實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在肉及肉制品中的運(yùn)用

張麗華

（赤峰工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古自治區(qū) 赤峰 024000）

肉及肉制品在加工、儲(chǔ)存、運(yùn)輸?shù)拳h(huán)節(jié)都有可能被致病細(xì)菌或微生物污染。為切實(shí)保障消費(fèi)者的健康安全，相關(guān)部門需要對(duì)肉及肉制品取樣檢測(cè)，以判斷致病細(xì)菌和微生物的數(shù)量是否超過(guò)了相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定數(shù)值，如果檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)致病細(xì)菌或微生物的數(shù)量超標(biāo)，則不允許肉及肉制品進(jìn)行銷售。目前常用的細(xì)菌培養(yǎng)法、血清學(xué)鑒定法等檢測(cè)方法，雖然也能檢測(cè)出樣品中致病細(xì)菌和微生物的數(shù)量，但是存在精度不夠高、花費(fèi)時(shí)間多等弊端。相比之下，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)則可以快速、準(zhǔn)確地完成肉及肉制品中致病細(xì)菌和微生物的測(cè)定。例如，有學(xué)者使用TaqMan MGB探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，直接從樣品中檢測(cè)呼吸道纖毛桿菌的DNA，檢測(cè)用時(shí)僅為30 min。文章就實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在肉及肉制品中的運(yùn)用展開了試驗(yàn)分析。

1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)原理

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是將能夠發(fā)出熒光信號(hào)的熒光基因，加入到PCR反應(yīng)體系中，然后通過(guò)熒光信號(hào)的積累實(shí)現(xiàn)對(duì)PCR過(guò)程的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，最后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板展開定量分析。根據(jù)選用熒光材料的不同，具體又可以分為熒光染料和熒光探針等多種類型。這里以TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)為例，簡(jiǎn)要概述其原理。TaqMan探針實(shí)際上是單鏈DNA的一個(gè)片段，含有一個(gè)報(bào)告基因和一個(gè)猝滅基因。其中，報(bào)告基團(tuán)位于TaqMan探針的5′端，猝滅基因則位于TaqMan探針的3′端。在PCR擴(kuò)增環(huán)節(jié)，Taq酶作為一種DNA聚合酶，在具備較強(qiáng)活性的情況下，能夠讓脫氧核苷酸聚合形成脫氧核苷酸鏈。在這一過(guò)程中，3′→5′外切酶活性將熒光探針降解，位于探針上的報(bào)告基團(tuán)也隨即變成游離基團(tuán)，并發(fā)出熒光信號(hào)。此時(shí)，熒光檢測(cè)系統(tǒng)可以接收并積累熒光信號(hào)。根據(jù)熒光信號(hào)即可完成對(duì)特定物質(zhì)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。

在肉及肉制品的成分檢測(cè)中，研究人員通常選用線粒體D-loop區(qū)的622～704片段中的DNA鏈制作TaqMan探針。這時(shí)因?yàn)榫€粒體基因具有含量多、分裂快、靈敏度高等特點(diǎn)，使用這種TaqMan探針可以精確測(cè)定加工肉制品中豬肉的含量，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果可以判定是否存在豬肉摻假的情況。例如，有研究人員以超市售賣的羊肉丸作為樣品，使用TaqMan探針對(duì)線粒體中的Cytb進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)出樣品中豬肉含量為0.01%，說(shuō)明不存在用豬肉仿冒羊肉的情況。

2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在肉及肉制品污染物檢測(cè)中的應(yīng)用

2.1 材料與方法

2.1.1 樣品來(lái)源

本次試驗(yàn)從農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、連鎖超市選取83份肉及肉制品樣品，其中：牲畜類（包括生豬肉、生牛肉、生羊肉3種）樣品共36份，家禽類樣品共20份，鮮凍水產(chǎn)品15份，熟肉制品10份。

2.1.2 試驗(yàn)儀器與試劑

本次試驗(yàn)使用到的主要儀器為MX3000P型實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)儀，F(xiàn)S-200型高速離心機(jī)?？捎糜跈z測(cè)多種常見細(xì)菌（如沙門菌、金黃色葡萄球菌、空腸彎曲菌等）的Real-time Q-PCR檢測(cè)試劑盒，以及顯色培養(yǎng)基、SS平板。

2.1.3 檢測(cè)方法

為了驗(yàn)證實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在肉及肉制品污染物檢測(cè)中的應(yīng)用效果，文章設(shè)計(jì)了對(duì)照試驗(yàn)。對(duì)照組采用細(xì)菌培養(yǎng)法，測(cè)定樣品中沙門菌、金黃色葡萄球菌、空腸彎曲菌、副溶血性弧菌這4類細(xì)菌的數(shù)量。這里以沙門菌為例，培養(yǎng)方法為：將低溫保存的菌種放到室溫下進(jìn)行解凍，在解凍期間將準(zhǔn)備好的樣品放入高營(yíng)養(yǎng)、無(wú)選擇性的培養(yǎng)基中。將解凍后的菌種放入培養(yǎng)基，使環(huán)境溫度升高至37 ℃，提供一個(gè)有利于沙門菌復(fù)蘇與生長(zhǎng)的理想環(huán)境。然后開始增菌操作，將菌種分別轉(zhuǎn)移到各自適宜的培養(yǎng)平板上進(jìn)行增殖。設(shè)定增殖時(shí)間為24 h，之后對(duì)增殖的菌種做分純處理，保證沙門菌的純度。再將分純后的細(xì)菌用生理鹽水制備成菌懸液，以備鑒定使用。其他污染物的鑒定分別參照《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)》（GB/T4789.10-2008）中的有關(guān)規(guī)定進(jìn)行，不再贅述。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的檢測(cè)方法如下：

（1）核酸提取。用膠頭滴管吸取2.0 ml的樣本增菌液，置于5 ml的滅菌EPP管中。將EPP管放入高速離心機(jī)，設(shè)定轉(zhuǎn)速為12 500 r/min，離心時(shí)間為90 s，使樣本增菌液充分振蕩均勻。然后吸取并去掉上層清液，只保留底部沉淀。向沉淀中加入180 μl的DNA提取液，重新放入高速離心機(jī)，按照同樣的參數(shù)進(jìn)行處理。將混合均勻的混合物放入100℃的沸水中水浴10 min，最后置于高速離心機(jī)中，以12 500 r/min的轉(zhuǎn)速處理5 min，之后吸取10 μl的上層清液，做PCR反應(yīng)。

（2）PCR反應(yīng)。使用實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)。參照Real-time Q-PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書的內(nèi)容，制作進(jìn)行PCR反應(yīng)所需的混合液，并設(shè)置循環(huán)參數(shù)。分別設(shè)定了陽(yáng)性和隱性梯度模板，作為對(duì)照。

（3）特異性檢測(cè)。將臨床分離鑒定的沙門菌、金黃色葡萄球菌、空腸彎曲菌和副溶血性弧菌，各取5株作為檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，分析實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒的特異性。

（4）參考試劑盒說(shuō)明書，將陽(yáng)性菌種進(jìn)行10倍梯度稀釋，與樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將未進(jìn)行稀釋的陰性菌種以平板培養(yǎng)法進(jìn)行擴(kuò)增，兩者進(jìn)行對(duì)照。同時(shí)觀測(cè)試劑盒的靈敏度。

2.2 肉及肉制品污染物的檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果

在83份肉及肉制品的樣品中，共檢測(cè)出6株沙門菌，陽(yáng)性率為7.23%；檢測(cè)出5株金黃色葡萄球菌，陽(yáng)性率為6.02%；檢測(cè)出2株副溶血性弧菌，陽(yáng)性率為2.41%；未檢測(cè)到空腸彎曲菌。

2.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果

在83份肉及肉制品的樣品中，共檢測(cè)出17株沙門菌，陽(yáng)性率為20.48%；檢測(cè)出11株金黃色葡萄球菌，陽(yáng)性率為13.25%；檢測(cè)出8株副溶血性弧菌，陽(yáng)性率為9.64%；檢測(cè)到3株空腸彎曲菌，陽(yáng)性率為3.61%。

2.2.3 PCR的特異性與靈敏度

使用Real-time Q-PCR檢測(cè)試劑盒對(duì)臨床分離的4種細(xì)菌（各5株）進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示特異性均為100%，沒有出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性。說(shuō)明本次試驗(yàn)所用的Real-time Q-PCR檢測(cè)試劑盒具有良好的特異性，檢測(cè)結(jié)果可靠。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)10倍梯度稀釋的陽(yáng)性菌種進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示最低可檢測(cè)到100 copoes/ml濃度的核酸樣本，其檢測(cè)靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于常規(guī)的細(xì)菌培養(yǎng)法。

2.3 檢測(cè)結(jié)果分析

對(duì)比細(xì)菌培養(yǎng)法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的檢測(cè)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，后者的檢測(cè)精度更高。以沙門菌為例，在肉及肉制品的樣品數(shù)量相同的情況下，使用細(xì)菌培養(yǎng)法僅檢測(cè)到6株沙門菌，陽(yáng)性率為7.23%；而使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了17株沙門菌，陽(yáng)性率為20.48%，檢測(cè)精度提高了將近3倍。另外，使用常規(guī)的細(xì)菌培養(yǎng)法，未能從肉及肉制品的樣品中檢測(cè)出空腸彎曲菌；而使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR則檢測(cè)到3株空腸彎曲菌。

另外，在本次實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試驗(yàn)中，每一種肉及肉制品都發(fā)現(xiàn)了沙門菌。其中，牲畜類樣品中檢測(cè)到沙門菌8株，家禽類樣品中檢測(cè)到沙門菌5株，鮮凍水產(chǎn)品中檢測(cè)到沙門菌3株，熟肉制品中檢測(cè)到沙門菌1株。另外，金黃色葡萄球菌和副溶血性弧菌的檢出率也比較高，這也在一定程度上表明本地肉及肉制品的細(xì)菌和微生物污染問題比較嚴(yán)重，容易發(fā)生消費(fèi)者食物中毒事件?；诖耍斜匾茝V使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出肉及肉制品中治病細(xì)菌和微生物的濃度，及時(shí)處理被污染的肉及肉制品，從而有效預(yù)防食源性疾病的發(fā)生。

3 討論

3.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)

肉及肉制品在加工、儲(chǔ)藏、運(yùn)輸、銷售等環(huán)節(jié)，都有可能受到細(xì)菌、微生物的污染。當(dāng)細(xì)菌、微生物的數(shù)量達(dá)到一定程度后，即可對(duì)食用者的健康安全構(gòu)成威脅。為確保食品安全，需要對(duì)肉及肉制品的污染物進(jìn)行檢測(cè)。常規(guī)的檢測(cè)方法是細(xì)菌培養(yǎng)法，其操作流程包括前增菌、選擇性培養(yǎng)基再次增菌、平板培養(yǎng)、菌落分離物檢測(cè)等多個(gè)環(huán)節(jié)。應(yīng)用細(xì)菌培養(yǎng)法進(jìn)行肉及肉制品的污染物檢測(cè)，不僅操作較為繁瑣，而且需要3～5 d才能得出檢測(cè)結(jié)果。這種情況下檢測(cè)結(jié)果中的污染物數(shù)量，與當(dāng)前肉及肉制品上污染物的數(shù)量存在明顯差異，因此檢測(cè)結(jié)果的參考價(jià)值不高。除此之外，由于操作過(guò)程中很難做到全程無(wú)菌，結(jié)果假陽(yáng)性的情況也比較常見。

相比之下，文章所述的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在肉及肉制品污染物檢測(cè)中則表現(xiàn)出明顯的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，主要表現(xiàn)為以下幾點(diǎn)：其一，操作流程相對(duì)簡(jiǎn)便。如上所述，基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的污染物檢測(cè)只需要核酸提取、PCR反應(yīng)、特異性檢測(cè)等幾個(gè)步驟，操作十分簡(jiǎn)單；其二，使用專門的Real-time Q-PCR檢測(cè)試劑盒可以快速得出沙門菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌等常見細(xì)菌的濃度，并且試驗(yàn)結(jié)果表明檢測(cè)結(jié)果的靈敏度可以得到100 copoes/ml，完全能夠滿足日常肉及肉制品污染物檢測(cè)的要求；其三，檢測(cè)周期短，一般只需要3～5 h即可得出檢測(cè)結(jié)果。近幾年，隨著分子信標(biāo)技術(shù)的成熟發(fā)展，使得PCR技術(shù)檢測(cè)污染物的效率也得到了進(jìn)一步的提升。在整個(gè)檢測(cè)過(guò)程中，除了增菌后需要1～2 h左右的前處理，以及1 h左右的結(jié)果分析外，試驗(yàn)中的其他操作只需要幾分鐘或十幾分鐘就可以完成。這樣一來(lái)，就可以保證檢測(cè)結(jié)果具有更高的可信度，為肉及肉制品的處理提供了數(shù)據(jù)支持和科學(xué)依據(jù)。目前，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)已經(jīng)成為快速檢測(cè)肉類、蔬菜類食品中致病細(xì)菌和微生物的一種常用檢測(cè)技術(shù)。

3.2 應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的注意事項(xiàng)

從整體上來(lái)看，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)因?yàn)榫哂徐`敏度高、特異性好、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，在真假肉制品的鑒定，以及肉及肉制品治病微生物的檢測(cè)等方面得到了廣泛應(yīng)用。但是要想真正發(fā)揮這一技術(shù)的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，還必須注意以下幾點(diǎn)：

首先，肉及肉制品的前處理是一道不能忽視的重要步驟。根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的檢測(cè)原理可知，在檢測(cè)樣品中所有治病細(xì)菌和微生物時(shí)，無(wú)法準(zhǔn)確區(qū)分死菌和活菌。如果將死菌也計(jì)算在內(nèi)，可能會(huì)導(dǎo)致實(shí)際檢測(cè)出的治病細(xì)菌和微生物的數(shù)量，要高于真實(shí)情況，從而導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度下降。通過(guò)開展肉及肉制品的前處理（如離心振蕩、提取上清液等），可以有效去除樣本中的死菌，從而使最終的檢測(cè)結(jié)果有更高的靈敏度。

其次，必須選用正確的Real-time Q-PCR檢測(cè)試劑盒，才能保證檢測(cè)結(jié)果有良好的特異性。Realtime Q-PCR檢測(cè)試劑盒具有很強(qiáng)的單一性，即每一種試劑盒只能檢測(cè)出特定的某種細(xì)菌或微生物。例如，使用沙門菌核酸Real-time Q-PCR檢測(cè)試劑盒，只能檢測(cè)出肉及肉制品中含有的沙門菌的數(shù)量；使用金黃色葡萄球菌核酸Real-time Q-PCR檢測(cè)試劑盒，只能檢測(cè)出肉及肉制品中含有的黃色葡萄球菌的數(shù)量。文章主要針對(duì)肉及肉制品中的沙門菌、黃色葡萄球菌、空腸彎曲菌和副溶血性弧菌4種致病細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè)，因此需要準(zhǔn)備4種相應(yīng)的試劑盒。

最后，需要保證酶有較強(qiáng)的活性，才能提高檢測(cè)結(jié)果的精確性。熒光探針雖然具有較強(qiáng)的靈敏性和特異性，但是探針的水解十分依賴酶的活性，兩者之間為正相關(guān)。在應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)時(shí)，需要選擇活性較高的酶，保證熒光探針的水解更加充分、徹底，這樣才能以更快的速度，得到更加精確的檢測(cè)結(jié)果。

4 結(jié)語(yǔ)

在肉及肉制品的污染物檢測(cè)中，相比于常規(guī)的細(xì)菌培養(yǎng)法、血清學(xué)鑒定法，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)無(wú)論是在靈敏度、特異性，還是檢測(cè)用時(shí)或操作要求上，均表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)。檢測(cè)人員除了要熟悉操作步驟，還要做好樣品的前處理，以及保證酶活性，才能讓檢測(cè)結(jié)果更加可靠、可行，從而切實(shí)保障肉及肉制品的食用安全。