高效液相色譜法指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別的小金制劑質(zhì)量研究

于密密 范妙璇 李 錚 陳有根 傅欣彤 郭洪祝

(北京市藥品檢驗(yàn)研究院/國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中藥成分分析與生物評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京,102206)

小金制劑(小金丸、小金片、小金膠囊)原名小金丹,出自《外科證治全生集》,由麝香、木鱉子、制草烏、楓香脂、醋乳香、醋沒(méi)藥、五靈脂、酒當(dāng)歸、地龍和香墨組成,具有散結(jié)消腫、化瘀止痛的功效,用于陰疽初起、皮色不變、腫硬作痛、多發(fā)性膿腫、癭瘤、瘰疬、乳巖、乳癖等,是臨床治療乳腺增生的首選藥[1-2]。

中成藥是中藥復(fù)方制劑臨床應(yīng)用的主要形式,其質(zhì)量?jī)?yōu)劣直接影響臨床療效?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》2020年版規(guī)定了小金制劑的鑒別、雙酯型生物堿限量和麝香酮含量測(cè)定等項(xiàng)目。但小金制劑作為中藥復(fù)方,藥味種類眾多、組成復(fù)雜,包含貴細(xì)藥、樹(shù)脂樹(shù)膠類藥物、動(dòng)物藥、糞便類藥物、植物藥、礦物藥,其中不少藥物缺乏有效的質(zhì)量控制方法,僅限定小金制劑雙酯型生物堿含量、規(guī)定麝香酮含量的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)難以實(shí)現(xiàn)小金制劑的全面質(zhì)量評(píng)價(jià)[3-5]。

指紋圖譜具有整體性特點(diǎn),可在整體上表征中藥化學(xué)成分,是目前中藥制劑質(zhì)量一致性評(píng)價(jià)的有效手段之一[6-8]。指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別的方式可以實(shí)現(xiàn)中藥指紋圖譜的降維、分類和綜合分析,目前已應(yīng)用于中藥及中藥制劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)[9-10]。不同廠家、同廠家不同批次間藥品的質(zhì)量一致性是確保臨床療效穩(wěn)定可靠與臨床試驗(yàn)結(jié)果可重復(fù)的重要前提[11-20],本研究抽取全國(guó)16個(gè)不同廠家47批小金制劑樣品,采用高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)法建立小金制劑的指紋圖譜,結(jié)合主成分分析、聚類分析、正交偏最小二乘分析方法,考察不同廠家、不同批次小金制劑的質(zhì)量差異,為評(píng)價(jià)其產(chǎn)品的質(zhì)量和質(zhì)量一致性提供科學(xué)參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津LC-20A型高液相色譜儀(日本島津公司,日本,型號(hào):LC-20A型);電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器公司,型號(hào):CP225D);Milli-Q級(jí)超純水系統(tǒng)(默克股份有限公司,德國(guó),型號(hào):Advantage A10)。

1.2 試劑 甲醇為(色譜純,美國(guó)默克公司supelco,批號(hào):1150907120);水為超純水;乙醇(分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào)20190822)。藁本內(nèi)酯(純度100%,批號(hào):111737-201810),麝香(批號(hào):120982-200303)木鱉子(批號(hào):121418-200501),草烏(批號(hào):121338-201502),楓香脂(批號(hào):121637-201201),沒(méi)藥(批號(hào):120967-201706),五靈脂(批號(hào):121348-201202),地龍(批號(hào):120987-202109),乳香(批號(hào):120970-201806),當(dāng)歸(批號(hào):120927-201617),均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.3 分析樣品 47批小金制劑包括小金丸(大蜜丸,水蜜丸,小蜜丸)、小金片、小金膠囊;其中小金丸購(gòu)自14個(gè)廠家,共34批;小金膠囊購(gòu)自2個(gè)廠家,共9批;小金片購(gòu)自1個(gè)廠家,共4批,企業(yè)名稱分別用A～Q代替。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Kromasil C18(5 m,4.6 mm×250 mm);流動(dòng)相為甲醇(A)-水(B),梯度洗脫,洗脫條件見(jiàn)表1;檢測(cè)波長(zhǎng)為310 nm;流速1.0 mL/min。

表1 指紋圖譜梯度洗脫

2.2 對(duì)照藥材溶液制備 取麝香0.14 g,木鱉子、草烏、楓香脂、沒(méi)藥、五靈脂、地龍各0.6 g,乳香、當(dāng)歸各0.3 g,香墨0.06 g,精密稱定,精密加入乙醇25 mL,稱定重量,超聲處理45 min,取出,放冷,用乙醇補(bǔ)充減失重量,搖勻,用微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò),取續(xù)濾液,即得對(duì)照藥材溶液。

2.3 供試品溶液制備 取小金丸/膠囊3.0 g、小金片2.0 g,精密稱定,精密加入乙醇25 mL,稱定重量,超聲處理45 min,取出,放冷,用乙醇補(bǔ)充減失重量,搖勻,用微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò),取續(xù)濾液,即得供試品溶液。

2.4 藥材陰性溶液制備 按制劑工藝及“2.3”供試品溶液制備方法分別制備麝香或人工麝香、木鱉子、制草烏、楓香脂、醋乳香、醋沒(méi)藥、五靈脂、酒當(dāng)歸、地龍和香墨的陰性空白溶液。

2.5 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液(編號(hào)D1),按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件,連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄所得色譜圖,6次數(shù)據(jù)之間的相似度在0.996～1.000之間,說(shuō)明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液(編號(hào)D1),分別于配制后0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、24 h注入液相色譜儀,依法測(cè)定,6次進(jìn)樣數(shù)據(jù)的相似度均在0.996～1.000之間,說(shuō)明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品(編號(hào)D1)6份,按“2.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法平行操作,依法測(cè)定,所得圖譜結(jié)果經(jīng)指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)計(jì)算,6份樣品相似度在0.995～0.999之間,說(shuō)明重復(fù)性良好。

2.8 指紋圖譜的建立 47批小金制劑樣品按“2.3”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液,吸取10 μL,注入液相色譜儀,測(cè)定。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”軟件(2012)進(jìn)行色譜峰匹配,共標(biāo)定9個(gè)共有峰。將對(duì)照藥材圖譜和藥材陰性圖譜對(duì)比分析,根據(jù)各峰的保留時(shí)間,對(duì)所得的共有峰進(jìn)行歸屬,1、7、8、9號(hào)峰主要來(lái)自楓香脂,2號(hào)峰主要來(lái)自麝香,3號(hào)峰藁本內(nèi)酯來(lái)自當(dāng)歸,4號(hào)峰來(lái)自五靈脂中扁柏雙黃酮,5、6號(hào)峰來(lái)自乳香。

2.9 指紋圖譜相似度評(píng)價(jià) 將47批樣品的色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”進(jìn)行峰匹配,生成對(duì)照指紋圖譜。見(jiàn)圖1。將47批次不同廠家的小金制劑(丸、片、膠囊)指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。見(jiàn)表2。不同廠家的小金制劑及小金制劑各批次之間均具有一定的差異,個(gè)別廠家差異較大。見(jiàn)圖2～3。

圖1 小金制劑對(duì)照指紋圖譜

圖2 小金制劑丸(J42、J49、J27、J3、J9、J45)相似度低的指紋圖譜

圖3 小金制劑膠囊(J54、J8、J25)相似度低的指紋圖譜

表2 小金制劑相似度檢驗(yàn)結(jié)果

2.10 指紋圖譜聚類分析 分析結(jié)果顯示,當(dāng)組距為10時(shí),47批小金制劑可以分為3類,第一類包括16批,第二類包括25批,第三類包括6批。見(jiàn)圖4。

圖4 聚類分析樹(shù)狀圖

2.11 指紋圖譜主成分分析 以47批小金制劑指紋圖譜中的9個(gè)共有峰為變量,運(yùn)用SPSS 22.0數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)47批小金制劑指紋圖譜進(jìn)行主成分分析,根據(jù)特征值和貢獻(xiàn)率選出主成分。見(jiàn)表3。以特征值>1為標(biāo)準(zhǔn),提取出的主成分有3個(gè),其累積貢獻(xiàn)率為77.5%,包含了原有47批小金制劑指紋圖譜的主要信息,矩陣結(jié)果見(jiàn)表4。第1主成分信息量最大,峰1、6、7在第1主成分中有明顯的載荷值，峰3、4在第2主成分中有明顯的載荷值，峰6、8在第3主成分中有明顯的載荷值，利用SIMCA 14.1軟件繪制主成分分析得分。由主成分分析得分圖可知，47批小金制劑樣品明顯分布于3個(gè)區(qū)域，表明47批次小金制劑樣品可以被分為3類。見(jiàn)圖5。

表3 特征值與方差貢獻(xiàn)率

表4 初始因子載荷矩陣

2.12 指紋圖譜偏最小二乘判別分析 將47批小金制劑樣品的9個(gè)共有峰面積導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件中,獲得相應(yīng)模型。見(jiàn)圖6。根據(jù)模型中變量權(quán)重要性排序預(yù)測(cè)值來(lái)篩選具有統(tǒng)計(jì)意義的差異標(biāo)志物,在0.95的置信區(qū)間內(nèi),選出變量權(quán)重要性排序>1.0的色譜峰為差異標(biāo)志物,峰3、1、5、4的變量權(quán)重要性排序值分別為1.35、1.14、1.10、1.10,均大于1。

3 討論

3.1 色譜條件優(yōu)化 為了更全面的檢測(cè)小金制劑中各類化學(xué)成分,采用二極管陣列檢測(cè)器采集190～400 nm波長(zhǎng)的色譜圖,并串聯(lián)蒸發(fā)光檢測(cè)器進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)。經(jīng)分析比較多次實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),采用二極管陣列檢測(cè)所得到的色譜峰的信息遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(Evaporative Light Scattering Detector,ELSD)檢測(cè)所得到的結(jié)果;同時(shí)比較分析了不同檢測(cè)波長(zhǎng)下的色譜圖,綜合考察色譜峰數(shù)量、分離度等因素,最后以310 nm為指紋圖譜檢測(cè)波長(zhǎng)。流動(dòng)相組成考察了甲醇-水系統(tǒng)和乙腈-水系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示甲醇-水系統(tǒng)中各藥味成分的色譜峰分離效果較好,且有較穩(wěn)定的表現(xiàn),最終確定采用甲醇-水系統(tǒng)。同時(shí),對(duì)色譜柱類型進(jìn)行了考察。比較了Phenomenex Luna C18(5 μm,4.6 mm×250 mm)、Discovery C18(5 μm,4.6 mm×250 mm)、Gemini 110A(5 μm,4.6 mm×250 mm)、CAPCELLPAK C18(5 μm,4.6 mm×250 mm)等不同類型的色譜柱,結(jié)果顯示采用Kromasil C18(5 μm,4.6 mm×250 mm)進(jìn)行分離時(shí),色譜峰分離效果最好。故選用此色譜柱。

3.2 提取溶劑及提取方法的選擇 分別采用50%乙醇、70%乙醇、乙醇、甲醇作為考察溶劑,以色譜峰數(shù)量、峰面積等因素為考察指標(biāo),結(jié)果顯示,采用乙醇和甲醇作為提取溶劑時(shí),色譜峰數(shù)量最多,峰面積較大。故選用乙醇提取。

3.3 主要色譜峰的分析 我們建立指紋圖譜的過(guò)程中,嘗試采用20多種對(duì)照品對(duì)共有峰進(jìn)行指認(rèn)并進(jìn)行藥材來(lái)源歸屬,采用化學(xué)模式進(jìn)行識(shí)別分析,表明峰3、1、5、4可作為鑒別和區(qū)分小金制劑的質(zhì)量標(biāo)志物。指認(rèn)了峰3和峰4,分別為來(lái)自當(dāng)歸的藁本內(nèi)酯和來(lái)自五靈脂的扁柏雙黃酮,盡管1,5號(hào)峰尚未進(jìn)行指認(rèn),但確認(rèn)了藥味來(lái)源分別為楓香脂和乳香。來(lái)自于楓香脂的7、8、9號(hào)色譜峰,峰面積最大,對(duì)指紋圖譜相似度的數(shù)據(jù)結(jié)果影響最大,均提示楓香脂可能是影響小金制劑質(zhì)量差異的主要因素。對(duì)小金制劑的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)仍然具有較強(qiáng)的意義。

3.4 數(shù)據(jù)分析 聚類分析是將收集到的數(shù)據(jù)歸類的統(tǒng)計(jì)方法,通過(guò)聚類分析可以將所得數(shù)據(jù)進(jìn)行歸類,并從分類依據(jù)可以反映一類樣本的主要特征。分析結(jié)果可知,同一廠家的同一劑型產(chǎn)品,聚類情況差異較大。有的廠家相同劑型的產(chǎn)品聚類較為集中,如J5、J17、18、J29、J30、J32、J33為來(lái)自同一廠家的丸劑,分別聚集在第一類和第三類,反映同一廠家、同一劑型不同批次產(chǎn)品,質(zhì)量穩(wěn)定性較好,但仍存在一定差異;此外,不同廠家生產(chǎn)的同一劑型產(chǎn)品,未呈現(xiàn)明顯聚類趨勢(shì),如J5、J55、J32為源自不同廠家的丸劑,分別聚集在第一類、第二類和第三類,反映了不同廠家同一劑型的小金制劑產(chǎn)品質(zhì)量存在較大差別。因此,尋找小金制劑的質(zhì)量差異性成分,建立穩(wěn)定、可靠的質(zhì)量控制方法是非常必要的。

主成分分析能夠?qū)⒃卸鄠€(gè)指標(biāo)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成一組新的相互無(wú)關(guān)的幾個(gè)綜合變量(主成分),全面反映原始多個(gè)數(shù)據(jù)的信息,能反映小金制劑的基本特征。載荷的絕對(duì)值越大,對(duì)主成分的貢獻(xiàn)越大,表明影響小金制劑質(zhì)量差異性的是多個(gè)成分,而不是單一成分。

為進(jìn)一步尋找上述3類型批次之間產(chǎn)生的差異性主要標(biāo)志物,采用偏最小二乘判別分析對(duì)小金制劑樣品進(jìn)行分析。更加準(zhǔn)確地反映小金樣品的成分差異,并通過(guò)VIP值篩選出其中的差異性化學(xué)成分,為后續(xù)的含量測(cè)定提供參考。

采用聚類分析、主成分分析和偏最小二乘判別分析化學(xué)模式識(shí)別分析方法,對(duì)小金制劑指紋圖譜研究結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析。47批小金制劑樣品分成了3類,并篩選出4個(gè)差異性質(zhì)量標(biāo)志物,作為小金制劑質(zhì)量差異的指標(biāo)。同一劑型的個(gè)別的廠家聚類不統(tǒng)一,說(shuō)明小金制劑質(zhì)量的差異性,可見(jiàn)建立穩(wěn)定、可靠的質(zhì)量控制方法是非常必要的。

3.5 質(zhì)量評(píng)價(jià) 47批小金制劑指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)果顯示,不同廠家、不同批次的小金制劑相似度高于0.90占62%,說(shuō)明小金制劑大部分一致性較好,個(gè)別批次個(gè)別廠家存在質(zhì)量一致性問(wèn)題。其中代碼E、J、H、Q廠家指紋圖譜和對(duì)照指紋圖譜差異較大,相似度較低。從指紋圖譜可以宏觀地看出質(zhì)量差的產(chǎn)品。部分同一生產(chǎn)企業(yè)不同批次的產(chǎn)品相似度也有較大差異,說(shuō)明產(chǎn)品批間質(zhì)量不均一,或存在投料不規(guī)范,藥材質(zhì)量差的問(wèn)題。這些現(xiàn)象說(shuō)明小金制劑在整體質(zhì)量控制方面還存在一些不足。我們希望在現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上,采用更為全面科學(xué)的、符合中藥特點(diǎn)的質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)方法,來(lái)系統(tǒng)表征中藥質(zhì)量。最終服務(wù)于藥品生產(chǎn)和質(zhì)量評(píng)價(jià)和控制。也是中藥藥品質(zhì)量發(fā)展的必然趨勢(shì)。

利益沖突聲明:無(wú)。