］報(bào)告的結(jié)果基本一致。因此MeltPro技術(shù)可以直接用于痰標(biāo)本的耐藥檢測(cè)。該比例也隨GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)MTB等級(jí)的升高而升高。結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性等級(jí)達(dá)到“中”和“高”時(shí)，檢測(cè)成功率分別為95.8%和96.4%。本實(shí)驗(yàn)采用粗提法從痰標(biāo)本中提取結(jié)核分枝桿菌DNA，操作簡(jiǎn)便快捷，適用于基層實(shí)驗(yàn)室。但粗提法提取效能有限，不能保證DNA純度及濃度，可能會(huì)干擾耐藥檢測(cè)結(jié)果［12］。另外，病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果的敏感性與痰標(biāo)本質(zhì)量密切相關(guān)［13］，若能提高痰標(biāo)本質(zhì)量，勢(shì)必能提高M(jìn)eltPro技術(shù)的檢測(cè)效能。

在本研究中，MeltPro技術(shù)檢測(cè)異煙肼靈敏度為84.6%，特異度91.2%，敏感度高于劉春平等［14］報(bào)道的數(shù)據(jù)，特異度稍低（72.9%，100%）；與Hain試驗(yàn)相比較，敏感度較高，特異度稍低（55.6%，92.3%）；與比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果一致性比較，kappa0.614，為基本一致。

本研究中，在27例MTB陽(yáng)性但培養(yǎng)陰性、無(wú)法進(jìn)行傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)的標(biāo)本中，MeltPro技術(shù)檢測(cè)MTB異煙肼耐藥基因突變9例，敏感8例，檢測(cè)不成功10例。提示MeltPro技術(shù)對(duì)痰標(biāo)本直接進(jìn)行檢測(cè)，可為培養(yǎng)陰性結(jié)核病患者提供耐藥篩查結(jié)果，彌補(bǔ)了因無(wú)陽(yáng)性菌株造成藥敏結(jié)果缺失的不足。

本研究中，有些標(biāo)本的分子耐藥檢測(cè)與比例法藥敏結(jié)果不一致，均已進(jìn)行了重復(fù)實(shí)驗(yàn)。MeltPro技術(shù)檢測(cè)異煙肼耐藥與表型藥敏試驗(yàn)結(jié)果有19例不符，其中基因型檢測(cè)敏感而表型藥敏耐藥的7例，基因型耐藥突變而表型藥敏敏感12例。造成基因型和表型耐藥結(jié)果不符的原因可能有：（1）MeltPro技術(shù)檢測(cè)的基因突變的區(qū)域位點(diǎn)為ahpC啟動(dòng)子區(qū)（-40 ～ -30及-15 ～ 3位點(diǎn)），inhA94密碼子，inhA啟動(dòng)子區(qū)（-17 ～ -8）位點(diǎn)和KatG315密碼子區(qū)。除此之外，已知的異煙肼的耐藥突變位點(diǎn)還有fabGl、kasA、iniA/B/C、ndh、fadE、furA、Rvl592c和Rvl772及其啟動(dòng)子區(qū)等［15］。在KHAN等［16］的研究中，最常見(jiàn)的異煙肼突變位點(diǎn)為katG S315T，其次為fabG1-15C＞T（inhA啟動(dòng)子）和inhA-154G＞A。另外，CHEN等［17］對(duì)WHO提供的耐藥MTB菌株的數(shù)據(jù)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)雖然91%的異煙肼耐藥菌株存在已知的耐藥位點(diǎn)基因突變，仍有9%的耐藥菌株存在未知的突變位點(diǎn)。所以，造成本研究中出現(xiàn)7例樣本基因型敏感而表型藥敏結(jié)果耐藥的原因可能為存在該方法涵蓋的突變位點(diǎn)之外的耐藥基因突變。（2）根據(jù)說(shuō)明書中的陳述，MeltPro技術(shù)檢測(cè)異煙肼耐藥野生型的檢測(cè)限為2 × 103菌/nL，突變型檢測(cè)限為104菌/nL。本研究采用粗提法提取MTB的DNA，提取效能有限，可能造成核酸濃度低于該方法的檢測(cè)限，未能檢測(cè)到突變位點(diǎn)的存在，導(dǎo)致表型藥敏試驗(yàn)結(jié)果耐藥而基因型檢測(cè)結(jié)果為敏感。（3）抗菌藥物折點(diǎn)是用來(lái)判斷病原菌對(duì)藥物敏感、中介或耐藥的MIC值［18］，多年來(lái)，抗結(jié)核藥物的折點(diǎn)幾經(jīng)修訂，目前，中國(guó)和WHO推薦的異煙肼表型耐藥的折點(diǎn)為0.2 μg/mL，CLSI的推薦標(biāo)準(zhǔn)為0.25/1.0 μg/mL。一些耐藥相關(guān)基因會(huì)產(chǎn)生低水平耐藥［19］，本研究采用比例法藥敏檢測(cè)為標(biāo)準(zhǔn)，異煙肼耐藥培養(yǎng)基只有一個(gè)藥物濃度，可能導(dǎo)致表型耐藥而基因型檢測(cè)敏感。（4）若患者存在敏感菌和耐藥菌的混合感染，通常在培養(yǎng)過(guò)程中，敏感菌生長(zhǎng)優(yōu)于耐藥菌，導(dǎo)致培養(yǎng)物中耐藥菌的比例下降，出現(xiàn)表型結(jié)果假陰性［20］。后續(xù)可對(duì)菌株進(jìn)行MeltPro技術(shù)耐藥篩查，探討異質(zhì)性耐藥對(duì)分子耐藥檢測(cè)和表型藥敏結(jié)果的影響。（5）本研究中，基因型耐藥突變而表型藥敏敏感的比例為9.23%（12/130），龔蘭等［21］研究發(fā)現(xiàn)，9.79%的異煙肼敏感結(jié)核分枝桿菌株發(fā)生的katG、inhA基因突變，研究結(jié)果基本一致。本研究采用粗提法提取MTB的DNA，若能提高痰標(biāo)本質(zhì)量，并對(duì)粗提DNA進(jìn)行純化或采用提取效能高的方法或儀器進(jìn)行核酸的提取，可極大提高M(jìn)eltPro技術(shù)的檢測(cè)成功率。再者，對(duì)表型藥敏試驗(yàn)與分子耐藥結(jié)果不符合的標(biāo)本，應(yīng)進(jìn)一步行全基因組測(cè)序等檢測(cè)，分析不一致的原因；本研究受經(jīng)費(fèi)和課題時(shí)間的限制，耐藥標(biāo)本收集數(shù)量有限，在后續(xù)條件允許的情況下，將收集更多耐藥痰標(biāo)本進(jìn)行深入研究。

總體來(lái)說(shuō)，對(duì)GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)為MTB的肺結(jié)核患者，直接使用MeltPro技術(shù)對(duì)痰標(biāo)本進(jìn)行異煙肼耐藥篩查具有靈敏度高，特異性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，可縮短檢測(cè)時(shí)間，為臨床提供快速準(zhǔn)確的耐藥結(jié)果。同時(shí)，MeltPro技術(shù)對(duì)DNA的濃度及純度有較高要求，若能保證DNA濃度及純度，可以極大提高檢測(cè)的成功率。