基于PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路探討黃芪多糖對(duì)結(jié)直腸癌自噬的影響

郅強(qiáng)　張楠　馮光玲　孫維義　趙媛媛　楊世發(fā)

摘要：目的 探討黃芪多糖（APS）對(duì)結(jié)直腸癌自噬的影響及其機(jī)制。方法 采用CCK-8法檢測(cè)APS各劑量（0.25 g/L、0.5 g/L、0.75 g/L、1 g/L）組對(duì)人結(jié)直腸癌HCT-116細(xì)胞增殖的影響，通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)APS對(duì)HCT-116細(xì)胞遷移的影響，通過(guò)單丹磺酰尸胺染色檢測(cè)APS對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞自噬的影響，采用Western blot法檢測(cè)APS對(duì)HCT-116細(xì)胞和結(jié)直腸癌荷瘤裸鼠腫瘤中自噬及PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白LC3B、p62、p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、PI3K、Akt及mTOR表達(dá)的影響；通過(guò)免疫組化染色檢測(cè)APS對(duì)結(jié)直腸癌腫瘤中自噬相關(guān)蛋白p62表達(dá)的影響。結(jié)果 APS可抑制HCT-116細(xì)胞增殖，且呈劑量依賴性（P＜0.05）；APS可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬抑制HCT-116細(xì)胞增殖和遷移，而自噬抑制劑3-MA（2 mmol/L）不僅可減弱APS對(duì)HCT-116細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)作用，也可減弱APS對(duì)HCT-116細(xì)胞增殖和遷移的抑制作用（P＜0.05）；APS可上調(diào)HCT-116細(xì)胞及結(jié)直腸癌小鼠腫瘤中自噬相關(guān)蛋白LC3BⅡ/Ⅰ的表達(dá)，下調(diào)p62蛋白的表達(dá)（P＜0.05）；3-MA則可減弱APS對(duì)HCT-116細(xì)胞LC3BⅡ/Ⅰ蛋白表達(dá)的上調(diào)作用，降低APS對(duì)p62蛋白表達(dá)的抑制作用（P＜0.05）；APS可抑制HCT-116細(xì)胞及結(jié)直腸癌小鼠腫瘤中PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt及p-mTOR/mTOR的表達(dá)（P＜0.05）；而通路激動(dòng)劑740Y-P（10 ?mol/L）可減弱APS對(duì)HCT-116細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的抑制作用（P＜0.05）。結(jié)論 APS可誘導(dǎo)結(jié)直腸癌腫瘤和細(xì)胞自噬，并通過(guò)誘導(dǎo)自噬抑制細(xì)胞的增殖及遷移，其機(jī)制可能與抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞：黃芪多糖；結(jié)直腸癌；自噬；PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路

中圖分類號(hào)：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.11958/20220463

Study on the mechanism of astragalus polysaccharides regulating autophagy of colorectal cancer cells based on PI3K/Akt/mTOR signaling pathway

ZHI Qiang ZHANG Nan FENG Guangling SUN Weiyi ZHAO Yuanyuan YANG Shifa

1 Henan University of Traditional Chinese Medicine， Zhengzhou 450000， China; 2 Department of General Minimally Invasive Surgery， the First Affiliated Hospital of Henan University of Traditional Chinese Medicine

△Corresponding Author E-mail： znhnzyydx@163.com

Abstract： Objective To investigate the effect and mechanism of astragalus polysaccharides （APS） on autophagy in colorectal cancer. Methods The effects of various concentrations of APS （0.25 g/L， 0.5 g/L， 0.75 g/L and 1 g/L） on the proliferation of human colorectal cancer HCT-116 cells were detected by CCK-8 test. The effect of APS on the migration of HCT-116 cells was detected by cell scratch assay. The effect of APS on autophagy of colorectal cancer cells was detected by dansylcadaverine staining technique. Effects of APS on autophagy and PI3K/Akt/mTOR signaling pathway related proteins LC3B， p62， p-PI3K， p-Akt， p-mTOR， PI3K， Akt and mTOR in HCT-116 cells and colorectal cancer tumor-bearing nude mice were detected by Western blot assay. The expression of autophagy-related protein p62 in colorectal cancer tumors was detected by immunohistochemistry. Results APS inhibited HCT-116 cell proliferation in a dose-dependent manner （P＜0.05）. APS could inhibit the proliferation and migration of HCT-116 cells by inducing autophagy （P＜0.05）. The autophagy inhibitor 3-MA （2 mmol/L） not only attenuated the autophagy induction effect of APS on HCT-116 cells， but also attenuated the inhibitory effect of APS on the proliferation and migration of HCT-116 cells （P＜0.05）. APS could increase the expression ratio of autophagy-related protein LC3BⅡ/Ⅰ and reduce the expression level of p62 protein in HCT-116 cells and colorectal cancer mice （P＜0.05）. 3-MA could attenuate the increasing effect of APS on the expression ratio of LC3BⅡ/Ⅰ protein and reduce the inhibitory effect of APS on the expression of p62 protein in HCT-116 cells （P＜0.05）. APS could reduce the expression ratio of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway related proteins p-PI3K/PI3K， p-Akt/Akt and p-mTOR/mTOR in HCT-116 cells and colorectal cancer tumor （P＜0.05）. The pathway agonist 740Y-P （10 μmol/L） could attenuate the inhibitory effect of APS on expression levels of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway-related proteins in HCT-116 cells （P＜0.05）. Conclusion APS can induce autophagy activation in colorectal cancer tumor tissue and cells， and inhibit cell proliferation and migration of HCT-116 cells by inducing autophagy. The mechanism of action may be related to the inhibition of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway.

Key words： astragalus polysaccharides; colorectal cancer; autophagy; PI3K/Akt/mTOR signaling pathway

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是最常見的胃腸道惡性腫瘤，盡管早期診斷方法和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)手段不斷發(fā)展，其發(fā)病率及病死率呈逐年升高趨勢(shì)［1］，因此尋找結(jié)直腸癌新療法意義重大。黃芪多糖（astragalus polysaccharides，APS）是黃芪的重要活性成分，具有廣譜抗腫瘤效果，近些年用于抗癌尤其是結(jié)直腸癌的研究日益受到重視［2-4］。自噬是細(xì)胞維持體內(nèi)平衡的重要機(jī)制，在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可以發(fā)揮雙向作用，用于結(jié)直腸癌治療研究頗有前景［5］。有研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)中，磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號(hào)通路發(fā)揮著重要的負(fù)向調(diào)控作用［6］。PI3K/Akt/mTOR信號(hào)傳導(dǎo)亦作為腫瘤進(jìn)展中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，調(diào)節(jié)癌細(xì)胞增殖［7］。本課題組前期研究表明，APS對(duì)結(jié)直腸癌荷瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用［8］，但其作用機(jī)制尚不明確。本研究通過(guò)探索APS對(duì)人結(jié)直腸癌HCT-116細(xì)胞和結(jié)直腸癌荷瘤小鼠腫瘤自噬的影響，研究APS對(duì)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)一步探討APS抗結(jié)直腸癌的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及儀器

1.1.1 細(xì)胞株及結(jié)直腸癌腫瘤組織 人結(jié)直腸癌HCT-116細(xì)胞系購(gòu)自北納生物科技有限公司，貨號(hào)BNCC342188。結(jié)直腸癌荷瘤小鼠腫瘤組織系課題組前期實(shí)驗(yàn)留存的腫瘤組織蠟塊和冰凍腫瘤組織標(biāo)本［8］。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（豫）2019-0002。

1.1.2 藥物及試劑 黃芪多糖標(biāo)準(zhǔn)品（SA9790）、RPMI 1640培養(yǎng)基（31800）、免疫組化試劑盒（SP0041）、細(xì)胞自噬染色檢測(cè)試劑盒（G0170）、CCK-8試劑（CA1210）均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；自噬抑制劑3-MA（GC10710）、PI3K激動(dòng)劑740Y-P（GC16157）均購(gòu)自美國(guó)Glpbio公司，胎牛血清（11011-8611）購(gòu)自浙江天杭生物科技有限公司，p-PI3K兔多抗（4228T）、mTOR兔單抗（2983T）均購(gòu)自美國(guó)CST公司，LC3B兔多抗（GTX127375）購(gòu)自美國(guó)GeneTex公司，PI3K鼠單抗（67644-1-Ig）、Akt鼠單抗（60203-2-Ig）、p-Akt鼠單抗（66444-1-Ig）、p-mTOR兔重組抗體（80596-1-RR）、p62兔多抗（18420-1-AP）、GAPDH鼠單抗（60004-1-Ig）、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（H+L，SA00001-1）及HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（H+L，SA00001-2）均購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 超凈工作臺(tái)（SW-CS-IFD，蘇州凈化設(shè)備公司），細(xì)胞培養(yǎng)箱（ROC-3000TVBB，美國(guó)REVCO公司），倒置相差顯微鏡（CK40，日本Olympus公司），倒置熒光顯微鏡（DM3000型，德國(guó)Leica公司），酶標(biāo)儀（MK3型，美國(guó)Thermo Fisher公司），凝膠成像分析系統(tǒng)（Bio-Rad ChemiDoc XRS+型，美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 在37 ℃恒溫水浴鍋中復(fù)蘇HCT-116細(xì)胞，置于25 cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入1640完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素），移入37 ℃、5%CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞匯合度達(dá)80%～90%時(shí)進(jìn)行1∶3傳代或凍存。取培養(yǎng)3代后的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)APS對(duì)HCT-116細(xì)胞增殖的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HCT-116細(xì)胞，以2×104個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，設(shè)置5組：control組（1640完全培養(yǎng)基）及0.25、0.5、0.75、1 g/L APS組，另設(shè)僅添加基礎(chǔ)培養(yǎng)基的空白孔，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)板外圍各孔加入PBS防止培養(yǎng)板液蒸發(fā)，放入37 ℃、5%CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至貼壁后，加入上述濃度APS分別干預(yù)12、24、48 h。加入CCK-8工作液，避光孵育1 h，使用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)光密度（OD）值。計(jì)算細(xì)胞增殖活性=（APS組OD值?空白孔OD值）/（control組OD值?空白孔OD值）×100%。為探究APS對(duì)HCT-116細(xì)胞增殖的影響是否與調(diào)控自噬有關(guān)，按照上述方法設(shè)置control組（1640完全培養(yǎng)基干預(yù)）、APS組（1 g/L）、3-MA組（2 mmol/L）、APS+3-MA組（1 g/L APS+2 mmol/L 3-MA）共4組，另設(shè)僅添加培養(yǎng)基的空白孔，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。干預(yù)24 h后，檢測(cè)各組OD值。

1.2.3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)APS對(duì)HCT-116細(xì)胞遷移的影響 取培養(yǎng)3代后并處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT-116細(xì)胞，以2×105個(gè)/孔接種于6孔培養(yǎng)板，置于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。設(shè)置4組，包括control組（1640完全培養(yǎng)基）、APS組（1 g/L）、3-MA組（2 mmol/L）以及APS+3-MA組（1 g/L APS+2 mmol/L 3-MA）。當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)90%時(shí)，使用200 μL槍頭垂直劃痕，PBS清洗，置于倒置顯微鏡下觀察拍照。然后各組加入相應(yīng)藥物試劑繼續(xù)培養(yǎng)24 h。干預(yù)結(jié)束后，使用PBS清洗，置于40倍顯微鏡下拍照，測(cè)距并計(jì)算遷移率=（干預(yù)前劃痕寬度?干預(yù)后劃痕寬度）/（干預(yù)前劃痕寬度）×100%。

1.2.4 單丹磺酰尸胺（Dansylcadaverine，MDC）染色檢測(cè)APS對(duì)HCT-116細(xì)胞自噬的影響 取培養(yǎng)3代后處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，設(shè)置control組（1640完全培養(yǎng)基）、APS組（1 g/L）及APS+3-MA組（1 g/L APS+2 mmol/L 3-MA）。以2×105個(gè)/孔接種于6孔培養(yǎng)板，置于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后加藥干預(yù)24 h。棄去6孔板中液體，加入300 μL 1× wash buffer洗2次，而后每孔加入600 μL MDC工作液，室溫避光染色25 min，棄掉染色液，以300 μL 1× wash buffer洗3次。置于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞自噬體生成情況，設(shè)置激發(fā)濾光片波長(zhǎng)355 nm，阻斷濾光片波長(zhǎng)512 nm。選取3個(gè)視野拍照，使用Image J軟件檢測(cè)平均熒光強(qiáng)度。

1.2.5 結(jié)直腸癌荷瘤小鼠腫瘤組織的分組及干預(yù) 雄性SPF級(jí)BALB/C裸鼠腫瘤組織設(shè)3組：control組（腹腔注射生理鹽水，20 mL/kg），APS低劑量組（APS L組，腹腔注射APS，50 mg/kg），APS高劑量組（APS H組，腹腔注射APS，250 mg/kg）；每日1次，連續(xù)21 d。

1.2.6 Western blot檢測(cè)LC3B和p62蛋白表達(dá) 取培養(yǎng)3代后并處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT-116細(xì)胞，以2×105個(gè)/孔接種于6孔培養(yǎng)板，置于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。設(shè)置control組（1640完全培養(yǎng)基）、APS組（1 g/L）、3-MA組（2 mmol/L）、APS+3-MA組（1 g/L APS+2 mmol/L 3-MA）。培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后，各組加入相應(yīng)藥物干預(yù)24 h，裂解HCT-116細(xì)胞。將凍存的結(jié)直腸癌小鼠腫瘤組織解凍、剪碎，加入裂解液，使用磁珠及振蕩器研磨組織，離心后提取上清液。使用BCA試劑盒測(cè)定腫瘤細(xì)胞及腫瘤組織蛋白濃度。進(jìn)行10% SDS-PAGE凝膠電泳，80 V 30 min行濃縮膠電泳，120 V 1 h行分離膠電泳。電泳結(jié)束將目的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，使用5%脫脂奶粉封閉1 h。一抗LC3B（1∶1 000）、p62（1∶1 000）、GAPDH（1∶50 000）于4 ℃條件下孵育過(guò)夜。TBST洗滌3次，使用HRP標(biāo)記的山羊抗鼠、山羊抗兔IgG二抗（1∶2 000）于搖床室溫孵育1 h。TBST洗滌后使用ECL超敏發(fā)光液對(duì)PVDF膜增強(qiáng)發(fā)光，顯影儀器對(duì)目的條帶進(jìn)行掃描顯影，使用Image J檢測(cè)條帶灰度值。

1.2.7 Western blot檢測(cè)p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、PI3K、Akt及mTOR蛋白表達(dá) 方法同1.2.6。實(shí)驗(yàn)設(shè)置control組（1640完全培養(yǎng)基）、APS組（1 g/L）、740Y-P組（10 μmol/L）、APS+740Y-P組（1 g/L APS+10 μmol/L 740Y-P）?？贵w為p-PI3K（1∶1 000）、p-Akt（1∶2 000）、p-mTOR（1∶5 000）、PI3K（1∶1 000）、Akt（1∶5 000）、mTOR（1∶1 000）和GAPDH（1∶50 000）。

1.2.8 免疫組化染色檢測(cè)腫瘤組織p62蛋白表達(dá)情況 檢查并挑選保存良好的腫瘤組織石蠟包埋塊，制作4 μm厚度的腫瘤組織石蠟切片。使用二甲苯、無(wú)水乙醇、梯度乙醇和PBS對(duì)切片常規(guī)脫蠟至水。使用檸檬酸鈉抗原修復(fù)液對(duì)切片進(jìn)行抗原熱修復(fù)，PBS洗3次。將切片上附著的目的組織用免疫組化筆圈住，于濕盒中滴加3% H2O2反應(yīng)5～10 min以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS漂洗。滴加山羊血清封閉液覆蓋組織，于室溫下反應(yīng)30 min。滴加p62抗體（1∶100）于4 ℃條件下孵育過(guò)夜。PBS清洗后，滴加Bio-抗小鼠/兔IgG二抗工作液（1∶100），室溫孵育30 min，PBS清洗3遍。滴加鏈霉親和素-POD工作液，室溫反應(yīng)30 min，反應(yīng)結(jié)束后PBS清洗3次。使用DBA工作液于室溫下避光使切片顯色，待3 min后在顯微鏡下觀察目的組織呈現(xiàn)黃褐色后，使用超純水終止反應(yīng)，將切片浸入蘇木素工作液中復(fù)染2 min。滴加分化液反應(yīng)10 s，放入自來(lái)水中10 min。使用梯度乙醇、無(wú)水乙醇和二甲苯對(duì)切片透明脫水，滴加中性樹脂封片。顯微鏡下觀察切片p62蛋白表達(dá)情況，拍照，使用Image J軟件檢測(cè)積分光密度（IOD）值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0和GraphPad Prism 8.0.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和繪圖。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以[[x] ±s

]表示，多組間比較采用單因素方差分析或重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，組間多重比較行Tukey檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組HCT-116細(xì)胞增殖活性變化 組間比較：除0.25 g/L APS組12 h時(shí)細(xì)胞增殖活性與control組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）外，APS各劑量組細(xì)胞增殖活性均降低；隨APS劑量增高，細(xì)胞增殖活性基本呈降低趨勢(shì)（P＜0.05）。見表1。

2.2 各組HCT-116細(xì)胞自噬水平變化 APS組細(xì)胞內(nèi)綠色點(diǎn)狀熒光強(qiáng)度（0.85±0.10）較control組（0.48±0.09）和APS+3-MA組（0.51±0.10）明顯增強(qiáng)（n=3，F(xiàn)=14.320，P＜0.05），APS+3-MA組與control組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1。

2.3 各組HCT-116細(xì)胞增殖和遷移能力變化 與control組相比，APS組和APS+3-MA組細(xì)胞增殖活性和細(xì)胞遷移率均降低（P＜0.05），3-MA組變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與APS組相比，3-MA組和APS+3-MA組細(xì)胞增殖活性和細(xì)胞遷移率均增高（P＜0.05）；與3-MA組相比，APS+3-MA組細(xì)胞增殖活性和細(xì)胞遷移率降低（P＜0.05），見圖2、表2。

2.4 各組HCT-116細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白p62及LC3B表達(dá)變化 與control組相比，APS組LC3BⅡ/Ⅰ蛋白表達(dá)水平增高，p62蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；3-MA組LC3BⅡ/Ⅰ蛋白表達(dá)水平降低，p62蛋白表達(dá)水平增高（P＜0.05）；APS+3-MA組LC3BⅡ/Ⅰ、p62蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與APS組相比，3-MA組和APS+3-MA組LC3BⅡ/Ⅰ蛋白表達(dá)水平均降低，p62蛋白表達(dá)水平均增高（P＜0.05）。與3-MA組相比，APS+3-MA組LC3BⅡ/Ⅰ蛋白表達(dá)水平增高（P＜0.05），p62蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3、圖3。

2.5 各組HCT-116細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)變化 與control組相比，APS組p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR蛋白的相對(duì)表達(dá)量均降低（P＜0.05），740Y-P組p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR蛋白的相對(duì)表達(dá)量均增高（P＜0.05），APS+740Y-P組p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR蛋白的相對(duì)表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與APS組相比，740Y-P組和APS+740Y-P組p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt及p-mTOR/mTOR蛋白的相對(duì)表達(dá)量均增高（P＜0.05）；與740Y-P組相比，APS+740Y-P組p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR蛋白的相對(duì)表達(dá)量均降低（P＜0.05），見表4、圖4。

2.6 各組結(jié)直腸癌荷瘤小鼠腫瘤自噬相關(guān)蛋白p62及LC3B表達(dá)變化 Western blot與免疫組化染色結(jié)果顯示，與control組相比，APS L組和APS H組LC3BⅡ/Ⅰ蛋白表達(dá)水平增高，p62蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與APS L組相比，APS H組LC3BⅡ/Ⅰ蛋白表達(dá)水平增高，p62蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），見表5，圖5、6。

2.7 APS對(duì)結(jié)直腸癌荷瘤小鼠腫瘤PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 APS L組和APS H組p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt及p-mTOR/mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量低于control組，APS H組p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt及p-mTOR/mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量低于APS L組（P＜0.05），見表5、圖7。

3 討論

結(jié)直腸癌具有發(fā)病率高、預(yù)后差和病死率高的特點(diǎn)［9］。APS是黃芪的主要活性成分，常用于結(jié)直腸癌患者的輔助治療［10-11］。本課題組前期研究表明，APS對(duì)結(jié)直腸癌荷瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用［8］。本研究旨在進(jìn)一步探討APS抗結(jié)直腸癌的作用機(jī)制。

自噬是一種真核細(xì)胞中發(fā)生的溶酶體降解胞內(nèi)蛋白質(zhì)和細(xì)胞器等成分的生理過(guò)程，包括癌癥在內(nèi)的多種疾病都與自噬密切相關(guān)［12］。近些年，靶向自噬治療癌癥越來(lái)越受到重視。研究表明自噬在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中具有雙重作用，一方面，自噬激活可抑制結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展，甚至誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞出現(xiàn)自噬性死亡；另一方面，自噬也可在惡劣環(huán)境（如饑餓）下維持結(jié)直腸癌的細(xì)胞活性［13-14］。本研究結(jié)果顯示，APS可以促使人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT-116和結(jié)直腸癌小鼠腫瘤發(fā)生自噬，誘導(dǎo)HCT-116細(xì)胞自噬體的形成，且自噬抑制劑3-MA可減弱APS對(duì)HCT-116細(xì)胞誘導(dǎo)自噬、抑制增殖和遷移的作用。LC3及p62是自噬相關(guān)的標(biāo)志性蛋白，在自噬被激活時(shí)，LC3會(huì)被轉(zhuǎn)化為胞漿型LC3（LC3Ⅰ），進(jìn)而被修飾成膜結(jié)合型LC3（LC3Ⅱ）并結(jié)合到自噬體膜上，同時(shí)選擇性自噬的接頭蛋白p62可連接LC3Ⅱ和泛素化底物，并在自噬溶酶體內(nèi)被降解［15］。本研究結(jié)果顯示，APS可以促進(jìn)HCT-116細(xì)胞及結(jié)直腸癌小鼠腫瘤自噬相關(guān)蛋白LC3BⅠ向LC3BⅡ轉(zhuǎn)化，并減少p62蛋白的聚集，進(jìn)一步證明APS對(duì)結(jié)直腸癌自噬的激活作用。

研究表明，PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路作為細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)傳導(dǎo)通路，參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展，抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的信號(hào)傳導(dǎo)是目前結(jié)直腸癌重要的潛在治療策略［6，16］。另有研究表明，PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路亦是自噬的負(fù)向調(diào)控通路，當(dāng)該通路以磷酸化形式激活時(shí)，會(huì)抑制自噬的發(fā)生［17］。本研究結(jié)果顯示，APS可以抑制HCT-116細(xì)胞及小鼠腫瘤組織中PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt及p-mTOR/mTOR的表達(dá)，并誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，提示APS通過(guò)誘導(dǎo)自噬發(fā)揮抗結(jié)直腸癌作用的機(jī)制可能與APS抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，APS可通過(guò)誘導(dǎo)自噬及抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路發(fā)揮抗結(jié)直腸癌作用。

參考文獻(xiàn)

［1］ SUNG H，F(xiàn)ERLAY J，SIEGEL R L，et al. Global Cancer Statistics 2020：GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 Countries［J］. CA Cancer J Clin，2021，71（3）：209-249. doi：10.3322/caac.21660.

［2］ 招志輝，丘振文，招遠(yuǎn)明. 黃芪多糖通過(guò)調(diào)控miR-20a/TGFBR2分子軸降低結(jié)直腸癌HT-29/DDP細(xì)胞的順鉑耐藥性［J］. 中國(guó)腫瘤生物治療雜志，2019，26（4）：417-425. ZHAO Z H，QIU Z W，ZHAO Y M. Astragalus polysaccharide reduces cisplatin resistance in colorectal cancer HT-29/DDP cells by regulating the miR-20a/TGFBR2 molecular axis［J］. Chinese Journal of Cancer Biotherapy，2019，26（4）：417-425. doi：10.3872/j.issn.1007-385x.2019.04.008.

［3］ SONG J，CHEN Y，HE D，et al. Astragalus polysaccharide promotes adriamycin-induced apoptosis in gastric cancer cells［J］. Cancer Manag Res，2020，12：2405-2414. doi：10.2147/CMAR.S237146.

［4］ YANG S，SUN S，XU W，et al. Astragalus polysaccharide inhibits breast cancer cell migration and invasion by regulating epithelial-mesenchymal transition via the Wnt/β-catenin signaling pathway［J］. Mol Med Rep，2020，21（4）：1819-1832. doi：10.3892/mmr.2020.10983.

［5］ ZHU X，CHEN Y，LIN M，et al. Qingjie Fuzheng Granule inhibits EMT and induces autophagy in colorectal cancer via mTOR signaling pathways［J］. Evid Based Complement Alternat Med，2021，2021：9950499. doi：10.1155/2021/9950499.

［6］ WANG J，LIANG D，ZHANG X P，et al. Novel PI3K/Akt/mTOR signaling inhibitor，W922，prevents colorectal cancer growth via the regulation of autophagy［J］. Int J Oncol，2021，58（1）：70-82. doi：10.3892/ijo.2020.5151.

［7］ POLIVKA J Jr，JANKU F. Molecular targets for cancer therapy in the PI3K/AKT/mTOR pathway［J］. Pharmacol Ther，2014，142（2）：164-175. doi：10.1016/j.pharmthera.2013.12.004.

［8］ 趙媛媛，張楠，孫維義，等. 黃芪多糖對(duì)裸鼠結(jié)直腸癌移植瘤的抑制作用［J］. 鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2021，56（3）：375-379. ZHAO Y Y，ZHANG N，SUN W Y. Inhibitory effects of astragalus polysaccharides on colorectal cancer xeno-grafted tumors in nude mice［J］. Journal of Zhengzhou University（Medical Sciences），2021，56（3）：375-379. doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2020.11.071.

［9］ 中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì). 中國(guó)結(jié)直腸癌診療規(guī)范（2020年版）［J］. 中華外科雜志，2020，58（8）：561-585. National Health Commission of the People's Republic of China. Chinese protocol of diagnosis and treatment of colorectal cancer （2020 edition）［J］. Chinese Journal of Surgery，2020，58（8）：561-585. doi：10.3760/cma.j.cn112139-20200518-00390.

［10］ CHEN Z，LIU L，GAO C，et al. Astragali Radix （Huangqi）：A promising edible immunomodulatory herbal medicine［J］. J Ethnopharmacol，2020，258：112895. doi：10.1016/j.jep.2020.112895.

［11］ 趙媛媛，張楠，孫維義，等. 黃芪多糖聯(lián)合新輔助化療與新輔助化療對(duì)結(jié)直腸癌患者血清外泌體表達(dá)水平影響的對(duì)比研究［J］. 河南外科學(xué)雜志，2021，27（4）：15-18. ZHAO Y Y，ZHANG N，SUN W Y，et al. Effects of astragalus polysaccharide combined with neoadjuvant chemotherapy on serum exosomes in patients with colorectal cancer［J］. Henan Journal of Surgery，2021，27（4）：15-18. doi：10.16193/j.cnki.hnwk.2021.04.006.

［12］ GALLUZZI L，GREEN D R. Autophagy-independent functions of the autophagy machinery［J］. Cell，2019，177（7）：1682-1699. doi：10.1016/j.cell.2019.05.026.

［13］ AMARAVADI R K，KIMMELMAN A C，DEBNATH J. Targeting autophagy in cancer：Recent advances and future directions［J］. Cancer Discov，2019，9（9）：1167-1181. doi：10.1158/2159-8290.CD-19-0292.

［14］ LI S，WANG X，WANG G，et al. Ethyl acetate extract of selaginella doederleinii hieron induces cell autophagic death and apoptosis in colorectal cancer via PI3K-Akt-mTOR and AMPKα-signaling pathways［J］. Front Pharmacol，2020，11：565090. doi：10.3389/fphar.2020.565090.

［15］ DYSHLOVOY S A. Blue-print autophagy in 2020：A critical review［J］. Mar Drugs，2020，18（9）：482. doi：10.3390/md18090482.

［16］ SANAEI M J，BAGHERY SAGHCHY KHORASANI A，POURBAGHERI-SIGAROODI A，et al. The PI3K/Akt/mTOR axis in colorectal cancer：Oncogenic alterations，non-coding RNAs，therapeutic opportunities，and the emerging role of nanoparticles［J］. J Cell Physiol，2022，237（3）：1720-1752. doi：10.1002/jcp.30655.

［17］ DUAN Y，HAYBAECK J，YANG Z. Therapeutic potential of PI3K/AKT/mTOR pathway in gastrointestinal stromal tumors：Rationale and progress［J］. Cancers （Basel），2020，12（10）：2972. doi：10.3390/cancers12102972.

（2022-04-01收稿 2022-09-02修回）

（本文編輯 陳麗潔）