氯普噻噸調(diào)節(jié)Akt/mTOR通路對人急性髓系白血病細胞自噬和凋亡的影響

王瑞娟 李超 段麗娟 尚淼 楊如玉

南陽市中心醫(yī)院血液內(nèi)科（河南南陽 473000）

急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）主要是造血細胞的惡性增殖，導致細胞無法正常分化、凋亡，從而誘發(fā)造血系統(tǒng)惡性疾病，患者預后和存活率較差［1-2］。自噬是一種細胞內(nèi)分解代謝途徑，在正常和病理生理條件下調(diào)節(jié)細胞穩(wěn)態(tài)［3］。在血液惡性腫瘤中，自噬參與癌前病變、癌細胞增殖及抑制等過程，是腫瘤治療中的一個關鍵靶標［4-6］。了解自噬如何影響AML腫瘤發(fā)生，選擇安全、有效的藥物治療對于疾病控制有較高意義。據(jù)報道，多巴胺受體在AML細胞中存在異常表達，多巴胺受體拮抗劑可作為抗白血病藥物［7］。氯普噻噸是一種常用的多巴胺受體拮抗劑，可誘導AML細胞凋亡和自噬，為AML的潛在治療藥物［8］；但具體機制尚不明確。蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）通路是調(diào)控自噬的重要通路，也是癌癥治療的關鍵靶標［9］；研究［10］顯示，激活Akt/mTOR通路可抑制細胞自噬和凋亡，并增加AML耐藥性。Akt/mTOR通路抑制劑可抑制AML細胞增殖，誘導細胞凋亡［11］。此外，有報道［12］顯示，多巴胺受體拮抗劑可通過AKT/mTOR通路誘導自噬發(fā)揮抗癌活性。但是氯普噻噸的抗AML作用是否與AKT/mTOR通路有關尚鮮見報道。因此，本研究基于Akt/mTOR通路探討了氯普噻噸對人AML細胞自噬和凋亡影響，以期明確氯普噻噸的治療機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞SKNO-1、MOLM-13細胞均購自中國細胞系上海細胞庫，產(chǎn)品編號分別為：BNCC340118、BNCC340568。

1.1.2 主要試劑與儀器氯普噻噸（常州亞邦制藥有限公司）；Akt激活劑SC79（美國Selleck公司，貨號：S786303）；Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（碧云天生物技術，貨號：C0038、C10621）；單丹磺酰尸胺（monodansylcadaverine，MDC）染色試劑盒（北京雷根生物技術有限公司，貨號：DA0041）；一抗兔源SQSTM1/p62、微管相關蛋白1輕鏈3B（LC3B）、聚腺苷酸二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（PARP）、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3（caspase3）、激活型caspase3（cleaved caspase3）、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、GAPDH，二抗羊抗兔（英國abcam公司，貨號：ab109012、ab63817、ab191217、ab32351、ab32042、ab179463、ab8805、ab134903、ab232486、ab9485、ab205718）。培養(yǎng)箱（濟南鑫貝西生物技術有限公司，型號：QP-80）；酶標儀（上海美谷分子儀器有限公司，型號：SpectraMax iD5）；流式細胞儀（貝克曼庫爾特，型號：cytoflex）；熒光顯微鏡（奧林巴斯，型號：CX33）；凝膠成像分析系統(tǒng)（北京中西華大科技有限公司，型號：CN61M）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)SKNO-1細胞采用90% IMDM+10%胎牛血清（FBS）培養(yǎng)液、MOLM-13細胞采用90% RPMI-1640+10% FBS培養(yǎng)液均在5%二氧化碳培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)。整個過程無菌操作，細胞均采用半量換液分瓶傳代，細胞傳2 ～ 3代進行實驗。

1.2.2 細胞分組及處理0、20、40、60 μmol/L氯普噻噸分別處理SKNO-1、MOLM-13 6、12、24 h，CCK-8檢測細胞活力及增殖抑制率情況。細胞分組：對照組、SC79組、氯普噻噸組、氯普噻噸+SC79組，對照組正常培養(yǎng)，SC79組添加終濃度為5 mg/L SC79處理細胞2 h，氯普噻噸組40 μmol/L氯普噻噸處理細胞12 h，氯普噻噸+SC79組在SC79組基礎上添加40 μmol/L氯普噻噸處理細胞12 h。

1.2.3 CCK-8檢測細胞增殖情況對數(shù)生長期SKNO-1、MOLM-13細胞稀釋至1 × 105個/mL，接種至96孔板中，每孔100 μL，添加終濃度為0、20、40、60 μmol/L的氯普噻噸，分別在5%二氧化碳培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)6、12、24 h時，添加10 μL CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，同時僅含完全培養(yǎng)液設為空白孔，酶標儀在450 nm處測吸光度（optical density，OD）值，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率（%）=（對照孔OD-實驗孔OD）/（對照孔OD-空白孔OD）×100%。

1.2.4 MDC染色檢測自噬的發(fā)生情況對數(shù)生長期SKNO-1、MOLM-13細胞稀釋至5 × 104個/mL，接種至96孔板中，參考1.2.2各組處理方法，添加0.05 mmol/L MDC染料，37 ℃孵育1 h，熒光顯微鏡（激發(fā)濾光片365 nm、阻斷濾光片430 nm）下觀察，隨機取100個細胞，計數(shù)含自噬小體細胞，并計算自噬小體陽性率。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡情況對數(shù)生長期SKNO-1、MOLM-13細胞接種至6孔板，每孔500 μL，參考1.2.4處理方法處理細胞，根據(jù)Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒說明書，加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液、5 μL Annexin V-FITC輕輕混勻，添加10 μL碘化丙啶染色液，繼續(xù)混勻，室溫下避光20 min后流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.6 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測自噬、凋亡、Akt/mTOR通路相關蛋白表達情況蛋白裂解液提取細胞總蛋白，BCA試劑盒測定總蛋白濃度，每孔上樣30 μg，凝膠電泳分離蛋白，經(jīng)PVDF轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉室溫封閉后，加入一抗SQSTM1/p62（1∶20 000）、LC3B（1∶10 000）、PARP（1∶1 000）、caspase3（1∶5 000）、cleaved caspase3（1∶500）、Akt（1∶5 000）、p-Akt（1∶500）、mTOR（1∶5 000）、p-mTOR（1∶2 000）、GAPDH（1∶5 000），4 ℃過夜孵育；加羊抗兔二抗（1∶5 000），室溫孵育2 h。電化學發(fā)光試劑顯影后，凝膠成像分析系統(tǒng)拍照和定量分析。

1.3 統(tǒng)計學方法采用GraphPad Prism 9.0進行統(tǒng)計學分析。計量數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差表示，多組間比較用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q法。以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 氯普噻噸對SKNO-1、MOLM-13細胞增殖的影響與0 μmol/L氯普噻噸相比，20、40、60 μmol/L氯普噻噸處理后細胞增殖抑制率升高（P＜ 0.05）；與20 μmol/L氯普噻噸相比，40、60 μmol/L氯普噻噸處理后細胞增殖抑制率升高（P＜ 0.05）；與40 μmol/L氯普噻噸相比，60 μmol/L氯普噻噸處理后細胞增殖抑制率升高（P＜ 0.05）。見表1。在同一時間點，隨著氯普噻噸濃度的升高，SKNO-1、MOLM-13細胞增殖抑制率升高；且隨著時間的延長，20、40、60 μmol/L氯普噻噸處理后SKNO-1、MOLM-13細胞增殖抑制率升高。40 μmol/L氯普噻噸處理12 h進行接下來研究。

表1 氯普噻噸對SKNO-1、MOLM-13增殖抑制率的影響Tab.1 Effects of cloprothixene on the proliferation inhibition rates of SKNO-1 and MOLM-13 ±s，%

表1 氯普噻噸對SKNO-1、MOLM-13增殖抑制率的影響Tab.1 Effects of cloprothixene on the proliferation inhibition rates of SKNO-1 and MOLM-13 ±s，%

注：與0 μmol/L氯普噻噸相比，*P ＜ 0.05；與20 μmol/L氯普噻噸相比，#P ＜ 0.05；與40 μmol/L氯普噻噸相比，△P ＜ 0.05

氯普噻噸濃度SKNO-1 MOLM-13 0 μmol/L 20 μmol/L 40 μmol/L 60 μmol/L F值P值24 h 3.83 ± 0.47 34.15 ± 5.15*64.49 ± 5.48*#79.85 ± 8.33*#△215.958 0.000 6 h 2.23 ± 0.56 13.46 ± 2.49*35.49 ± 6.25*#57.49 ± 8.16*#△128.278 0.000 12 h 2.45 ± 0.48 19.58 ± 2.56*48.29 ± 6.45*#77.56 ± 7.18*#△261.739 0.000 24 h 2.34 ± 0.51 39.56 ± 8.15*67.25 ± 8.48*#84.27 ± 9.13*#△138.469 0.000 6 h 3.75 ± 0.58 14.85 ± 2.73*30.68 ± 4.12*#48.95 ± 5.34*#△174.126 0.000 12 h 3.67 ± 0.49 19.35 ± 2.48*46.29 ± 4.16*#61.65 ± 7.13*#△182.066 0.000

2.2 氯普噻噸對SKNO-1、MOLM-13細胞中自噬小體的影響與對照組相比，SC79組自噬小體陽性率降低（P＜ 0.05），氯普噻噸組自噬小體陽性率升高（P＜ 0.05）；與SC79組相比，氯普噻噸+SC79組自噬小體陽性率升高（P＜ 0.05）；與氯普噻噸組相比，氯普噻噸+SC79組自噬小體陽性率降低（P＜ 0.05）。見圖1、表2。

圖1 MDC染色檢測SKNO-1、MOLM-13細胞中自噬小體情況（×400，×1 000）Fig.1 Autophagosome detection in SKNO-1 and MOLM-13 cells by MDC staining （×400，×1 000）

表2 氯普噻噸對SKNO-1、MOLM-13細胞中自噬小體陽性率的影響Tab.2 Influence of cloprothixene on positive rate of autophagosomes in SKNO-1 and MOLM-13 cells ±s，%

表2 氯普噻噸對SKNO-1、MOLM-13細胞中自噬小體陽性率的影響Tab.2 Influence of cloprothixene on positive rate of autophagosomes in SKNO-1 and MOLM-13 cells ±s，%

注：與對照組相比，*P ＜ 0.05；與SC79組相比，#P ＜ 0.05；與氯普噻噸組相比，△P ＜ 0.05

MOLM-13 24.68 ± 4.21 6.18 ± 0.73*73.25 ± 8.47*#47.36 ± 6.85*#△147.241 0.000組別對照組SC79組氯普噻噸組氯普噻噸+SC79組F值P值SKNO-1 11.86 ± 2.72 3.12 ± 0.46*62.58 ± 7.18*#27.26 ± 3.42*#△232.908 0.000

2.3 氯普噻噸對SKNO-1、MOLM-13細胞凋亡的影響與對照組相比，SC79組細胞凋亡率降低（P＜ 0.05），氯普噻噸組細胞凋亡率升高（P＜ 0.05）；與SC79組相比，氯普噻噸+SC79組細胞凋亡率升高（P＜ 0.05）；與氯普噻噸組相比，氯普噻噸+SC79組細胞凋亡率降低（P＜ 0.05）。見圖2、表3。

圖2 流式細胞術檢測SKNO-1、MOLM-13細胞凋亡情況Fig.2 Apoptosis of SKNO-1 and MOLM-13 cells was detected by flow cytometry

表3 氯普噻噸對SKNO-1、MOLM-13細胞凋亡率的影響Tab.3 Effects of cloprothixene on apoptosis rate of SKNO-1 and MOLM-13 cells ±s，%

表3 氯普噻噸對SKNO-1、MOLM-13細胞凋亡率的影響Tab.3 Effects of cloprothixene on apoptosis rate of SKNO-1 and MOLM-13 cells ±s，%

注：與對照組相比，*P ＜ 0.05；與SC79組相比，#P ＜ 0.05；與氯普噻噸組相比，△P ＜ 0.05

MOLM-13 11.36 ± 2.31 4.65 ± 0.62*43.68 ± 5.29*#29.86 ± 3.22*#△171.612 0.000組別對照組SC79組氯普噻噸組氯普噻噸+SC79組F值P值SKNO-1 13.86 ± 3.14 6.38 ± 1.23*57.86 ± 6.38*#35.46 ± 5.33*#△160.428 0.000

2.4 氯普噻噸對SKNO-1、MOLM-13細胞中SQSTM1/p62、LC3B、PARP、caspase3、cleaved caspase3、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表達的影響與對照組相比，SC79組SQSTM1/p62、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白水平升高（P＜ 0.05），LC3B、PARP、cleaved caspase3/caspase3蛋白水平降低（P＜ 0.05），氯普噻噸組SQSTM1/p62、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白水平降低（P＜ 0.05），LC3B、PARP、cleaved caspase3/caspase3蛋白水平升高（P＜ 0.05）；與SC79組相比，氯普噻噸+SC79組SQSTM1/p62、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白水平降低（P＜ 0.05），LC3B、PARP、cleaved caspase3/caspase3蛋白水平升高（P＜ 0.05）；與氯普噻噸組相比，氯普噻噸+SC79組SQSTM1/p62、p-Akt/Akt、pmTOR/mTOR蛋白水平升高（P＜ 0.05），LC3B、PARP、cleaved caspase3/caspase3蛋白水平降低（P＜ 0.05）。見圖3、表4、5。

圖3 蛋白免疫印跡檢測SKNO-1、MOLM-13細胞中SQSTM1/p62、LC3B、PARP、caspase3、cleaved caspase3、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表達情況Fig.3 Protein Western blot detection of SQSTM1/p62，LC3B，PARP，caspase3，cleaved caspase3，Akt，p-Akt，mTOR，p-mTOR protein expression in SKNO-1 and MOLM-13 cells

表4 氯普噻噸對SKNO-1細胞中SQSTM1/p62、LC3B、PARP、caspase3、cleaved caspase3、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表達的影響Tab.4 Effects of cloprothixene on expression of SQSTM1/p62，LC3B，PARP，caspase3，cleaved caspase3，Akt，p-Akt，mTOR，p-mTOR in SKNO-1 cells ±s

表4 氯普噻噸對SKNO-1細胞中SQSTM1/p62、LC3B、PARP、caspase3、cleaved caspase3、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表達的影響Tab.4 Effects of cloprothixene on expression of SQSTM1/p62，LC3B，PARP，caspase3，cleaved caspase3，Akt，p-Akt，mTOR，p-mTOR in SKNO-1 cells ±s

注：與對照組相比，*P ＜ 0.05；與SC79組相比，#P ＜ 0.05；與氯普噻噸組相比，△P ＜ 0.05

組別對照組SC79組氯普噻噸組氯普噻噸+SC79組F值P值p-mTOR/mTOR 0.85 ± 0.09 1.03 ± 0.11*0.43 ± 0.05*#0.69 ± 0.08*#△53.443 0.000 SQSTM1/p62 1.23 ± 0.15 1.75 ± 0.27*0.43 ± 0.05*#0.76 ± 0.08*#△75.987 0.000 LC3B 0.37 ± 0.05 0.16 ± 0.05*0.96 ± 0.11*#0.61 ± 0.07*#△128.618 0.000 PARP 0.49 ± 0.05 0.28 ± 0.09*1.09 ± 0.15*#0.83 ± 0.11*#△68.403 0.000 cleaved caspase3/caspase3 0.51 ± 0.09 0.09 ± 0.03*0.89 ± 0.13*#0.71 ± 0.09*#△83.388 0.000 p-Akt/Akt 0.81 ± 0.08 0.98 ± 0.09*0.41 ± 0.06*#0.66 ± 0.05*#△68.078 0.000

表5 氯普噻噸對MOLM-13細胞中SQSTM1/p62、LC3B、PARP、caspase3、cleaved caspase3、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表達的影響Tab.5 Effects of cloprothixene on expression of SQSTM1/p62，LC3B，PARP，caspase3，cleaved caspase3，Akt，p-Akt，mTOR and p-mTOR in MOLM-13 cells ±s

表5 氯普噻噸對MOLM-13細胞中SQSTM1/p62、LC3B、PARP、caspase3、cleaved caspase3、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表達的影響Tab.5 Effects of cloprothixene on expression of SQSTM1/p62，LC3B，PARP，caspase3，cleaved caspase3，Akt，p-Akt，mTOR and p-mTOR in MOLM-13 cells ±s

注：與對照組相比，*P ＜ 0.05；與SC79組相比，#P ＜ 0.05；與氯普噻噸組相比，△P ＜ 0.05

組別對照組SC79組氯普噻噸組氯普噻噸+SC79組F值P值p-mTOR/mTOR 1.04 ± 0.09 1.23 ± 0.16*0.57 ± 0.07*#0.88 ± 0.09*#△41.949 0.000 SQSTM1/p62 1.09 ± 0.12 1.28 ± 0.12*0.43 ± 0.06*#0.86 ± 0.11*#△72.288 0.000 LC3B 0.41 ± 0.05 0.26 ± 0.03*0.81 ± 0.09*#0.57 ± 0.09*#△67.786 0.000 PARP 0.41 ± 0.05 0.21 ± 0.03*0.97 ± 0.13*#0.74 ± 0.08*#△102.914 0.000 cleaved caspase3/caspase3 0.42 ± 0.06 0.24 ± 0.04*0.87 ± 0.11*#0.66 ± 0.09*#△71.646 0.000 p-Akt/Akt 0.73 ± 0.09 0.96 ± 0.11*0.23 ± 0.04*#0.46 ± 0.08*#△85.929 0.000

3 討論

白血病以異常造血細胞的惡性增殖、分化受阻、凋亡受到抑制為主要特征，其中AML是常見類型。隨著藥物研究的深入，研究［8］發(fā)現(xiàn)氯普噻噸在AML治療中表現(xiàn)出一定優(yōu)勢，氯普噻噸在白血病中能夠擾亂一些關鍵生物過程，如可影響細胞周期、細胞凋亡以及AML細胞自噬等，亦可減輕AML大鼠模型中腫瘤情況，推測氯普噻噸對于AML具有一定療效。以往研究中氯普噻噸作為硫雜蒽類藥物，具有鎮(zhèn)靜和抗嘔吐等作用，主要用于治療以抑郁、焦慮為主的精神分裂癥、情感精神病性抑郁癥等［13］，而惡性腫瘤易感性與精神壓力有關。

氯普噻噸作為多巴胺受體抑制劑，能夠阻斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)多巴胺通路中多巴胺受體從而發(fā)揮抗精神病作用，研究發(fā)現(xiàn)多巴胺受體拮抗劑可促進AMP活化蛋白激酶激活和調(diào)控癌細胞凋亡的關鍵因子，并可提高細胞自噬，影響細胞功能，參與癌癥進展［14-15］。在白血病中，自噬受損會加速正常造血干細胞向白血病干細胞惡化，激活自噬能提高白血病細胞藥物敏感性［16］。LC3在自噬中發(fā)揮重要作用，上調(diào)自噬相關蛋白LC3能夠誘導自噬小體形成，下調(diào)SQSTM1/p62蛋白表達能夠促進自噬流［17］。據(jù)報道，上調(diào)LC3-Ⅱ表達，抑制SQSTM1/p62表達可促進自噬體形成，進而對抗AML干細胞中的耐藥性［18］。caspase家族參與細胞凋亡過程，其中caspase3能夠剪切procaspase2、6、7、9，且可特異性剪切caspase底物PARP等，促進細胞凋亡［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，在AML細胞中添加不同濃度氯普噻噸處理（6、12、24 h），細胞增殖受到不同程度的抑制，且自噬小體陽性率、細胞凋亡率均出現(xiàn)明顯升高，表明氯普噻噸可促進AML細胞自噬和凋亡。進一步驗證自噬、凋亡相關蛋白表達情況，發(fā)現(xiàn)與對照組比較，氯普噻噸處理后自噬標志基因LC3B-Ⅱ蛋白水平升高、SQSTM1/p62蛋白水平降低，提示氯普噻噸可促進自噬小體和自噬流形成，激活自噬；同時氯普噻噸組促凋亡蛋白caspase3處于激活狀態(tài)，底物PARP處于高表達，進一步提示添加氯普噻噸可誘導細胞自噬，促進AML細胞凋亡。

Akt/mTOR通路抑制劑在AML治療中表現(xiàn)出良好的療效，作為自噬通路，激活該通路能夠抑制自噬發(fā)生，抑制該通路能夠誘導腫瘤細胞自噬性死亡［20］；Akt/mTOR通路同時影響細胞凋亡，抑制該通路可抑制AML細胞增殖、促進細胞凋亡［21］。在本研究中，氯普噻噸處理AML細胞后，Akt/mTOR通路蛋白磷酸化水平受到抑制；在氯普噻噸基礎上添加Akt激活劑SC79，Akt/mTOR通路蛋白磷酸化水平升高，且LC3B-Ⅱ、cleaved caspase3、PARP蛋白水平降低，SQSTM1/p62蛋白表達水平升高，自噬小體陽性率、細胞凋亡率降低，表明SC79可減弱氯普噻噸對AML細胞自噬和凋亡的促進作用；提示氯普噻噸通過抑制Akt/mTOR通路促進AML細胞自噬和凋亡，進而實現(xiàn)對疾病緩解。

綜上所述，氯普噻噸能夠抑制Akt/mTOR通路的表達，進而促進AML細胞自噬、凋亡，為氯普噻噸在AML治療中的應用提供一定參考。但添加Akt激活劑后并不能完全抵消氯普噻噸的作用，氯普噻噸可能通過別的相關通路發(fā)揮作用，需要進一步研究加以探討。