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    釀酒酵母響應(yīng)辛酸脅迫的研究進(jìn)展

    2023-11-06 09:05:16于志海石明芝董文軒張美星袁葉鑫黃名正劉曉柱許存賓唐維媛
    中國(guó)釀造 2023年10期
    關(guān)鍵詞:中鏈辛酸?;?/a>

    于志海,石明芝,董文軒,張美星,袁葉鑫,黃名正,劉曉柱,許存賓,唐維媛

    (貴州理工學(xué)院 食品藥品制造工程學(xué)院,貴州 貴陽(yáng) 550003)

    釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是應(yīng)用于乙醇生產(chǎn)行業(yè)的一類主要微生物,酒精發(fā)酵過(guò)程中釀酒酵母受到各種環(huán)境因子的脅迫,如乙醇[1-2]、高滲透壓[3]、呋喃醛[4]、酚類化合物[5]、硫化物[6]和高酸[7]等。其中,在酒精發(fā)酵過(guò)程中因弱有機(jī)酸而帶來(lái)的弱酸(低pH)脅迫是的常見脅迫之一[8]。近年來(lái),釀酒酵母的弱酸脅迫響應(yīng)機(jī)制研究逐漸獲得了科研工作者的關(guān)注,目前,關(guān)注的弱有機(jī)酸主要有甲酸[9-10]、乙酸[11]、檸檬酸[12]、綠原酸[13]、乳酸[14]、油酸[15]。實(shí)際上,酒精發(fā)酵過(guò)程中釀酒酵母應(yīng)對(duì)的環(huán)境遠(yuǎn)比已報(bào)道的情況復(fù)雜,因此,如何優(yōu)化發(fā)酵環(huán)境、提高酵母的生產(chǎn)力、厘清釀酒酵母對(duì)弱有機(jī)酸脅迫的響應(yīng)機(jī)制是目前面臨的重大科學(xué)問題。辛酸作為一種弱有機(jī)酸,高濃度的辛酸對(duì)釀酒酵母具有毒性,脅迫酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)[16-17]。釀酒酵母肯定有一套響應(yīng)辛酸脅迫的應(yīng)答機(jī)制,但目前學(xué)術(shù)界對(duì)該機(jī)制的解析欠深入,未獲得統(tǒng)一認(rèn)識(shí)?;诖耍瑥木凭l(fā)酵的視角,系統(tǒng)梳理了近40年來(lái)有關(guān)辛酸對(duì)釀酒酵母生長(zhǎng)影響的文獻(xiàn),就辛酸對(duì)釀酒酵母的影響、酒精發(fā)酵過(guò)程中辛酸的來(lái)源和釀酒酵母應(yīng)對(duì)辛酸脅迫的部分應(yīng)答機(jī)制進(jìn)行了綜述,以期為全面解析釀酒酵母對(duì)辛酸脅迫的應(yīng)答機(jī)制以及開發(fā)辛酸高耐受菌株提供參考。

    1 辛酸對(duì)釀酒酵母的影響

    辛酸[CH3(CH2)6COOH]是一種脂溶性中鏈飽和脂肪酸,可以有效治療與真菌滋生有關(guān)的疾病,如陰道酵母菌感染、念珠菌感染[18]和鵝口瘡[19]等,說(shuō)明辛酸對(duì)真菌具有明顯的抑制效應(yīng)。酒精發(fā)酵過(guò)程中,辛酸是公認(rèn)的發(fā)酵抑制劑,在果汁發(fā)酵過(guò)程中隨著乙醇濃度的升高和pH值的降低,對(duì)釀酒酵母的毒性也逐漸增強(qiáng)[16],這可能與辛酸在水中的微溶解性有關(guān)。隨著發(fā)酵的進(jìn)行,乙醇的產(chǎn)量逐漸增多,辛酸在發(fā)酵液中的溶解度逐漸升高,提高了辛酸對(duì)酵母的毒性。有研究表明,辛酸能提高乙醇對(duì)酵母的致死效果,并且致死率與辛酸的濃度呈指數(shù)關(guān)系[20],高濃度的辛酸對(duì)釀酒酵母的生長(zhǎng)產(chǎn)生脅迫,導(dǎo)致發(fā)酵停滯[21]。

    2 酒精發(fā)酵過(guò)程中辛酸的來(lái)源

    為了探明酒精發(fā)酵過(guò)程中釀酒酵母響應(yīng)辛酸脅迫的機(jī)制,首先需明確該過(guò)程中辛酸的來(lái)源,有研究表明,酒精發(fā)酵過(guò)程中的辛酸主要來(lái)源于原材料和釀酒酵母的代謝。

    2.1 來(lái)源于原材料的辛酸

    谷物類、水果類等糖質(zhì)原料均可作為酒精發(fā)酵的原材料。過(guò)去已從肉豆蔻(Myristica fragrans)、檸檬草(Cymbopogoncitratus)、蘋果(Malusdomestica)、椰子(Cocosnucifera)、棕櫚(Trachycarpus fortunei)、啤酒花(Humulus lupulus)等多種原材料中檢測(cè)出了辛酸,其中棕櫚仁油和椰子油是天然辛酸的主要來(lái)源[22]。近年來(lái),HUANG M Z等[23]利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)法測(cè)定了貴州省5個(gè)產(chǎn)地成熟刺梨的揮發(fā)性風(fēng)味成分時(shí),發(fā)現(xiàn)盤州地區(qū)的辛酸含量最高(約1.3 mg/L),貴定地區(qū)的辛酸含量最低(約0.04 mg/L),大方、龍里和水城地區(qū)的辛酸含量均約為0.1 mg/L。杜薇等[24]在測(cè)定5種野生蘋果(花紅、新疆野蘋果、西府海棠、海棠花和楸子)的揮發(fā)性風(fēng)味成分時(shí),發(fā)現(xiàn)辛酸含量為95.99(新疆野蘋果)~346.59 μg/kg(楸子)。付勛等[25]從玫瑰香橙(Citrus sinensis)果汁中檢測(cè)出的辛酸含量約占總揮發(fā)性物質(zhì)的4.04%。張琦婧[26]研究發(fā)現(xiàn),諾麗(Morinda citrifolia)果汁中含有大量辛酸,并且是其“腐臭干酪”類氣味的主要來(lái)源。

    酒精發(fā)酵結(jié)束后,辛酸與醇類物質(zhì)形成相應(yīng)的酯類物質(zhì),辛酸乙酯和辛酸異戊酯是酒類產(chǎn)品中常見的辛酸酯類物質(zhì),已在濃香型白酒[27]、枳椇高粱混釀酒[28]、葛根蒸餾酒[29]、小曲清香型白酒[30]、凱里糯米酒[31]、黑糯米酒[32]等酒類產(chǎn)品中檢測(cè)到辛酸乙酯。有趣的是,部分水果的果汁中未檢出辛酸和辛酸乙酯,但在相應(yīng)的水果酒中卻檢出了辛酸乙酯。李凱等[33]在火龍果汁中未檢出辛酸和辛酸乙酯,但在火龍果發(fā)酵酒中卻檢出了辛酸乙酯。胡來(lái)麗等[34]在百香果汁中僅檢測(cè)到295.34 μg/L的辛酸乙酯,在百香果發(fā)酵酒中也檢測(cè)到了465.95 μg/L的辛酸乙酯。結(jié)果表明,無(wú)論在原材料中是否檢測(cè)到辛酸,酒精發(fā)酵過(guò)程中原材料并不是辛酸的唯一來(lái)源。

    2.2 來(lái)源于釀酒酵母代謝的辛酸

    研究表明,釀酒酵母的自身代謝可以產(chǎn)生辛酸,進(jìn)而形成辛酸乙酯[35]。釀酒酵母中脂肪酸(辛酸是其中之一)的合成主要是在細(xì)胞質(zhì)中的脂肪酸合酶(fatty acid synthase,F(xiàn)AS)I系統(tǒng)中完成,該系統(tǒng)是具有多酶活性的多結(jié)構(gòu)域復(fù)合體[36]。釀酒酵母中脂肪酸的具體合成途徑如圖1所示[37-39]。來(lái)源于糖酵解途徑(glycolysis)的乙酰輔酶A(coenzyme A,CoA)是脂肪酸合成的初始單位,丙二酰CoA是二碳供應(yīng)單位。乙酰CoA羧化酶(acetyl-CoA carboxylase)催化乙酰CoA合成丙二酰CoA,然后在?;D(zhuǎn)移酶(acyltransferase)作用下,乙酰CoA和丙二酰CoA分別將酰基部分轉(zhuǎn)移到?;d體蛋白(acyl carrier protein,ACP),隨后,二者在酮基合成酶(ketosynthase)的催化下脫羧縮合,形成?;d體蛋白結(jié)合的β-酮?;虚g體??s合后,β-酮?;虚g體通過(guò)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)依賴型酮基還原酶(ketoreductase)、脫水酶(dehydratase)以及另一種NADPH依賴型烯?;€原酶(enoylreductase)的依次處理,得到完全飽和的?;虚g體。最終特定鏈長(zhǎng)的脂肪酸主要通過(guò)底物特異性硫酯酶(thioesterase)來(lái)水解相應(yīng)鏈長(zhǎng)的酯酰ACP得到,即短、中、長(zhǎng)鏈脂肪酸。

    圖1 釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的合成途徑Fig.1 Synthesis pathway of fatty acids in Saccharomyces cerevisiae

    辛酸及其相應(yīng)的中鏈脂肪酸在生物燃料[40]、功能性食品[41]、醫(yī)藥行業(yè)和飼料[42]等行業(yè)具有廣泛應(yīng)用,促使通過(guò)改造釀酒酵母的辛酸/中鏈脂肪酸的合成途徑[43]達(dá)到高產(chǎn)目的成為釀酒酵母的研究熱點(diǎn)。乙酰CoA羧化酶催化乙酰CoA合成丙二酰CoA是脂肪酸合成途徑的限速步驟。當(dāng)前針對(duì)釀酒酵母高產(chǎn)辛酸/中鏈脂肪酸的基因改造主要集中在該限速步驟和FAS I系統(tǒng)[43]。研究顯示,酵母中同時(shí)表達(dá)人類的hFAS△TE基因、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的PPT基因和兔的TE II基因,可提高短鏈脂肪酸產(chǎn)量達(dá)64倍,其中辛酸產(chǎn)量達(dá)到82 mg/L,己酸和癸酸的總量達(dá)到111 mg/L[44]。酵母菌FAS的丙二酰棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶(malonyl palmitoyl transferase,MPT)結(jié)構(gòu)域上的精氨酸和賴氨酸交換位置('R1834K')即形成酵母突變體FAS。在該突變體中,當(dāng)丙二酰CoA減少時(shí),短?;湥ㄈ绨缩;鵆oA)先釋放出來(lái),然后通過(guò)硫酯酶水解八酰基CoA,即可釋放游離的辛酸[45-46]。通過(guò)該基因工程途徑,在面包酵母中辛酸產(chǎn)量可高達(dá)245 mg/L[46]。無(wú)論是野生菌株或是工程菌株,釀酒酵母均可發(fā)酵產(chǎn)辛酸/中鏈脂肪酸,不同菌株的產(chǎn)量有極大差異。有學(xué)者認(rèn)為,通過(guò)改造脂肪酸的合成途徑提高短中鏈脂肪酸及其衍生物的產(chǎn)量是將來(lái)研究的方向[43]。實(shí)際上,按照該邏輯,由于中鏈脂肪酸(辛酸)對(duì)釀酒酵母具有毒性,因此隨著中鏈脂肪酸產(chǎn)量的增加,如何提高釀酒酵母對(duì)中鏈脂肪酸(辛酸)的耐受性是另一個(gè)非常重要的科學(xué)問題。

    3 釀酒酵母對(duì)辛酸脅迫的應(yīng)答機(jī)制

    3.1 增加細(xì)胞膜的通透性

    LIU P等[47]在研究己酸、辛酸和癸酸對(duì)釀酒酵母生長(zhǎng)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn),當(dāng)辛酸濃度>1 mmol/L時(shí),釀酒酵母的生長(zhǎng)完全受到抑制,而且毒性隨著脂肪酸鏈的增加和培養(yǎng)基pH值的下降而提高,芯片數(shù)據(jù)顯示,辛酸的攻擊可能降低了釀酒酵母細(xì)胞膜的完整性,這種完整性的降低雖然對(duì)細(xì)胞膜的流動(dòng)性沒有影響,但是直接使得細(xì)胞膜的通透性增加。眾所周知,細(xì)胞膜是具有高度選擇性的,倘若細(xì)胞膜的通透性增加,意味著更多的物質(zhì)能夠進(jìn)出細(xì)胞,可能給細(xì)胞帶來(lái)更大的傷害,因此,辛酸使細(xì)胞的通透性增加更確切的說(shuō)是一種損傷而非應(yīng)答解決問題的機(jī)制。同時(shí),也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),向培養(yǎng)基中添加油酸能提高酵母細(xì)胞對(duì)辛酸的耐受性,可以降低細(xì)胞膜的通透性[47]。BESADA-LOMBANA P B等[48]將釀酒酵母乙酰CoA羧化酶1157位的絲氨酸替換為丙氨酸后阻止了該位點(diǎn)的磷酸化,將該基因在菌株BY4741中表達(dá)后,菌株的油酸產(chǎn)量提高了3.1倍(無(wú)辛酸脅迫)或1.6倍(有辛酸脅迫),在0.9 mmol/L的辛酸下脅迫24 h,該菌株的密度比原始菌株要高10倍多,這為避免添加外源油酸來(lái)降低細(xì)胞膜的通透性提供了新思路。

    實(shí)際上,在利用釀酒酵母生產(chǎn)生物燃料的過(guò)程中,添加油酸來(lái)緩解膜的通透性是不夠的,因此,近年來(lái)多位學(xué)者嘗試從基因工程的角度來(lái)改造釀酒酵母,使其具備高濃度的中鏈脂肪酸的耐受性。LIU H等[49]在釀酒酵母中共表達(dá)了Lem3和Sfk1基因(二者均是膜不對(duì)稱調(diào)節(jié)因子),從而重塑了膜磷脂的分布,使得腦磷脂在質(zhì)膜內(nèi)葉中的積累量增加,進(jìn)而使得膜電位和完整性分別提高了131.5%和29.2%,在應(yīng)對(duì)己酸、辛酸和癸酸的脅迫下,OD600nm值分別提高了79.6%、73.4%和57.7%。另外,釀酒酵母生成的中鏈脂肪酸能否全部排放至發(fā)酵液中與細(xì)胞壁的厚度與滲漏性有關(guān)。WANG J J等[50]在拉格酵母中利用自克隆技術(shù)破壞掉β-1,3-葡聚糖合成酶的催化亞基(fks1)后,增加了細(xì)胞壁的厚度,使得辛酸和癸酸滲出量分別減少了39.9%和63.41%,因此,通過(guò)改變酵母細(xì)胞壁的厚度可控制胞內(nèi)中鏈脂肪酸的滲出量。

    3.2 升高H+-ATP酶的活性

    研究表明,在含4~50 mg/L辛酸的條件下培養(yǎng)的釀酒酵母IGC 3507III的質(zhì)膜腺苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)酶活性是無(wú)辛酸加入的1.5倍,當(dāng)從培養(yǎng)基中去除辛酸后,這種情況迅速逆轉(zhuǎn)[51]。H+-ATP酶活性的升高與其編碼基因PMA1相關(guān),低濃度辛酸對(duì)H+-ATP酶具有激活作用,同時(shí)可以觀察到PMA1的表達(dá)量也得到了提高[52]。這種酶活性的提高往往在指數(shù)生長(zhǎng)早期達(dá)到最大值,H+-ATP酶活性激活直接與pH下降有關(guān),并且能觀察到因pH值的下降而使細(xì)胞的活力受到損害[53]。在辛酸亞致死濃度下對(duì)釀酒酵母進(jìn)行馴化或者是將釀酒酵母細(xì)胞短暫的(1 h)置于輕度辛酸脅迫條件下,可以使釀酒酵母獲得對(duì)辛酸致死濃度的抗性,這種適應(yīng)性可能來(lái)自于質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白受到誘導(dǎo)后介導(dǎo)鋅酸鹽主動(dòng)流出細(xì)胞所致,另外將釀酒酵母細(xì)胞短暫置于輕度乙醇脅迫下也可提高釀酒酵母對(duì)辛酸的抗性,但是這種交叉響應(yīng)獲得的抗性要低于上述水平,進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),無(wú)論是短暫的使用辛酸脅迫還是乙醇脅迫均能激活質(zhì)膜上的H+-ATP酶的活性[54]。

    學(xué)者們對(duì)釀酒酵母在辛酸脅迫下H+-ATP酶活性升高的機(jī)理進(jìn)行了總結(jié)歸納,認(rèn)為辛酸的質(zhì)子和陰離子在細(xì)胞質(zhì)釋放后,不能穿過(guò)細(xì)胞膜的疏水雙分子層而滯留在細(xì)胞內(nèi),使得細(xì)胞內(nèi)積累高濃度的質(zhì)子而酸化,為了抵抗胞內(nèi)酸化,酵母細(xì)胞會(huì)增加H+-ATP酶的活性,排出高濃度的質(zhì)子,導(dǎo)致大量能量喪失,由于胞質(zhì)的低pH值,排出的質(zhì)子會(huì)和陰離子重新結(jié)合,再次穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),從而形成循環(huán),導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的能量不斷被消耗,隨著時(shí)間的增加,細(xì)胞內(nèi)pH值(intracellular pH,pHi)不能維持在正常的生理pH水平[20,55]。因此H+-ATP酶活性的提高可能是釀酒酵母應(yīng)對(duì)辛酸脅迫的一種應(yīng)對(duì)機(jī)制,但是目前針對(duì)單一的辛酸對(duì)釀酒酵母的脅迫研究暫未見報(bào)道,需要進(jìn)一步研究。

    4 結(jié)論與展望

    釀酒酵母最適pH范圍為4.5~5.0,而酒類釀造過(guò)程中所控制的pH值為3.0~3.6,因此,必然產(chǎn)生低pH值(高酸)脅迫[11]。酒精發(fā)酵過(guò)程中,高濃度的辛酸抑制了釀酒酵母的生長(zhǎng)。釀酒酵母肯定具有一套完善的辛酸脅迫響應(yīng)機(jī)制,但是目前知之甚少,已有報(bào)道的增加細(xì)胞膜通透性以及升高H+-ATP酶活性的機(jī)制需要進(jìn)一步驗(yàn)證。辛酸作為生產(chǎn)生活中廣泛應(yīng)用的產(chǎn)品,僅從棕櫚油和椰子油中獲取既不環(huán)保也不利于可持續(xù)發(fā)展,基于代謝途徑改造從微生物中獲取的策略是獲取辛酸的可行路徑,然而由于辛酸的毒性,獲得辛酸高耐受性菌株對(duì)于高產(chǎn)辛酸的獲得就顯得尤為重要。以上均建立在釀酒酵母響應(yīng)辛酸脅迫機(jī)制完全解析的基礎(chǔ)之上,因此對(duì)該問題的闡釋對(duì)于解決酒精發(fā)酵中的遲滯、開發(fā)辛酸高耐受性工程菌株以及獲得具有特殊需求的高密度發(fā)酵菌株,推動(dòng)乙醇生產(chǎn)行業(yè)和清潔能源產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義,同時(shí)對(duì)于其他脂肪酸的研究也具有重要的參考價(jià)值。

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