基于UHPLC-MS技術(shù)分析貴州紅、白酸湯代謝物差異

唐佳代，趙益梅，謝 藝，冉光耀，張芮瑞*

（1.茅臺學院 釀酒工程系，貴州 遵義 564500；2.貴州茅臺酒股份有限公司，貴州 遵義 564500）

貴州酸湯是貴州省特色的一種傳統(tǒng)自然發(fā)酵調(diào)味品，根據(jù)原料不同主要分為紅酸湯和白酸湯[1]。紅酸湯（red sour soup，RSS）是以西紅柿、紅辣椒、食用鹽及白酒為主要原料經(jīng)發(fā)酵而成，具有獨特的酸辣風味[2]。白酸湯（white sour soup，WSS）又稱為米酸湯，是以大米、水和食用鹽為主要原料經(jīng)發(fā)酵而成[3]。貴州凱里生產(chǎn)的酸湯被授權(quán)為中國地理標志保護產(chǎn)品，被認為是一種具有促進消化、調(diào)節(jié)腸道菌群、清除自由基和增強免疫功能的功能性食品[4-6]，故頗受消費者喜愛。分析紅酸湯、白酸湯代謝物差異，有助于解析酸湯獨特風味的形成機理，實現(xiàn)產(chǎn)品質(zhì)量控制，需要分析凱里紅酸湯和白酸湯的代謝物信息。代謝組學技術(shù)已廣泛應(yīng)用于發(fā)酵食品風味物質(zhì)的檢測分析研究，如酸湯風味物質(zhì)、發(fā)酵紅茶滋味物質(zhì)和黃酒中的代謝物等[7-9]。目前，常見用于酸湯中代謝物的檢測技術(shù)主要包括高效液相色譜-質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-mass spectrometer，HPLC-MS）聯(lián)用技術(shù)[10]、氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）聯(lián)用技術(shù)[11-12]和近紅外光譜技術(shù)[13]等。現(xiàn)有研究報道多分析單一酸湯中代謝物，且多聚焦于靶向檢測有機酸、氨基酸等物質(zhì)[14-15]，缺乏研究紅、白酸湯中差異代謝物的研究。借助色譜和質(zhì)譜等儀器對樣本中相對分子質(zhì)量＜1 000的小分子代謝物進行定性定量分析，并準確分析出樣本間的差異代謝物，有助于挖掘解析酸湯樣本中代謝物的重要信息[16-17]。

本研究以貴州凱里紅、白酸湯為研究對象，通過超高效液相色譜-質(zhì)譜（ultra high performance liquid chromatography-mass spectrometer，UHPLC-MS）非靶向代謝組學方法分析紅酸湯、白酸湯中代謝物組成，并利用主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘-判別分析（orthogonalpartial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）篩選差異顯著代謝物，探究紅酸湯、白酸湯代謝物的差異，旨在為酸湯營養(yǎng)成分、風味化合物研究奠定理論基礎(chǔ)，助力貴州酸湯產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅酸湯（RSS）、白酸湯（WSS）：貴州省凱里市某知名酸湯企業(yè)。

甲醇、乙腈（均為色譜純）：美國Merck公司；L-2-氯苯丙氨酸（色譜純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲酸（色譜純）：印度HCL公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UPLCAcquity I-Class PLUS超高效液相色譜儀、Waters UPLC Xevo G2-XS QTOF高分辨質(zhì)譜（配有電噴霧離子（electric spray ion，ESI）源）：美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

取100 μL酸湯樣本，加入500 μL含內(nèi)標的提取液（甲醇∶乙腈=1∶1（V/V），內(nèi)標質(zhì)量濃度20 mg/L），渦旋30 s，置于冰水浴中超聲10 min。在-20 ℃條件下靜置1 h后，樣本在4 ℃條件下12 000 r/min離心15 min，取500 μL上清液真空濃縮干燥。干燥后的代謝物加入160 μL乙腈水提取液（乙腈∶水=1∶1（V/V））復(fù)溶，渦旋30 s后置于冰水浴中超聲10 min。將樣本在4 ℃條件下12 000 r/min離心15 min；取120 μL上清檢測，另每個樣本各取10 μL混合成質(zhì)量控制樣本（QC）檢測。

1.3.2 代謝物的檢測分析

紅酸湯、白酸湯樣品代謝物采用UHPLC-MS進行分析。

超高液相色譜條件：采用Waters Acquity UPLC HSS T3色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），流動相A為0.1%甲酸-水溶液，流動相B為含0.1%甲酸-乙腈溶液，進樣體積為1 μL，流速400 μL/min。梯度洗脫程序為0～0.25 min，2%流動相B；10～13 min，98%流動相B；13.1 min，2%流動相B。

質(zhì)譜條件：ESI源參數(shù)為正離子模式毛細管電壓2 500 V，負離子模式毛細管電壓-2 000 V，錐孔電壓30 V；離子源溫度100 ℃，脫溶劑氣溫度500 ℃；反吹氣流速50 L/h，脫溶劑氣流速800 L/h；質(zhì)核比采集范圍為50～1 200 m/z。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

使用Progenesis QI軟件進行峰提取、峰對齊，采用京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫（https：//www.genome.jp/kegg/path way.html）對代謝物進行注釋。對數(shù)據(jù)進行主成分分析和正交偏最小二乘-判別分析。根據(jù)t檢驗計算統(tǒng)計學意義的P值和樣本分組的變量投影重要性（value importance in projection，VIP）值，并結(jié)合單變量差異倍數(shù)（Fold-Change，F(xiàn)C）篩選樣本組間顯著差異代謝物。

2 結(jié)果與分析

2.1 貴州紅酸湯、白酸湯樣本的主成分分析

在貴州紅、白酸湯樣本中共注釋到2 929個代謝物，為反映貴州紅、白酸湯樣本間的總體代謝差異和組內(nèi)樣本之間的變異度大小，分別在正、負離子模式下對代謝物進行主成分分析。PCA得分圖中的散點表示一個QC樣本點，樣本點間距越小表示其代謝物組成和含量相似度越高，間距越大表示其代謝物組成和含量差異越大[18]。酸湯正離子模式（A）和負離子模式（B）下主成分分析（PCA）得分圖見圖1。

由圖1可知，在正、負離子模式下紅酸湯、白酸湯樣本的第一主成分和第二主成分的累計方差貢獻率分別為94.26%和94.69%，包含了試驗樣本中絕大部分物質(zhì)信息。紅酸湯（RSS）和白酸湯（WSS）樣本點在第一主成分間距離較遠，說明紅、白酸湯樣本中代謝物組成差異較大。

2.2 貴州紅酸湯、白酸湯代謝物的正交偏最小二乘-判別分析

為解析樣本中與分類變量相關(guān)的差異變量和互相之間可能存在關(guān)聯(lián)的無差異變量，借助OPLS-DA模型剔除與分類變量不相關(guān)的變量，進而實現(xiàn)樣本組間差異信息的可視化。OPLS-DA適用于比較樣本組間差異，找出造成組間差異的代謝物。OPLS-DA模型得分圖中橫坐標代表組間差異分量，樣本點橫向距離與組間差異呈正相關(guān)，距離越小代表樣本組間代謝物組成差異越小。縱坐標代表組內(nèi)差異分量，樣本點間縱向距離遠近代表組內(nèi)差異，距離越小代表樣本組內(nèi)代謝物組成差異越小。括號中的百分比代表該分量在總方差中的占比[19]。R2Y和Q2Y指標是評價模型預(yù)測有效性的參數(shù)，判別模型能否通過代謝表達量區(qū)分正確的樣本分組。R2Y和Q2Y的值越接近于1，表示該模型越穩(wěn)定可靠[20]。酸湯樣品在正離子模式（A）和負離子模式（B）下的OPLS-DA模型得分圖見圖2。

圖2 酸湯樣品在正離子模式（A）和負離子模式（B）下的正交偏最小二乘-判別分析模型得分圖Fig.2 Orthogonal partial least squares-discriminant analysis model score plots of sour soup samples in positive ion model (A)and in negative ion model (B)

圖3 酸湯樣品在正離子模式（A）和負離子模式（B）下差異代謝物火山圖Fig.3 Volcano plots of sour soup samples in positive ion model (A)and negative ion model (B)

由圖2可知，R2Y和Q2Y值均為1，代表所建立的OPLSDA模型可靠，該模型可用于篩選酸湯樣本中的差異代謝物。酸湯樣本間橫向距離較大且均處于95%置信區(qū)間，表明紅、白酸湯樣本組間的代謝物具有顯著差異（P＜0.05）。

2.3 貴州紅酸湯、白酸湯代謝物的火山圖分析

火山圖直觀展示了代謝物在紅、白酸湯樣本組中含量差異的總體趨勢以及代謝物差異的統(tǒng)計學顯著性?；鹕綀D中每個點代表一個代謝物，散點大小代表OPLS-DA模型的VIP值，散點越大，VIP值越大，篩選得到的差異表達代謝物越可靠。采用VIP＞1和P值＜0.05為篩選條件。正離子模式下，紅酸湯和白酸湯樣本差異顯著代謝物數(shù)為1 223種，上調(diào)的差異顯著代謝物數(shù)為340種，下調(diào)的差異顯著代謝物數(shù)為883種；負離子模式下，紅酸湯和白酸湯樣本差異顯著代謝物數(shù)為1 173種，上調(diào)的差異顯著代謝物數(shù)有272種，下調(diào)的差異顯著代謝物數(shù)有901種。

2.4 貴州紅酸湯、白酸湯差異顯著代謝物篩選、分類

基于OPLS-DA結(jié)果，從獲得的多變量分析OPLS-DA模型的VIP值初步篩選出貴州紅、白酸湯差異代謝物。篩選出代謝物中VIP＞1且P值＜0.05的作為差異顯著代謝物。差異顯著代謝物與人類代謝組數(shù)據(jù)庫（Human Metabolome Database，HMDB）進行匹配的結(jié)果，從Super Class分類上看，脂類和類脂類化合物占14.96%，有機酸及其衍生物占8.5%，有機雜環(huán)化合物占6.87%，苯環(huán)類化合物占4.17%，有機氧化合物占3.52%，苯基丙酸類和聚酮類化合物占2.7%，核苷、核苷酸和類似物占1.72%，機氮化合物占1.23%，生物堿和衍生物占0.65%。差異顯著代謝物中脂類和類脂類化合物種類最多，共計183種，其中上調(diào)脂類和類脂類化合物43種，下調(diào)脂類和類脂類化合物140種。

表1 紅、白酸湯差異顯著代謝物的占比及種類Table 1 Proportion and types of metabolites with significant difference of red and white sour soup

2.5 貴州紅酸湯、白酸湯差異顯著代謝物代謝通路分析

KEGG數(shù)據(jù)庫有助于將代謝物含量信息作為一個整體網(wǎng)絡(luò)進行研究。KEGG COMPOUND數(shù)據(jù)庫是KEGG數(shù)據(jù)庫收錄的與生物系統(tǒng)相關(guān)的小分子、生物聚合物和其他化學物質(zhì)的集合，并提供這些物質(zhì)在KEGG pathway數(shù)據(jù)庫中的注釋。為得到差異顯著代謝物所參與的通路[21]，在KEGG數(shù)據(jù)庫中匹配紅酸湯、白酸湯樣本中的差異顯著代謝物，結(jié)果見圖4。

圖4 紅、白酸湯差異顯著代謝物在正離子模式（A）和負離子模式（B）下富集代謝通路Fig.4 Enriched metabolic pathway of metabolites with significant difference of red and white sour soup under the positive ion model (A) and negative ion model (B)

正離子模式下，紅酸湯與白酸湯樣品中顯著差異代謝物富集到的主要的代謝通路為莽草酸途徑生物堿的生物合成（biosynthesisofalkaloidsderivedfromshikimate pathway）、血清素能突觸通路（serotonergic synapse）、血清素能突觸類固醇激素生物合成（steroid hormone biosynthesis）、酪氨酸代謝（tyrosine metabolism）、苯甲酸降解途徑（benzoate degradation）等。負離子模式下，顯著差異代謝物富集的主要代謝通路為組氨酸和嘌呤的生物堿生物合成（biosynthesis of alkaloids derived from histidine and purine）、苯丙氨酸代謝（phenylalanine metabolism）、異喹啉生物堿生物合成（isoquinoline alkaloid biosynthesis）和類黃酮生物合成（flavonoid biosynthesis）等。

正離子模式下，莽草酸途徑生物堿的生物合成途徑中主要的差異代謝物為無鹽掌胺、山油柑堿，血清素能突觸通路中主要差異代謝物為5（S）-羥基二十碳四烯酸、11,12-二去氫視黃醇，血清素能突觸類固醇激素生物合成途徑中主要的差異代謝物為2-甲氧基雌酮-3-硫酸鹽、22（R）-羥基膽固醇，酪氨酸代謝途徑中的主要差異代謝物為N-甲基酪胺、3,4-二羥基扁桃酸鹽和L-多巴胺，苯甲酸降解途徑主要差異代謝物為2-氨基苯磺酸鹽、環(huán)己基-1-羧酸酯。負離子模式下，組氨酸和嘌呤的生物堿生物合成途徑中主要的差異代謝物為異戊酸，苯丙氨酸代謝途徑中主要的差異代謝物為N-乙酰-L-苯丙氨酸、間香豆素酸，異喹啉生物堿生物合成途徑中主要的差異代謝物為（S）-全去甲勞單丹堿、二氫血根堿和金黃紫堇堿，類黃酮生物合成途徑中主要差異代謝物為毛地黃黃酮、綠原酸和兒茶素。

在KEGG數(shù)據(jù)庫中匹配紅、白酸湯中的差異顯著代謝物主要為生物堿、酚類和黃酮類。生物堿類：山油柑堿是吡喃并吖啶酮類生物堿，常存在于包瑞山油柑、山油柑和降真香等植物中，是紅、白酸湯樣品中下調(diào)的差異顯著代謝物，來源于莽草酸途徑生物堿的生物合成[22]。N-甲基酪胺是由酪氨酸經(jīng)酪氨酸脫羧酶的催化可轉(zhuǎn)成酪胺，進一步代謝生成的一種生物堿[23-24]。在金黃紫堇堿的合成來源于酪氨酸代謝，存在于番茄等植物生源合成途徑中[25]。酚類和黃酮類：毛地黃黃酮、綠原酸和兒茶素為紅、白酸湯樣品中差異顯著代謝物，主要原因是紅酸湯以番茄為發(fā)酵原料，毛地黃黃酮是茄果實中重要的黃酮類化合物[26]。番茄果實中綠原酸和兒茶素是主要的的酚類化合物，具有顯著的抗氧化作用[27]。研究表明，隨著發(fā)酵的進行，紅酸湯中的綠原酸含量逐漸上升，是紅酸湯中的重要的有機酸之一[28]。

3 結(jié)論

本研究基于非靶向代謝組學結(jié)合多元分析手段分析貴州紅、白酸湯共注釋到2 929個代謝物，以VIP＞1且P值＜0.05為篩選差異顯著代謝物，正離子模式下，紅、白酸湯差異顯著代謝物為1 223種，上調(diào)的差異顯著代謝物有340種，下調(diào)的差異顯著代謝物有883種；負離子模式下，樣本差異顯著代謝物為1 173種，上調(diào)的差異顯著代謝物有272種，下調(diào)的差異顯著代謝物有901種。HMDB數(shù)據(jù)庫匹配結(jié)果顯示，差異顯著代謝物主要包括脂類和類脂類化合物、有機酸及其衍生物、有機雜環(huán)化合物、苯環(huán)類化合物、有機氧化合物、苯基丙酸類和聚酮類化合物。KEGG分析表明，差異代謝物主要富集在正離子模式下的莽草酸途徑生物堿的生物合成、血清素能突觸通路等及負離子模式下的組氨酸和嘌呤的生物堿生物合成。紅、白酸湯樣品中顯著差異代謝物主要為生物堿、酚類和黃酮類物質(zhì)。通過對紅、白酸湯的代謝產(chǎn)物分析，初步探究差異代謝產(chǎn)物及其代謝途徑，為貴州不同品類酸湯的風味和營養(yǎng)成分進一步研究提供理論基礎(chǔ)。