受棉鈴蟲誘導的棉花糖基轉(zhuǎn)移酶UGT基因家族的生物信息學及表達分析

瑪依拉·玉素音,陽 妮,徐海江,楊延龍,張大偉,李春平,石必顯,賴成霞

(新疆農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所,烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】棉鈴蟲(HelicoverpaarmigeraHubner)是鱗翅目,夜蛾科昆蟲,是棉花蕾鈴期中最主要的害蟲之一[1]。棉花受到棉鈴蟲、棉蚜等有害生物時,會產(chǎn)生多種代謝組分來躲避侵害,而這些代謝組分的變化與基因組調(diào)控密切相關(guān),同一代謝物質(zhì)可受一種或多種防御基因調(diào)控[2]。挖掘棉花中響應(yīng)蟲害脅迫的基因并探究其功能對棉花基因工程研究有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】糖基轉(zhuǎn)移酶(glycosyltransferases,GT; EC 2.4.x.y)是生物體內(nèi)廣泛存在的一種進行糖基化反應(yīng)的轉(zhuǎn)移酶,能夠?qū)⑻腔鶑暮塑账崽枪w轉(zhuǎn)移到次生代謝物、激素類、蛋白類等化合物上[3],其中最常見的一種糖供體是尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶(UGT)[4]。在植物應(yīng)答蟲害脅迫過程中,糖基轉(zhuǎn)移酶在調(diào)控基因、蛋白、代謝的變化和表達發(fā)揮著重要作用[5]。Jing等[6]研究發(fā)現(xiàn),在糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下,順-3-己烯醇能生成順-3-己烯醇糖苷,激活茶樹茉莉酸和乙烯信號通路,并由此提高茶樹對茶尺蠖的直接和間接防御反應(yīng)。Augustin等[7]報道了在害蟲脅迫下,枸杞UGT73C10～13基因表達上調(diào)催化了常春藤皂苷元和皂素齊墩果酸發(fā)生3-O-葡萄糖基化,增加了枸杞對害蟲的抗性,并且在基因下調(diào)時,其對害蟲的抗性減弱。Zhang等[8]研究報道,糖基轉(zhuǎn)移酶GmUGT的過表達會改變類黃酮化合物的含量和生物合成、及防御相關(guān)基因的表達模式,增加了大豆品種對嚼葉昆蟲的抗性。在水稻中發(fā)現(xiàn)的糖基轉(zhuǎn)移酶UGT707A3的過表達能增加柚皮素轉(zhuǎn)和尿苷二磷酸葡萄糖化為柚皮素-7-O-β-d-葡萄糖苷的反應(yīng),從而阻止了昆蟲的對水稻的攝食[9]。目前,關(guān)于棉花中糖基轉(zhuǎn)移酶的研究主要集中于維持激素平衡,脫毒代謝上,如UGT73C14參與ABA調(diào)控,GalT1參與細胞壁果膠合成,UGT41B3和UGT40D1能調(diào)控棉子酚的脫毒代謝[10-12]?！颈狙芯壳腥朦c】對糖基轉(zhuǎn)移酶參與棉花蟲害防御反應(yīng)的研究尚未見報道。目前,對受棉鈴蟲誘導的棉花糖基轉(zhuǎn)移酶的研究與利用多局限于資源收集,而棉鈴蟲抗性功能方面的研究尚未見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以受棉鈴蟲誘導的5個糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGTG01、UGTG02、UGTGo4、UGTGo6和UGTGo7為研究對象,采用生物信息學手段從基因組水平、進化關(guān)系、各家族成員蛋白的理化性質(zhì)、保守基序以及表達模式對各家族成員及進行分析,為棉花糖基轉(zhuǎn)移酶UGT基因在抗棉鈴蟲功能研究提供的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

從NCBI基因組數(shù)據(jù)庫下載棉花糖基轉(zhuǎn)移酶UGT蛋白序列,利用NCBI的(Conserved Domain Search Service(CD Search)分析蛋白結(jié)構(gòu)域。利用Protpararm在線程序(http://au.expasy.org/tools/protparam.html)分析其蛋白質(zhì)的理化特性。利用在線工具ExPASY(http://www.expasy.org/tools)預(yù)測蛋白質(zhì)的氨基酸數(shù)量、相對分子質(zhì)量、等電點及蛋白的親疏水性。使用Softberry(http://linux1.softberry.com/berry.phtml)預(yù)測蛋白質(zhì)的亞細胞定位。

1.2 方 法

1.2.1 棉花糖基轉(zhuǎn)移酶UGT蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

通過Clustal X 2.0軟件對棉花糖基轉(zhuǎn)移酶UGT基因家族的氨基酸序列比對;利用MEGA11.0.13軟件對來自擬南芥、水稻、大豆及棉花等作物的糖基轉(zhuǎn)移酶進行鄰接法(neighbor--joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,重復次數(shù)設(shè)置為1 000次,其他參數(shù)為默認值。

1.2.2 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

通過在線軟件NCBI使用基因的保守結(jié)構(gòu)域工具CD-search(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)快速找到相關(guān)基因上的保守結(jié)構(gòu)域,將基因的蛋白質(zhì)序列以FASTA文件導入,在線軟件NCBI的找到基因保守結(jié)構(gòu)域,利用TBtools V.1098726軟件進行糖基轉(zhuǎn)移酶基因家族的保守結(jié)構(gòu)預(yù)分析。使用MEME在線網(wǎng)站(https://meme-ie,rg/meme/tools/meme)和TBools軟件對糖基轉(zhuǎn)移酶基因家族蛋白質(zhì)進行基因結(jié)構(gòu)分析;S0PMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl/page=npsa_sopma.html)分別對基因的蛋白質(zhì)序列進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測。

1.2.3 基因的熒光定量表達

采用實時熒光定量PCR確定棉花中UGT基因的表達模式,利用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒將不同棉花組織樣品RNA反轉(zhuǎn)錄為CDNA。RT-PCR引物使用NCBI Primer-BLAST進行設(shè)計,以Histone為內(nèi)參基因。RT-PCR反應(yīng)體系如下:cDNA 1 μL,Premix ExTaqTMⅡ 10 μL,ddH2O 7 μL,Rox Reference Dye 0.4 μL,上下引物10 μmol/L各0.8 μL。反應(yīng)程序設(shè)定為:預(yù)變性95 ℃,5min;變性95 ℃,1 min;退火56～58.5 ℃,30 s;延伸72 ℃,1 min 30 s,30個循環(huán),每個基因設(shè)置3次生物學重復,用2-ΔΔCT法計算糖基轉(zhuǎn)移酶家族基因的相對表達量,采用Excel統(tǒng)計數(shù)據(jù)及作圖。表1

表1 定量PCR 引物序列

1.2.4 基因的物種來源及基因登錄號

來自棉花的基因UGTG01(基因登錄號,KX398934)、UGTG02(基因登錄號,KX398935)、UGTGo4(基因登錄號,MN701073)、UGTGo6(基因登錄號,MN812721),UGTGo7(基因登錄號,MN820705);來自山芥的基因BvUGT1(基因登錄號,JQ29161)、BvUGT73C9(基因登錄號,JQ291612)、BvUGT73C10(基因登錄號,JQ291613)、BvUGT73C11(基因登錄號,JQ29161)、BvUGT73C12(基因登錄號,JQ291615)、BvUGT73C13(基因登錄號,JQ291616)、BvUGT73C21(基因登錄號,MF448360)、BvUGT73C22(基因登錄號,MF448363)、BvUGT73C23(基因登錄號,MF448369)、BvUGT73C24(基因登錄號,MF448364)、BvUGT73C25(基因登錄號,MF448366)、BvUGT73C26(MF448353)、山芥BvUGT73C27(基因登錄號,MF448357);來自擬南芥的基因AtUGT73C1( 基因登錄號,NM_129230)、AtUGT73C2(基因登錄號,NM_129231)、AtUGT73C5(基因登錄號,CP002685),AtUGT73C6(基因登錄號,NM_129234)、AtUGT73C7(基因登錄號,NM_115176),大豆GmUGT(基因登錄號,MG846900),水稻UGT707A3(基因登錄號,PF00201.11)。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉花糖基轉(zhuǎn)移酶UGT基因家族理化性質(zhì)

研究表明,UGTG01、UGTG02、UGTGo4、UGTGo6、UGTGo7的氨基酸數(shù)為468～534個,相對分子質(zhì)量為52 743.1～60 208.62 kDa,其中氨基酸數(shù)和分子質(zhì)量最大的是UGTG01,最小的是UGTGo7;等電點范圍在4.97～5.58,脂溶性指數(shù)為84.58～93.75,不穩(wěn)定系數(shù)為40.18～49.85,其中UGTG01、UGTG02、UGTGo7均為不穩(wěn)定蛋白;并且5個UGTs親疏水性均為負值,5個基因所編碼的蛋白質(zhì)均為親水性蛋白。表2

表2 棉花糖基轉(zhuǎn)移酶UGT蛋白基本理化參數(shù)

2.2 棉花糖基轉(zhuǎn)移酶UGT基因結(jié)構(gòu)分析及蛋白質(zhì)二結(jié)構(gòu)預(yù)測

研究表明,基因的長度不同,外顯子和內(nèi)含子也存在差別。5個基因均無內(nèi)含子,其中基因UGTG01和UGTGo7均含有1個外顯子和2個上下游;基因UGTG02、UGTGo4、UGTGo6只含1個外顯子,無內(nèi)含子和上下游。

5個蛋白質(zhì)主要由α-螺旋、無規(guī)則卷曲、延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角組成,順序均是由α-螺旋>無規(guī)則卷曲>延伸鏈>β-轉(zhuǎn)角。α-螺旋在DNA結(jié)合基序中發(fā)揮重要作用,無規(guī)則卷曲易受側(cè)鏈相互作用,構(gòu)成活性部位和功能部位。利用Softberry在線工具對糖基轉(zhuǎn)移酶UGT基因家族中的5個基因進行亞細胞定位,大多數(shù)的蛋白質(zhì)均被定位在細胞外和質(zhì)膜上。圖1

注:A:UGT家族基因結(jié)構(gòu)分析;B:UGT家族基因蛋白質(zhì)二結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.3 棉花糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白的氨基酸同源性

研究表明,UGT基因家族的5個基因的氨基酸具有63.23%平均相似性。其中UGTC02的氨基酸序列與UGTCo7的具有最高相似性為84.86%,UGTC02的氨基酸序列與UGTCo6的相似性為79.08%,UGTCo6的氨基酸序和UGTCo7相似性為77.89%。而UGTC01的氨基酸序列與UGTCo4相似性為47.01%,UGTC01的氨基酸序列與UGTCo6相似性最低為24.70%,UGTCo4的氨基酸序列和UGTCo6相似性較低為24.9%。圖2

圖2 棉花糖基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列比對

2.4 棉花糖基轉(zhuǎn)移酶UGT基因家族蛋白質(zhì)保守基序和保守結(jié)構(gòu)域

研究表明,3個保守基序分別為Motif1～Motif3。5條序列均含有全部3種Motif,聚在同一組的蛋白成員,3類Motif的保守性較強。其Motif的組成是相同的,同一組成員功能相同,該家族蛋白保守性強,5個UGT蛋白均含有Glycosyltransferase_GTB-type superfamily結(jié)構(gòu)域,且均位于蛋白的N端,棉花糖基轉(zhuǎn)移酶UGT同源基因?qū)Φ牡鞍组L度及結(jié)構(gòu)域位置有很高的相似性。圖3

注:A:UGT家族蛋白質(zhì)保守基序;B:UGT家族基因保守結(jié)構(gòu)域分析

2.5 棉花糖基轉(zhuǎn)移酶UGT基因家族的組織表達

研究表明,UGTC01在根、莖、子葉、真葉、花、棉桃均為表達量較低;UGTC02在子葉中的表達量顯著高于其他組織,其次是莖、棉 桃、真葉、根和花中幾乎表達;UGTCo7有著相同的組織表達模式,在子葉中的表達量相對較高,其次是莖、真葉、棉桃,在根和花中的表達量相對較低;UGTCo4在莖中的表達量相對比其他組織表達量較明顯;UGTCo6在子葉中的表達量較高于其他組織,其次是真葉、莖、根、花、棉桃中幾乎表達,棉花糖基轉(zhuǎn)移酶UGT具有明顯的表達特異性,在子葉和莖中的表達量相對較高,其次是真葉和棉桃,在其他組織中的表達量相對較低,在棉花不同組織中可能具有不同的生物學功能。圖4

圖4 5個UGT基因在棉花不同組織的表達

2.6 棉花糖基轉(zhuǎn)移酶UGT基因家族的分子進化樹構(gòu)建

研究表明,不同植物來源糖基轉(zhuǎn)移酶被聚類分為2個分支,克隆到的棉花糖基轉(zhuǎn)移酶UGTG01、UGTCo4與枸杞UGT73C基因家族的蛋白相近,棉花的UGTC02、UGTCo6及UGTCo7蛋白與水稻的UGT707A3蛋白和大豆的GmUGT蛋白相鄰分支中,棉花糖基轉(zhuǎn)移酶的五個蛋白可能具有與UGT73C家族基因,水稻的UGT707A3基因、大豆GmUGT基因具有相似的功能。圖5

注:不同物種UGT不同顏色標記,擬南芥、山芥、水稻、大豆及棉花分別由綠色三角形、藍色菱形、橙色方形、黃色倒三角形及紅色圓形標記。

3 討 論

3.1糖基化是植物次生代謝產(chǎn)物中最為廣泛存在的一種修飾方式。該反應(yīng)是由糖基轉(zhuǎn)移酶的催化生物功能實現(xiàn)的。其生物學功能涉及植物到植物多個階段,如參與植物的防御防御,脫毒反應(yīng)等[13-15]。目前,有關(guān)UGT基因家族的研究大多集中于藏紅花[16]、煙草[17]、擬南芥[18]中,而在棉花受棉鈴蟲誘導的反應(yīng)中研究非常少。

生物信息學在抗性基因研究及新抗性基因鑒定的應(yīng)用中發(fā)揮了重要的作用[19],Huang等[20]利用生物信息學技術(shù),在雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii)、亞洲棉(Gossypium arboreum)和陸地棉(Gossypium hirsutum)中分別鑒定出了142、146和196個糖基轉(zhuǎn)移酶基因。研究利用生物信息學方法從棉花基因組中鑒定出5個受棉鈴蟲誘導的UGT基因家族成員。通過理化性質(zhì)分析得出,棉花糖基轉(zhuǎn)移酶UGT基因家族蛋白質(zhì)基本為堿性氨基酸,且5個蛋白質(zhì)均為親水性蛋白質(zhì),蛋白質(zhì)長度在468～534,等電點在4.97～5.58,相對分子質(zhì)量區(qū)域為52 743.1～60 208.62。

3.2蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)決定其生物學功能,結(jié)構(gòu)相似其功能相似。在研究中,棉花糖基轉(zhuǎn)移酶UGT基因家族的5個蛋白質(zhì)主要由α-螺旋、無規(guī)則卷曲、延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角構(gòu)成,位于同一家族成員的結(jié)構(gòu)具有一致性。在亞細胞定位中發(fā)現(xiàn)大多數(shù)大部分的蛋白質(zhì)均被定位在細胞外和質(zhì)膜上,表明這些基因合成生長素基本是在細胞外和質(zhì)膜中完成的,與翟瓊等[21]的研究結(jié)果一致。結(jié)構(gòu)域和Motif的種類和數(shù)量可以從側(cè)面反應(yīng)該基因的生物功能多樣性,具有相同種類和數(shù)量Motif的基因功能可能相似[22]。研究通過分析棉花糖基轉(zhuǎn)移酶UGT基因家族蛋白質(zhì)保守基序發(fā)現(xiàn),5個蛋白質(zhì)有3個motif,基因家族的功能具有相似性。在彭洪嫻等[23]的研究中也同樣發(fā)現(xiàn)了位于同一亞族的基因含有大致相同的Motif,并證實了這些含有相同Motif的基因成員可能具有類似的功能。

3.3與糖基轉(zhuǎn)移有關(guān)的酶類或蛋白的表達豐度與寄主抗性機制有關(guān),Wang等[24]的研究發(fā)現(xiàn)2種糖基轉(zhuǎn)移酶的過量表達參與了大麥對麥蚜抗性的形成。李健英[25]在研究棉花響應(yīng)煙粉虱脅迫的分子機制中發(fā)現(xiàn),糖基轉(zhuǎn)移酶基因在煙粉虱脅迫后表達發(fā)生上調(diào)變化。研究中,受棉鈴蟲誘導的5個棉花糖基轉(zhuǎn)移酶具有明顯的表達特異性,在子葉和莖中的相對表達量較高,在其他組織中的相對表達量較低,5個棉花糖基轉(zhuǎn)移酶中UGTC02在組織中的表達大于其他基因,不同棉花組織對棉鈴蟲的抗性具有差異,與前人的研究一致[26]。

3.4系統(tǒng)進化樹種聚集在一起的亞組具有相似的進化源和基因功能[27]。在研究中,通過構(gòu)建系統(tǒng)進化樹發(fā)現(xiàn)棉花糖基轉(zhuǎn)移酶UGTG01、UGTCo4與枸杞UGT73C基因家族的蛋白相近,棉花的UGTC02、UGTCo6及UGTCo7蛋白與水稻的UGT707A3蛋白和大豆的GmUGT蛋白相鄰分支中,同一分支中的基因可能具有相同的生物學功能。UGT73C基因家族成員、GmUGT、UGT707A3在植物抗蟲脅迫中發(fā)揮著重要的作用,其中UGT73C基因家族成員能通過調(diào)控皂苷元等物質(zhì)來增加枸杞對害蟲的抗性[7],GmUGT可以通過改變類黃酮的變化,參與賦予了大豆對昆蟲的抗性[8],UGT707A3通過調(diào)控柚皮素糖基化減少昆蟲對水稻的攝食[9]。5個蛋白質(zhì)能通過調(diào)控皂苷元、類黃酮、柚皮素等物質(zhì)響應(yīng)棉花的抗蟲性。

4 結(jié) 論

獲得5個棉花糖基轉(zhuǎn)移酶基因,UGTG01、UGTG02、UGTGo4、UGTGo6、UGTGo7的蛋白質(zhì)長度在468～534,等電點在4.97～5.58,相對分子質(zhì)量區(qū)域為52 743.1～60 208.62,亞細胞定位在細胞質(zhì)外,均為親水性蛋白質(zhì)?；蚪Y(jié)構(gòu)均含有1個外顯子,二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、無規(guī)則卷曲為主,均含3個Motif基序和有Glycosyltransferase_GTB-type superfamily結(jié)構(gòu)域。5個基因具有明顯的組織表達差異性,不同棉花組織對棉鈴蟲的抗性具有差異。進化樹構(gòu)建5個基因具有與UGT73C家族基因,水稻的UGT707A3基因、大豆的GmUGT基因具有相似的抗蟲功能,能通過調(diào)控皂苷、類黃酮、柚皮素等物質(zhì)響應(yīng)棉花的抗蟲性。