血管細胞外基質膠促進骨髓CD34+祖細胞分化為內皮細胞的實驗研究

左芯萌　王振華　高利平

摘要：目的 研究血管細胞外基質（ECM）膠促進骨髓CD34+祖細胞分化為內皮細胞的作用。方法 將人主動脈組織脫細胞后得到ECM，胃蛋白酶消化后得到ECM膠。HE染色和DAPI染色觀察主動脈組織脫細胞效果。將小鼠骨髓CD34+祖細胞分為2組：纖連蛋白（FN）組置于涂有FN的培養(yǎng)板中培養(yǎng)；ECM組置于板底鋪有人主動脈ECM膠的培養(yǎng)板中培養(yǎng)。逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測CD34+祖細胞CD31、內皮型一氧化氮合酶（eNOS）及血管性血友病因子（VWF）mRNA表達；流式細胞術檢測CD34+祖細胞表面標志物CD31、CD144、血管內皮生長因子受體2（VEGFR2）、CD133及CD45陽性細胞百分率；熒光顯微鏡下觀察吞噬熒光素標記的乙?；兔芏戎鞍祝―iI-acLDL）的細胞數(shù)；蛋白芯片檢測細胞分泌的促血管生成因子含量。結果 DAPI和HE染色均顯示人主動脈組織脫細胞前含有大量細胞核，而脫細胞后得到的血管ECM中不含細胞核。與FN組相比，ECM組CD34+祖細胞CD31、eNOS及VWF mRNA表達升高，表達CD31、CD144及VEGFR2的陽性細胞率及吞噬Dil-acLDL的細胞數(shù)量增加，而表達CD133和CD45的陽性細胞率減少（P＜0.05）。ECM組分泌血管生成素、成纖維細胞生長因子7、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、瘦素及血小板源性生長因子BB較FN組增多（P＜0.05）。結論 血管ECM膠可促進骨髓CD34+祖細胞分化為內皮細胞，可能為心血管植入物原位內皮化提供新策略。

關鍵詞：細胞外基質；內皮細胞；細胞分化；CD34+祖細胞；內皮化

中圖分類號：R331.3 文獻標志碼：A DOI：10.11958/20221138

Experimental study of vascular extracellular matrix gel promoting the differentiation of bone marrow CD34+ progenitor cells into endothelial cells

ZUO Xinmeng WANG Zhenhua GAO Liping

1 Department of Physiology， School of Basic Medicine， Xuzhou Medical University， Xuzhou 221004， China; 2 Department of Cardiovascular Surgery， Ren Ji Hospital， School of Medicine， Shanghai Jiao Tong University

Corresponding Author E-mail： pandag2011@sina.com

Abstract： Objective To investigate the role of vascular extracellular matrix （ECM） gel in promoting the differentiation of bone marrow CD34+ progenitor cells into endothelial cells. Methods ECM was obtained from the decellularized aortic tissue， and vascular ECM gel was prepared by enzyme digestion of vascular ECM. HE staining and DAPI staining were used to observe the decellularization effect of aortic tissue. Mouse bone marrow CD34+ progenitor cells were divided into two groups： the fibronectin （FN） group was cultured in plates coated with FN， and the ECM group was cultured in plates coated with human aorta ECM gel at the bottom of the plate. The mRNA expression of CD31， endothelial nitric oxide synthase （eNOS） and Von willebrand factor （VWF） were detected by RT-PCR in both groups. Flow cytometry was used to detect the percentage rates of positive CD31， CD144， vascular endothelial growth factor receptor 2 （VEGFR2）， CD133 and CD45 positive cells. The number of phagocytic fluorescein labeled acetylated low-density lipoprotein （DiI-acLDL） cells was observed under fluorescence microscope. The content of proangiogenic factors secreted by cells was detected by protein microarray. Results Both HE and DAPI staining showed that human aortic tissue contained a large number of nuclei before decellularization， while the vascular ECM obtained after decellularization did not contain nuclei. Compared with the FN group， the expression levels of CD31， eNOS and VWF mRNA in CD34+ progenitor cells were increased， the positive rates of CD31， CD144 and VEGFR2 expressing cells and the number of phagocytosing Dil-acLDL cells were also increased in the ECM group， while the positive rates of CD133 and CD45 expressing cells decreased （P＜0.05）. The secretion of angiopoietin， fibroblast growth factor 7， granulocyte macrophage colony stimulating factor， leptin and platelet-derived growth factor BB were significantly higher in the ECM group than those of the FN group （P＜0.05）. Conclusion Vascular ECM gel promotes the differentiation of bone marrow CD34+ progenitor cells into endothelial cells， which may provide a new strategy for in situ endothelialization of cardiovascular implants.

Key words： extracellular matrix; endothelial cells; cell differentiation; CD34+ progenitor cells; endothelialization

心血管疾病致死已占據我國城鄉(xiāng)居民死亡原因的首位，其中引起死亡最常見的心血管疾病為冠心?。?］。目前，治療冠心病的主要手段為冠狀動脈支架植入術和冠狀動脈旁路移植術。然而，植入到冠狀動脈內的血管支架和人工血管在術后均可能導致冠狀動脈內血栓形成及血管狹窄等并發(fā)癥［2-3］。研究發(fā)現(xiàn)，植入材料原位內皮化是解決血管內血栓及狹窄最有效的方法［4-5］。近期，通過捕獲血液中的干/祖細胞并使之黏附在植入材料表面從而使材料內皮化的思路受到廣泛關注，如Genous和COMBO心臟支架的表面包埋有CD34抗體，可捕獲血液中CD34＋祖細胞，使之粘附在支架表面；然而，這些支架表面捕獲的祖細胞除分化為內皮細胞外，還可分化為其他細胞，如免疫細胞及平滑肌細胞等，不能實現(xiàn)植入材料表面完全內皮化［6］。由于細胞外基質（ECM）可提供特定的信號，誘導干/祖細胞分化為與ECM來源相同的組織或細胞［7-8］，因此，本研究制備了血管ECM膠，并觀察其誘導祖細胞分化為內皮細胞的效果，以期為心血管植入材料表面內皮化提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物和組織 清潔級C57BL/6J小鼠36只，6周齡，體質量（20±2）g，雌雄不限，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，動物生產許可證號：SCXK（滬）2017-0005。小鼠常規(guī)進食飲水，飼養(yǎng)1周后進行實驗。人主動脈組織標本來自2014年6月—2015年10月上海仁濟醫(yī)院心血管外科行主動脈置換術的8例患者，其中男5例，女3例，年齡27～60歲。所取標本均取得患者知情同意，利用人主動脈組織進行的試驗研究已通過上海仁濟醫(yī)院倫理委員會批準（批準號：2012027）。

1.1.2 主要試劑和儀器 6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、十二烷基硫酸鈉（SDS）和胃蛋白酶購自美國Sigma公司；Ⅰ型DNA酶購自瑞士Roche公司；胎牛血清購自法國Biowest公司；小鼠CD34磁珠購自德國美天旎公司；RNA提取試劑盒購自美國zymo research公司；小鼠流式抗體CD31、CD34、CD133、CD144、CD45、血管內皮生長因子受體2（VEGFR2）購自美國Biolegend公司；1，1'-雙十八烷基-3，3，3'，3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸鹽標記的乙?；兔芏戎鞍祝―iI-acLDL）購自美國Invitrogen公司；小鼠蛋白芯片（型號：AAM-ANG-1）購自美國Raybiotech公司。冷凍真空干燥機（美國SP工業(yè)公司）；冰凍切片機（德國徠卡公司）；流式細胞分析儀（美國BD公司）；掃描化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)（型號Image Quant LAS 4000，美國GE公司）；光學顯微鏡、熒光顯微鏡（日本尼康公司）。

1.2 方法

1.2.1 血管ECM制備 用預冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗主動脈標本（圖1）后將其切成1 cm×1 cm小塊，用包埋劑包埋后在低溫冰箱中放置2 h。用冰凍切片機將包埋的主動脈組織切成50 ?m厚的薄片，在0.5% SDS溶液中震蕩12 h后用雙蒸水充分漂洗主動脈組織切片，以脫去主動脈組織內細胞，再用Ⅰ型DNA酶溶液浸泡過夜，最后用冷凍真空干燥機干燥后保存。使用前在75%乙醇中浸泡2 h，然后紫外線照射8 h滅菌。

1.2.2 ECM膠制備 將制備好的ECM用液氮冷凍后研磨成粉末，置于含0.1 mol/L鹽酸的胃蛋白酶溶液（1 g/L）中，攪拌72 h，得到的ECM液用1 mol/L氫氧化鈉中和至中性，逐滴加入10×PBS使之形成黏稠膠液，鋪滿培養(yǎng)板板底，用冷凍真空干燥機干燥，紫外線照射8 h后使用。

1.2.3 組織學觀察 HE染色和DAPI染色觀察主動脈組織脫細胞效果。

1.2.4 小鼠骨髓CD34+祖細胞分離、分組及生長情況觀察 C57BL/6J小鼠頸椎脫臼法處死后，剪下小鼠前后肢，Hank's液沖洗小鼠脛腓骨骨髓腔，得到小鼠骨髓懸液；以淋巴細胞分離液室溫下進行密度梯度離心后，在血漿層與分離液之間獲取骨髓單個核細胞；然后加入1% BSA溶液封閉離心，再加入20 μL CD34磁珠，4 ℃避光孵育15 min，在分離柱上分離出小鼠骨髓CD34+祖細胞，取部分細胞與小鼠CD34流式抗體孵育后用流式細胞術檢測其純度。分離的細胞分為2組：纖連蛋白（FN）組置于涂有FN的培養(yǎng)板中培養(yǎng)；ECM組置于板底鋪有人主動脈ECM膠的培養(yǎng)板中培養(yǎng)。2組均加入含15%胎牛血清的改良杜氏培養(yǎng)液（IMDM）培養(yǎng)，所有培養(yǎng)液中不另加生長因子。在培養(yǎng)的第5天用光學顯微鏡觀察CD34+祖細胞在FN和ECM膠上的生長情況。

1.2.5 逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測CD34+祖細胞CD31、內皮型一氧化氮合酶（eNOS）及血管性血友病因子（VWF）mRNA表達 將密度為1×106個/mL的CD34+祖細胞分別種植于鋪有FN和ECM膠的培養(yǎng)板內，培養(yǎng)14 d時收集2組細胞。每組細胞采用Trizol法提取細胞總RNA，逆轉錄為cDNA后，利用PCR檢測CD31、eNOS及VWF mRNA表達量。引物由上海生工生物工程有限公司合成，CD31引物：上游5′-CCAAGGTGGGATCGTGAGG-3′，下游5′-TCGGAAGGATAAAACGCGGTC-3′，產物大小187 bp；VWF引物：上游5′-ATGATTCCTGCCAGATTTGC-3′，下游5′-TGTCCCCCTGGTTTCTCAGA-3′，產物大小328 bp；eNOS引物：上游5′-TGATGGCGAAGCGAGTGAAG，下游5′-ACTCATCCATACACAGGACCC，產物大小129 bp；β-actin引物：上游5′-GCCACCCAGAAGACTGTGGAT-3′，下游5′-TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC-3′，產物大小154 bp。反應條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s，循環(huán)30次。RT-PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳及顯像，所得圖像用Image J軟件進行半定量分析。

1.2.6 流式細胞術檢測CD34+祖細胞表面標志物表達 在培養(yǎng)21 d時分別收集FN組和ECM組細胞，PBS洗滌重懸后，2組細胞懸液都分為5管，每管100 μL，含細胞1×106個，然后分別加入小鼠CD31、CD144、VEGFR2、CD133及CD45流式抗體2 μL，室溫下冰上避光孵育30 min后用流式細胞儀檢測各標志物陽性細胞百分率，結果采用CFlow Plus軟件分析。

1.2.7 細胞吞噬功能觀察 用IMDM培養(yǎng)液稀釋DiI-acLDL，使其質量濃度為40 mg/L。在FN組和ECM組細胞培養(yǎng)至14 d時，取400 μL的DiI-acLDL溶液，分別加入2組細胞中，37 ℃孵育4 h，然后去掉培養(yǎng)液，PBS重懸后在熒光顯微鏡下觀察吞噬DiI-acLDL的細胞數(shù)。

1.2.8 蛋白芯片檢測CD34+祖細胞分泌的促血管生成因子表達 培養(yǎng)至14 d時收集2組細胞上清液，小鼠蛋白芯片檢測CD34+祖細胞分泌的促血管生成因子的含量，利用掃描化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)掃描蛋白芯片并提取數(shù)據，采用AAM-ANG-1蛋白芯片自帶軟件分析。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad Prism 5.0軟件進行數(shù)據分析。計量資料用x±s表示，2組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 血管ECM染色及CD34+祖細胞種植情況 DAPI和HE染色均顯示人主動脈組織脫細胞前含大量細胞核，而脫細胞后得到的血管ECM中不含細胞核，見圖2。從小鼠骨髓分離出來的CD34+祖細胞純度為90.4%，見圖3。培養(yǎng)第5天發(fā)現(xiàn)ECM組CD34+祖細胞生長密集，分布均勻，而FN組CD34+祖細胞數(shù)量較少且分布不均勻，見圖4。

2.2 血管ECM膠對CD34+祖細胞分化的影響 與FN組相比，ECM組CD34+祖細胞CD31、eNOS及VWF mRNA表達量均增加（P＜0.05），見圖5、表1。與FN組相比，ECM組表達CD31、CD144及VEGFR2的陽性細胞率升高，而表達CD133和CD45的陽性細胞率下降，見圖6。FN組吞噬Dil-acLDL的細胞數(shù)量［（5.0±1.2）個/視野］較ECM組［（27.0±3.5）個/視野］減少（n=3，t=20.370，P＜0.05），見圖7。

2.3 2組CD34+祖細胞分泌促血管生成因子能力比較 蛋白芯片結果顯示，ECM組細胞分泌血管生成素（Angiogenin）、成纖維細胞生長因子7（FGF-7）、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）、瘦素（Leptin）及血小板源性生長因子BB（PDGF-BB）較FN組增多（P＜0.05），見表2。

3 討論

正常血管的內皮細胞阻止血液與內膜下基質直接接觸，可防止形成血栓；同時內皮細胞還分泌一些抑制平滑肌細胞增殖的因子，如一氧化氮（NO）、前列環(huán)素等，從而抑制內膜增生［9］。臨床上使用的心血管植入材料由于沒有內皮細胞層覆蓋，常引起血栓形成及內膜增生等并發(fā)癥，如藥物洗脫支架雖然可通過釋放藥物來抑制血管平滑肌細胞增生，但同時也抑制了內皮細胞增殖，使支架表面內皮化延遲，導致血管內晚期血栓形成［10-11］。因此，在心血管植入材料與血液相接觸的表層上建立內皮細胞層是防止血栓形成最有效的方式［12］。

一種促進植入材料表面內皮化的新方法是將特定的抗體或多肽固定在材料表面，以捕獲血液中的干/祖細胞。為促進干/祖細胞的增殖及分化，植入材料表面常覆蓋涂層，內含血管內皮生長因子等生物活性分子。研究發(fā)現(xiàn)含有血管內皮生長因子的涂層有抑制血管內膜增生的效果［13］，但涂層中血管內皮生長因子的釋放可能產生不良反應，如導致腫瘤發(fā)生［5］。將ECM的一種成分，如透明質酸或基質膠（主要成分為膠原蛋白）作為涂層覆蓋于心血管植入材料表面，可促進材料原位內皮化［14-15］。然而單一ECM成分促進材料內皮化的作用有限，不如多種ECM成分效果明顯［14］。心血管植入材料表面涂層應盡可能地與血管內皮細胞的ECM相似，才能提供最適宜的微環(huán)境以促進材料內皮化。基于此，筆者提取了血管ECM，盡可能保留其基質成分并制備ECM膠，以觀察其對內皮祖細胞的誘導分化作用。結果發(fā)現(xiàn)，與在FN上培養(yǎng)相比，在血管ECM膠上培養(yǎng)的CD34+祖細胞標志物CD133表達降低，同時其內皮細胞標志物CD31、CD144、VEGFR2和內皮細胞基因CD31、VWF mRNA表達增加；此外，CD34+祖細胞eNOS mRNA也表達增加，而eNOS具有合成NO的作用，為成熟內皮細胞所表達；CD34+祖細胞還表現(xiàn)出較強的吞噬DiI-acLDL的能力，這是成熟內皮細胞的功能之一。這些結果表明在未加入任何生長因子或細胞因子的情況下，ECM膠促進了CD34+祖細胞分化為內皮細胞。這一功能使之適合作為涂層覆蓋于心血管植入材料表面，并促進從血液中捕獲的祖細胞（植入材料表面需包埋相應的抗體）向內皮細胞分化，從而導致植入材料的原位內皮化。

本研究檢測CD34+祖細胞的旁分泌，發(fā)現(xiàn)與FN組相比，ECM組細胞分泌的Angiogenin、FGF-7、GM-CSF、Leptin及PDGF-BB明顯增加。這可能是由于血管ECM是天然的細胞因子載體，可保護其不被降解或失活［16］，從而使細胞上清液中這些促血管生成因子表達增加。Angiogenin、GM-CSF和Leptin均具有促進干/祖細胞向內皮方向分化的作用，如Angiogenin可促進循環(huán)血中的血管生成細胞分化為內皮細胞［17］，GM-CSF可促進外周血來源的內皮祖細胞在纖維蛋白支架上分化為具有成熟表型的內皮細胞［18］，Leptin可刺激人脂肪源性干細胞分化為血管內皮細胞，且這些因子間可通過協(xié)同的方式共同促進干細胞分化［19］。這些結果表明血管ECM膠具有促進干/祖細胞分化為內皮細胞的作用，提示其作為心血管植入材料涂層的優(yōu)越性及植入材料原位內皮化的可行性。

綜上，血管ECM膠升高了CD34+祖細胞分泌的促血管生成因子水平，并促進其分化為內皮細胞，可能為心血管植入物原位內皮化提供一種新策略。

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（2022-07-19收稿 2022-09-28修回）

（本文編輯 李志蕓）