檉柳叢枝植原體鑒定及16S rRNA基因多樣性分析

李 豐,賴剛剛,2,趙志惠,陳小飛,朱天生

(1.塔里木大學(xué)農(nóng)學(xué)院/南疆農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部阿拉爾作物有害生物科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站,新疆阿拉爾 843300;2 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第四師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,新疆可克達(dá)拉 835219)

0 引 言

【研究意義】檉柳(Salt cedar)(TamarixchinensisLour.)為檉柳科、檉柳屬植物,具有耐鹽堿、耐高溫寒冷的特性,能適應(yīng)干旱沙漠和在濱海鹽土生存,是南疆地區(qū)防風(fēng)固沙、改造鹽堿地、綠化環(huán)境的優(yōu)良樹種之一[1]。植原體(Phytoplasma)屬軟壁菌門(Tenericutes)柔膜菌綱(Mollicutes),Doi等[2]在發(fā)病的植物篩管中發(fā)現(xiàn),是一類沒有細(xì)胞壁的原核生物,主要寄生在植物韌皮部組織中,其傳播方式主要是依靠介體昆蟲(刺吸式口器葉蟬、飛虱等)進(jìn)行傳播,也可靠菟絲子和嫁接的方式傳播[3]。早期植原體的分類依據(jù)主要是根據(jù)寄主植物感病后所表現(xiàn)出來的癥狀、寄主的范圍、介體昆蟲等進(jìn)行分類。【前人研究進(jìn)展】目前,植原體的分類主要還是依據(jù)16S rRNA、rp、secY等保守基因序列和基因組的差異進(jìn)行[4],組和亞組的劃分主要是依據(jù)16S rRNA基因序列的RFLP分析圖譜的相似系數(shù)[5]。植原體已鑒定劃分為52個暫定種、36個組和100多個亞組[6]。植原體沒有細(xì)胞壁,因此當(dāng)受到外力作用時形態(tài)很容易發(fā)生變化,就會呈現(xiàn)出各種不同的形態(tài),如球形、橢圓形、長桿形和不規(guī)則形等[7]。Zhao等[8]在中國西安郊區(qū)發(fā)現(xiàn)了表現(xiàn)出異常癥狀的檉柳,將其命名為檉柳叢枝病(Salt cedar witches’-broom.SCWB),該癥狀可能是由植原體引起的,經(jīng)過RFLP和16S rRNA基因全長克隆序列分析也證實(shí):病株植物均屬于植原體病害,并將其劃分至16S rXXX組(Salt cedar witches’-broom phytoplasma group,檉柳叢枝植原體組),并確定一個新候選種‘CaPhtamaricis’,SCWB1被指定為16SrXXX-A亞組的代表菌株[9]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】新疆關(guān)于植原體病害的報道多集中在16SrV組,如棗瘋病[10]、柳樹花變?nèi)~植原體[11]、杏褪綠卷葉植原體[12]等。檉柳叢枝植原體16S rRNA基因在南疆各地區(qū)存在差異,其影響因素較多,病原物本身的變異、生長環(huán)境的差異、地理位置以及氣候的不同、不同的地區(qū)存在的傳播介體等都可能使16S rRNA基因在不同地區(qū)形成多樣性。關(guān)于16SrXXX組植原體病害及rp基因的PCR擴(kuò)增,未見詳細(xì)的報道。需對SCWB在南疆地區(qū)的分布及發(fā)生情況、形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)角度對SCWB植原體進(jìn)行研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以新疆南疆地區(qū)檉柳叢枝病為材料,調(diào)查該病害在新疆南疆地區(qū)的分布及危害情況,運(yùn)用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的手段對該病害病原物做出鑒定,研究該病原物的形態(tài)特征及其分類地位,分析其16S rRNA基因的多樣性,為該病害防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

收集表現(xiàn)出叢枝癥狀的檉柳樣品及正常的檉柳樣品(采自新疆南疆各地區(qū)),PCR產(chǎn)物回收試劑盒、標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker及克隆載體pMD18-T等分子生物學(xué)試劑產(chǎn)品購自TaKaRa公司,2.5%的戊二醛及電鏡觀察相關(guān)藥品購自上海生工。

1.2 方 法

1.2.1 檉柳叢枝病的分布及危害調(diào)查

2020年及2021年在新疆南疆隨機(jī)采樣調(diào)查地區(qū)4個市、5個縣和2個團(tuán)場檉柳叢枝病的發(fā)生及分布情況。參照董緒曾[13]病害分級標(biāo)準(zhǔn),制定檉柳叢枝病分級標(biāo)準(zhǔn)。表1

表1 檉柳叢枝病病情指數(shù)分級標(biāo)準(zhǔn)

1.2.2 檉柳叢枝病病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

利用透射電子顯微鏡對檉柳叢枝病病原菌形態(tài)學(xué)進(jìn)行觀察,步驟參考李正男[13]。

1.2.3 檉柳叢枝病分子鑒定

1.2.3.1 樣品DNA提取

分別取表現(xiàn)出叢枝癥狀的檉柳及正常的檉柳韌皮部組織,植物總DNA的提取采用漆艷香等[14]的CTAB法,0.8%瓊脂糖電泳檢測DNA樣品完整性,合格樣品置于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2 檉柳叢枝植原體PCR擴(kuò)增

(1)檉柳叢枝植原體16S rRNA基因PCR擴(kuò)增

以提取的植物總DNA為模板,利用Lee等[15]和Gundersen等[16]設(shè)計的植原體16S rRNA基因通用引物對R16mF2/R16mR1(CATGCAAGTCGAACGGA/CTTACCCCCAATCATCGA)進(jìn)行直接PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為:2×SanTaqPCR Mix 12.5 μL,引物R16mF2和R16mR1各1 μL,DNA模板1 μL,加ddH2O至25 μL。擴(kuò)增條件為:94℃ 3 min; 94℃ 30s,56℃ 30s,72℃ 2 min,35 cycles;72℃ 10 min。將直接PCR產(chǎn)物稀釋20倍后作為巢式PCR的模板,用引物對R16F2n/R16R2(GAAACGACTGCTAAGACTGG/TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG)進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為:2×SanTaqPCR Mix 12.5 μL,R16F2n和R16R2各1 μL,DNA模板1 μL,加ddH2O至25 μL。擴(kuò)增條件為:94℃ 3 min;94℃ 30s,57℃ 30s,72℃ 2 min,35cycles;72℃延伸10 min。

(2)檉柳叢枝植原體rp基因PCR擴(kuò)增

直接以提取的植物總DNA為模板,利用引物對rpF1/rpR1(TCGCGGTCATGCAAAAGGCG/ACGATATTTAGTTCTTTTTGG)進(jìn)行直接PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為:2×SanTaqPCR Mix 12.5μL,引物rpF1和rpR1各1μL,DNA模板1μL,加ddH2O至25μL。擴(kuò)增條件為:95℃ 3 min;95℃ 15s,51℃ 30s,72℃ 90s,35 cycles;72℃ 10 min。將直接PCR產(chǎn)物稀釋20倍后作為巢式PCR的模板,用引物對rp(I)F1/rp(I)R1(TTTTCCCCTACACGTACTTA/GTTCTTTTTGGCATTAACAT)進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為:2×SanTaqPCR Mix 12.5 μL,引物rp(I)F1和rp(I)R1各1 μL,DNA模板1 μL,加ddH2O至25 μL。擴(kuò)增條件為:95℃ 3 min;95℃ 30s,53℃ 30s,72℃ 90s,35 cycles;72℃ 10 min。

1.2.3.3 序列分析

將所獲得的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后檢測送至上海生工測序。利用MegAlign軟件對獲得的序列進(jìn)行校正及拼接,提交到GenBank中獲得基因序列號。在NCBI中對獲得的基因序列Blast在線比對獲得同源序列,通過MEGA-X[17]軟件Neighbor-Joining(NJ)鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,研究檉柳叢枝植原體在植原體組/亞組的分類地位;并對新疆南疆不同地區(qū)檉柳叢枝植原體16S rRNA基因進(jìn)行遺傳多樣性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 南疆檉柳叢枝病分布及危害

2.1.1 檉柳叢枝病田間癥狀表現(xiàn)

研究表明,與正常的檉柳相比,檉柳叢枝癥狀主要表現(xiàn)為,在發(fā)病初期,葉片簇生,形成從芽狀,之后葉片聚合在一區(qū)縮短變粗,形成苞狀葉,苞狀葉再次收縮形成短棒狀,短棒狀葉片逐漸生長,最終呈現(xiàn)長棒扭曲狀干枯死亡,掛在樹枝上,感染該病害的檉柳也會表現(xiàn)出禿頂?shù)默F(xiàn)象。圖1

圖1 檉柳叢枝癥狀

2.1.2 檉柳叢枝病在南疆地區(qū)的分布及危害

研究表明,檉柳叢枝病主要發(fā)生在阿克蘇市溫宿縣、巴楚縣、圖木舒克市、阿拉爾市、伽師縣、阿拉爾市12團(tuán),而在和田地區(qū)(224團(tuán)1、3、7、8連、洛浦縣、墨玉縣)和昆玉市未發(fā)現(xiàn)檉柳叢枝病。檉柳叢枝病在新疆南疆地區(qū)的平均發(fā)病率為9.06%,平均病情指數(shù)為5.66。溫宿縣和阿拉爾市12團(tuán)的發(fā)病率最高,為19.08%及18.20%,病情指數(shù)最高的地區(qū)為阿拉爾市12團(tuán)和阿克蘇市(3.45和8.25)。在發(fā)病率及病情指數(shù)上各地區(qū)之間具有顯著差異性。表2

表2 不同地區(qū)檉柳叢枝病的發(fā)病率和病情指數(shù)

2.2 檉柳叢枝病病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

研究表明,在10 000X和30 000X透射電鏡觀察感病組織切片,在植物韌皮部的篩管組織中觀察到植原體,菌體較小,形狀有球形,橢圓形及不規(guī)則形,大小從300～600 nm不等。圖2

圖2 透射電鏡觀察

2.3 檉柳叢枝病的分子鑒定

2.3.1 檉柳叢枝病16S rRNA基因和rp基因PCR擴(kuò)增

研究表明,健康檉柳以及ddH2O均未擴(kuò)增到特異性條帶,而檉柳叢枝16S rRNA基因和rp基因巢式PCR在大約1.2 kb處出現(xiàn)特異性條帶。檉柳叢枝16S rRNA基因擴(kuò)增片段大小為1 200 bp左右(GenBank登錄號:MW187566、MW447513、OL687355-OL687381),rp基因擴(kuò)增片片段大小為1 174 bp(GenBank登錄號:MZ365042)。該癥狀由植原體侵染所致,將其命名為新疆檉柳叢枝植原體(SCWB-XJ)。SCWB-XJ菌株包括12Tuan(OL687355-OL687358)、Wensu(OL687377-OL687381)、Jiashi(OL687369-OL687372)、Tumushuke(OL687373-OL687376)、Alar(MW187566、OL687360-OL687363)、Bachu(OL687364-OL687368)、Aks(MW447513、OL687359)。

2.3.2 檉柳叢枝植原體16S rRNA基因序列分析

研究表明,SCWB 16S rRNA基因序列擴(kuò)增片段含有1 219個核苷酸,C+G含量為45%(GenBank登錄號:MW447513),SCWB-XJ 16S rRNA基因與植原體16S rRNA基因同源性均達(dá)到96%以上,其中與16SrXXX組GenBank登錄號為FJ432664的16S rRNA基因相似度最高,為99.67%,與16SrX組GenBank登錄號為GQ249159和JF730310的相似度為98.03%和96.78%,SCWB-XJ 16S rRNA基因序列植原體其他組(16Sr I-16SrX組)的遺傳關(guān)系較遠(yuǎn),與16SrXXX的親緣關(guān)系最近,其中SCWB-Bachu5(GenBank登錄號OL687368)與16SrXXX-A亞組FJ432664序列聚為同一分支,具有較高的親緣關(guān)系,SCWB-XJ最接近16SrXXX-A亞組。圖3

圖3 基于SCWB的16S rRNA基因序列和相關(guān)植原體株系構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3.3 檉柳叢枝植原體rp基因序列

研究表明,SCWB-XJrp基因序列(GenBank登錄號:MZ365042)擴(kuò)增片段含有1 174個核苷酸,C+G含量為26.9%,此序列包含rpS3和rpL22部分序列,分別編碼245和120個蛋白質(zhì),SCWB-XJrp基因序列與植原體16SrX組GenBank登錄號為MG383523和KT9.6161的相似性最高,為84.74%和83.64%。SCWB-XJrp基因序列與其他植原體株系均不在同一分支,與其他植原體株系具有較低的親緣關(guān)系,所以猜測SCWB-XJrp基因?qū)儆谛碌?6SrXXX-rp組。rpS3與植原體16SrX組GenBank登錄號為AEY94416和AYB35976的相似性最高,為82.27%和82.10%,同源性較低,SCWB-XJ rprp基因?qū)儆谛碌?6SrXXX-rp組。圖4

圖4 基于SCWB的rp基因序列和相關(guān)植原體株系構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 新疆南疆SCWB植原體16S rRNA基因多樣性

2.4.1 新疆南疆不同地區(qū)檉柳叢枝16S rRNA基因系統(tǒng)和進(jìn)化

研究表明,可將南疆地區(qū)SCWB植原體分為4個類群,分別是(1)阿拉爾市、圖木舒克市、巴楚縣;(2)溫宿縣;(3)阿克蘇;(4)阿拉爾市12團(tuán)和伽師。南疆SCWB植原體根據(jù)16S rRNA基因序列的差異性,可分為4個株系,分別是SCWB-Alar-Tumushuke-Bachu株系、SCWB-Wensu株系、SCWB-Aks株系和SCWB-12Tuan-Jiashi株系。圖5

圖5 南疆不同地區(qū)SCWB 16S rRNA基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.4.2 新疆南疆不同地區(qū)檉柳叢枝16S rRNA基因同源性

研究表明,7個地區(qū)的SCWB植原體16S rRNA基因核苷酸相似度在96.5%-99.8%。其中,伽師縣和阿拉爾市、圖木舒克市的同源性最高,為99.8%,其次是阿拉爾市和圖木舒克市、阿拉爾市12團(tuán)和伽師縣,同源性為99.7%,同源性最低的是阿克蘇市和溫宿縣,為96.5%。伽師縣和阿拉爾市的變異度最小為0.2,其次是圖木舒克市和阿拉爾市,變異度為0.3,而變異度最大的是溫宿縣與阿克蘇市和巴楚縣,變異度為3.6和3.3。表3

3 討 論

研究結(jié)果符合劉仲健等[7]關(guān)于植原體形態(tài)大小的描述;利用16S rRNA基因和rp基因的擴(kuò)增及序列分析,根據(jù)同源性比對及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,將在新疆南疆地區(qū)發(fā)現(xiàn)的檉柳叢枝病植原體劃分至植原體16SrXXX-A亞組,與Li等[18]的研究結(jié)果一致。

4 結(jié) 論

新疆南疆檉柳叢枝植原體主要可分為4個株系,分別是SCWB-Alar-Tumushuke-Bachu株系、SCWB-Wensu株系、SCWB-Aks株系和SCWB-12Tuan-Jiashi株系;阿克蘇市、溫宿縣、巴楚縣、圖木舒克市、阿拉爾市、伽師縣、阿拉爾市12團(tuán)等地的SCWB植原體16S rRNA基因核苷酸相似度在96.5%～99.8%。