瘤果黑種草籽和家黑種草籽無機(jī)溶劑提取物中揮發(fā)性成分比較

韓陽陽,劉樹森,廖成松,石華玉

(1.錫林郭勒盟農(nóng)畜產(chǎn)品檢驗檢測中心,內(nèi)蒙古錫林浩特 026000;2.錫林郭勒職業(yè)學(xué)院,內(nèi)蒙古錫林浩特 026000;3.錫林郭勒職業(yè)學(xué)院褐煤及伴生資源清潔生產(chǎn)與利用重點實驗室,內(nèi)蒙古錫林浩特 026000;4.內(nèi)蒙古綠草堂藥業(yè)有限責(zé)任公司,內(nèi)蒙古太卜寺旗 027000)

黑種草是毛茛科黑種草屬一年生草本植物,主要包括瘤果黑種草和家黑種草2種,其中有藥用價值的是瘤果黑種草和家黑種草[1]。黑種草籽常見于我國傳統(tǒng)民族藥方劑中,在我國有悠久的藥用歷史,含黑種草的方劑具有平喘、抗炎、抗氧化、助消化等功效[2-5],現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實還具有抗腫瘤、降血糖、抗神經(jīng)性疾病等作用[6-9]。提取溶劑對黑種草籽提取成分種類和含量有明顯差異,也將直接影響黑種草籽的藥用效果?，F(xiàn)研究中多用有機(jī)試劑提取黑種草籽,但黑種草籽用于民族藥方劑中多數(shù)為水煎或丸劑的方式服用,該研究對瘤果黑種草籽和家黑種草籽水和弱酸提取物中揮發(fā)成分進(jìn)行比對,為不同藥理作用的黑種草籽方劑有效藥用方式提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器FW100研磨機(jī)(天津泰斯特儀器有限公司);BY-30AD超聲萃取儀(上海秉越電子儀器有限公司);AXTG16G離心機(jī)(鹽城市安信實驗儀器有限公司);HSC-24B氮吹儀(天津市恒奧科技發(fā)展有限公司);QP2020型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀[島津企業(yè)管理(中國)有限公司];DK-98-11電子調(diào)溫萬用爐(天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.2 材料家黑種草籽(新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所);瘤果黑種草籽(安徽嘉佑中藥飲片有限公司);鹽酸(優(yōu)級純,天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司);乙醇(色譜純,北京邁瑞達(dá)科技有限公司);氦氣(高純氦氣,北京氦普北分氣體有限公司);氮氣(普通氮氣,錫林郭勒盟天宇制氧有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取物制備

2.1.1蒸餾水提取物制備。用研磨機(jī)將干燥的瘤果黑種草籽和家黑種草籽研磨成粉末,稱取5.00 g 粉末置于三角瓶中,加入50.00 mL蒸餾水,在電子調(diào)溫萬用爐上2 min內(nèi)煮沸后,降低功率保持煮沸狀態(tài)20 min。將三角瓶中的液體過濾,移液管量取2 mL濾液于50 ℃下氮吹至濕干,用等量乙醇復(fù)溶后,過濾膜上機(jī)。

2.1.2鹽酸提取物制備。配制pH 1.5的鹽酸,存于4 ℃?zhèn)溆?。稱取5.00 g瘤果黑種草籽和家黑種草籽粉末置于三角瓶中,加入pH 1.5的鹽酸50.00 mL,在37 ℃恒溫振蕩器中低頻振蕩提取2 h,將三角瓶中液體過濾,移液管量取2.00 mL濾液于50 ℃下氮吹至濕干,用等量乙醇復(fù)溶后,過濾膜上機(jī)。

2.2 GC-MS條件

2.2.1氣相色譜條件。SH Rxi-5il MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),載氣是高純氦氣,流速1.2 mL/min,進(jìn)樣口溫度230 ℃。程序升溫:初始溫度50 ℃,保持1 min;以25 ℃/min升至150 ℃,再以10 ℃/min升至300 ℃,保持15 min。進(jìn)樣量1 μL,不分流進(jìn)樣。

2.2.2質(zhì)譜條件。離子源為電子轟擊源(EI);傳輸線溫度250 ℃;離子源溫度230 ℃;掃描模式為全掃;掃描質(zhì)量范圍50～500 au;溶劑延遲5 min。

2.3 黑種草籽水提物和酸提物中揮發(fā)性成分及其含量將瘤果黑種草籽和家黑種草籽的水提物和酸提物用乙醇復(fù)溶,經(jīng)GC-MS檢測的總離子流數(shù)據(jù)如圖1所示,檢測結(jié)果通過NIST 14.0數(shù)據(jù)庫比對進(jìn)行初步定性,按照面積歸一化法進(jìn)行定量分析,結(jié)果如表1所示。

表1 瘤果黑種草籽和家黑種草籽水提物和酸提物揮發(fā)性成分

接下表續(xù)表1

由表1可知,瘤果黑種草籽的水提物和酸提物中揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)量分別為53和39種;水提物中揮發(fā)性成分含量最高的為亞油酸,達(dá)到25.35%,百里醌含量為0.39%,百里氫醌含量為3.78%;酸提物中含量最高的成分為亞油酸(25.46%),其次為9-十八碳酰胺(20.88%),百里氫醌含量為3.81%。家黑種草籽的水提物和酸提物中揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)量分別為64和63種;水提物中含量較高的成分是亞油酸(26.07%)、油酸(19.51%),百里醌含量為0.33%,百里氫醌含量為2.48%;酸提物中含量較高的成分是油酸(22.64%)、9-十八碳酰胺(12.76%)、棕櫚酸(11.14%),百里氫醌含量為3.30%?？傮w而言,瘤果黑種草籽及家黑種草籽的水提物和酸提物中含有揮發(fā)性成分種類較多,但含量占比較多的是脂肪酸類、酯類化合物,烷類、酚類、酮類等化合物含量較低(圖2),但家黑種草籽中有糖類成分檢出。

2.4 黑種草籽水提物和酸提物中主要揮發(fā)性成分的分類將瘤果黑種草籽和家黑種草籽水提物和酸提物中某一項含量大于1%并與其他項含量形成明顯對比的揮發(fā)性成分進(jìn)行分類,結(jié)果如表2所示。

表2 不同溶劑提取瘤果黑種草籽和家黑種草籽主要揮發(fā)性成分分類Table 2 Classification of main volatile components extracted by different solvents from the seeds of Nigella glandulifera and Nigella sativa

由表1和表2可知,瘤果黑種草籽和家黑種草籽的水提物和酸提物中主要揮發(fā)物成分為脂肪酸、酯、酰胺3大類。瘤果黑種草籽的水提物中脂肪酸類成分共有5種,總含量為39.80%,含量最高的是亞油酸;酯類成分共有6種,總含量為7.96%,其中亞油酸丁酯含量較高,為4.15%;酰胺類成分共有4種,總含量為27.79%,其中9-十八碳酰胺含量最高,為18.84%。瘤果黑種草籽酸提物中脂肪酸類成分共5種,含量為43.89%;酯類成分4種,含量為1.36%;酰胺類化合物5種,含量為30.97%,其中以9-十八碳酰胺含量最高,為20.88%。家黑種草籽水提物中脂肪酸類成分7種,總含量為56.53%,其中亞油酸和油酸含量占比為45.58%;酯類成分7種,含量為4.89%;酰胺類成分5種,含量為20.17%,其中9-十八碳酰胺含量為13.71%。家黑種草籽酸提物中脂肪酸類成分有7種,總含量為44.75%,其中油酸和棕櫚酸含量較高,共占比33.78%;酯類成分2種,含量為0.82%;酰胺類成分5種,含量為19.11%,其中9-十八碳酰胺含量為12.76%(圖3)。

注:A.瘤果黑種草籽水提物;B.瘤果黑種草籽酸提物;C.家黑種草籽水提物;D.家黑種草籽酸提物。Note:A.Water extracts of N.glandulifera seeds;B.Acid extracts of N.glandulifera seeds;C.Water extracts of N.sativa seeds;D.Acid extracts of N.sativa seeds.圖3 瘤果黑種草籽和家黑種草籽不同提取溶劑下脂肪酸類(a)、酯類(b)和酰胺類(c)揮發(fā)成分含量與數(shù)量對比Fig.3 Comparison of the content and quantity of volatile components in fatty acids(a),esters(b)and amides(c)under different extraction solvents for Nigella glandulifera seeds and Nigella sativa seeds

2.5 瘤果黑種草籽和家黑種草籽不同提取溶劑下?lián)]發(fā)性成分差異比較對瘤果黑種草籽和家黑種草籽不同溶劑提取的揮發(fā)性成分進(jìn)行比較,結(jié)果如圖4所示,2種黑種草籽的水提物和酸提物共有18種共有成分,主要有脂肪酸、酰胺、酯類等成分,其中,亞油酸、油酸、棕櫚酸、9-十八碳酰胺含量較高。另外,還有百里氫醌和γ-谷甾醇。共性成分是黑種草自身特點的體現(xiàn),2種草籽在2種提取溶劑中均可獲得,對草籽選擇和劑型選擇無支撐作用。此外,由圖4可知,瘤果黑種草籽水提物和家黑種草籽水提物共有揮發(fā)性成分37種,而瘤果黑種草籽酸提物和家黑種草籽酸提物共有揮發(fā)性成分23種,瘤果黑種草籽水提物、瘤果黑種草籽酸提物、家黑種草水提物、家黑種草酸提物特有揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)量分別為12、10、22、30種。

圖4 瘤果黑種草籽和家黑種草籽不同提取溶劑下?lián)]發(fā)性成分差異比較Fig.4 Comparison of volatile components between the seeds of Nigella glandulifera and Nigella sativa under different extraction solvents

對瘤果黑種草籽和家黑種草籽不同溶劑提取物中的特有揮發(fā)性成分進(jìn)行功能分類,結(jié)果見表3。瘤果黑種草籽水提物特有的12種揮發(fā)性成分中醇類有3種,酯類4種,烷類2種,含量較高的是亞油酸乙酯(2.40%),另有正十八醇、n-四糖醇、棕櫚酰氯等檢出;瘤果黑種草籽酸提物特有成分10種,其中主要成分是酯類,還有N,N-二甲基十二酰胺檢出。家黑種草籽水提物特有成分22種,酯類有12種,其中包括硬脂酸甲酯、9-十八烯酸甲酯、油酸縮水甘油酯等;家黑種草籽酸提物特有成分30種,種類最多,醇類6種,酯類8種,還特有4種糖類和γ-生育酚檢出,其中D-阿洛糖含量較高,為5.20%(表1)。

3 結(jié)論與討論

根據(jù)試驗結(jié)果分析可知,瘤果黑種草籽和家黑種草籽水提物及酸提物的揮發(fā)性成分含量及種類差異明顯,總體而言脂肪酸含量最高,酯種類較多,可能由于在無機(jī)溶劑水和鹽酸環(huán)境中提取使得部分脂肪酸發(fā)生酯化反應(yīng),而且提取物中明顯水溶性較好的酰胺類成分含量較高。

對于不同溶劑而言,2種黑種草籽水提物中均有活性成分百里醌檢出,百里醌已被證實具有廣泛的藥用價值[10];而酸提物中有反式酯檢出,說明黑種草籽酸提物成分對人體健康有潛在的危害[11],所以水提物中藥用成分作用更大,且對人體有害性更低,更適于方劑的應(yīng)用。針對不同黑種草來說,瘤果黑種草籽水提物揮發(fā)性成分及其中脂肪酸含量明顯少于家黑種草籽水提物,但是其酰胺類成分含量高于家黑種草籽水提物。但家黑種草籽的水提物和酸提物的特有揮發(fā)性成分多于瘤果黑種草籽,而且家黑種草籽酸提物特有成分中有糖類檢出,說明家黑種草籽酸提物可能有更為多樣化的藥理作用。

表3 瘤果黑種草籽和家黑種草籽不同溶劑提取物中特有揮發(fā)性成分分類Table 3 Classification of specific volatile components extracted by different solvents from seeds of Nigella glandulifera and Nigella sativa.

民族藥或中藥方劑成分的基礎(chǔ)研究中,一般采用有機(jī)試劑作為提取溶劑,如乙醇、石油醚、正丁醇等[12],能夠使各藥用成分最大限度的浸出,如30%乙醇溶液提取黑種草籽,則其亞油酸的含量高達(dá)67.05%[13];或者采用新型技術(shù)研究揮發(fā)性成分,如頂空固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用分析可測得黑種草籽揮發(fā)性成分中百里醌含量為47.62%[14]。然而,有機(jī)試劑提取或新型技術(shù)的研究與患者服藥方式相去甚遠(yuǎn),人體從方劑中吸收的藥用成分的有效含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到檢測的水平。

該研究主要根據(jù)黑種草民族藥方劑的水煎服用方式,研究瘤果黑種草籽和家黑種草籽在無機(jī)溶劑水和鹽酸溶液(pH=1.5)提取物中揮發(fā)性成分的差異,選取鹽酸溶液(pH=1.5)提取物進(jìn)行對比是由于胃液呈酸性,即如果黑種草籽是丸劑服用,消化時酸性環(huán)境可能會對黑種草籽的浸出成分有所影響。

綜合比較分析,瘤果黑種草籽和家黑種草籽經(jīng)水提取后藥用成分含量,比鹽酸溶液(pH=1.5)提取物中藥用成分有效性更高。從檢出成分的藥理作用來看,瘤果黑種草籽水提物,因其中酰胺類和酯類成分含量更高,結(jié)合楊秦等[15-16]的研究,更加適合用于神經(jīng)保護(hù)類的治療方劑;家黑種草籽水提物中脂肪酸成分種類和含量更多,更適合抗氧化、抗衰老及抗腫瘤等方劑使用[17-20]。另外,有研究表明D-阿洛糖具有減輕皮瓣缺血損傷的功效[21],家黑種草籽酸提物中D-阿洛糖含量較高,有進(jìn)行相關(guān)方劑研發(fā)的潛在價值。