菊苣種子中五種生物活性成分檢測分析

阿麗米熱·買買提，吾買爾江·牙合甫，陳李鑫，阿里米熱·阿不來提，王曉杰，2，阿卜杜薩塔爾·斯馬依

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院/新疆草食動物新藥研究與創(chuàng)制重點實驗室，烏魯木齊 830052；2.鄭州賽科藥業(yè)科技有限公司，鄭州 450000；3.哈密阿沙爾診所，新疆哈密 839000）

菊苣（Cichorium intybusL.）為菊科（Asteraceae）菊苣屬多年生溫帶藥用植物，在新疆阿勒泰、烏魯木齊、塔城、哈巴河、福海、伊寧、哈密等地區(qū)分布較廣［1］。菊苣全草（根、莖、葉、種子）入藥，其活性成分具有調(diào)節(jié)血脂、保肝、治療黃疸等功效，可明顯改善高嘌呤飲食引起的肥胖、高尿酸血癥疾病［2，3］。此外莖、葉是可食用的藥食兩用資源。在日常生活中，菊苣根、葉、子常用來泡水服用，市場有較多的菊苣茶相關(guān)產(chǎn)品。

菊苣全草植物含有酚酸類、萜類、糖類、黃酮類、苯丙素類、氨基酸、微量元素等多種化合物，已被廣泛研究、開發(fā)利用，具有較高的研究價值［4］。由于植物所生長的地理位置、環(huán)境、品種、種植方式等不同，植物所含的藥物活性成分、含量存在一定的差異。因此，本研究分析采自新疆哈密市菊苣種子中總多糖、總黃酮、總多酚、總皂苷、總生物堿的含量，為該地區(qū)菊苣種子生物活性物質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

菊苣種子由新疆哈密阿薩爾生物科技有限公司提供，經(jīng)哈密市伊州區(qū)花園鄉(xiāng)衛(wèi)生院卡哈爾·司馬義鑒定為菊苣種子。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品、蘆丁、沒食子酸、駱駝蓬堿、香草醛、硝酸鋁購自北京索萊寶科技有限公司；福林試劑購自北京酷來博科技有限公司；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、苯酚、硫酸購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；溴化鉀購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。鹽酸、碳酸氫鈉、高氯酸、冰醋酸、甲醇、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、氫氧化鈣購自阿拉丁生物試劑有限公司。

1.2.2 儀器 UV-5500 型紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；RE-52A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，南通經(jīng)典玻璃儀器有限公司；恒溫水浴鍋，金壇市醫(yī)療儀器廠；WD-9415E 型超聲波清洗器，北京六一生物科技有限公司；其他相關(guān)儀器、耗材由新疆草食動物新藥研究與創(chuàng)制重點實驗室提供。

1.3 方法

1.3.1 菊苣種子水提物的處理 菊苣種子清洗后陰涼24 h，烘干粉碎，30 目篩網(wǎng)過濾，精準(zhǔn)稱取菊苣種子粉末100 g，按照菊苣種子∶滅菌蒸餾水1∶15 的比例加入蒸餾水，70 ℃冷凝回流2 h，經(jīng)真空抽濾，液體備用（冷藏），殘渣以1∶10 料液比70 ℃冷凝回流1.5 h，真空抽濾，合并上述濾液，濃縮，取濃縮液置烘干箱（45 ℃）烘干，即可獲得菊苣種子粗提物，置于-20 ℃冰箱備用。

1.3.2 菊苣種子水提物的成分測定

1）總多糖的測定。采用苯酚-硫酸顯色法測定，精確稱取葡萄糖、菊苣標(biāo)準(zhǔn)品各25 mg，蒸餾水定容，最終獲得濃度為0.1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)液、測試液。依次吸取0.1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)液、測試液0（蒸餾水代替）、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 定容至2.0 mL，取5%苯酚、5 mL 濃硫酸依次加入定容瓶，混勻、冷卻，30 ℃水浴20 min。用紫外可見分光光度計于波長490 nm處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算總多糖含量［5］。

2）總生物堿的測定。采用鹽酸法測定，精確稱取駱駝蓬堿標(biāo)準(zhǔn)品10 mg 用蒸餾水定容，獲得濃度為0.1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)液；取10 mL 標(biāo)準(zhǔn)液用0.1 mol/L的HCl定容，獲得0.02 mg/mL 溶液；依次吸取1、2、3、4、5、6 mL 溶液至玻璃試管中，添加0.1 mol/L HCl 至試管中溶液總量為10 mL，振蕩混勻，分光光度計345 nm 處測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。精確稱取菊苣種子粗提物5 mg 用蒸餾水定容，同步以上方法測定總生物堿含量。

3）總 黃 酮 的 測 定。采 用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 顯色法測定，精確稱取蘆丁10 mg，用80%乙醇定容，獲得濃度為0.4 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)液；依次吸取0（蒸餾水代替）、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 標(biāo)準(zhǔn)液至試管中，分別加入5%NaNO2溶液0.3 mL 混勻后靜置6 min；加入10% Al（NO3）3溶液0.3 mL，混勻后靜置6 min；各管加入4% NaOH 溶液4 mL，蒸餾水定容至10 mL，靜置10 min；分光光度計510 nm 處測定吸光度，根據(jù)測得的OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。精確稱取菊苣種子粗提物10 mg，同步以上方法測定總黃酮含量。

4）總皂苷的測定。使用香草醛-高氯酸顯色法測定，精確稱取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，用甲醇定容，獲得濃度為0.8 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液；依次吸取0（蒸餾水代替）、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液至試管中，加入5%香草醛-冰乙酸0.2 mL，振蕩混勻后加入高氯酸0.6 mL，試管封口并置于65 ℃恒溫水浴鍋20 min；冷卻后吸入冰乙酸5 mL，振蕩搖勻，用蒸餾水定容至10 mL，搖勻。分光光度計550 nm 處測定吸光度，根據(jù)OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。精確稱取菊苣種子水提物20 mg，同步以上方法測定總皂苷含量。

5）總多酚的測定。使用Folin 顯色法測定，精確稱取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品10 mg 置于100 mL 容量瓶，蒸餾水定容；依次吸取0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mL 溶液置于10 mL 容量瓶，緩慢吸入Folin 試劑1 mL，混勻；吸入12% NaHCO3溶液2 mL 溶液，蒸餾水定容，振蕩混勻，錫箔紙避光放置1 h，分光光度計765 nm 處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。精確稱取菊苣種子水提物25 mg，置于容量瓶，同步以上方法測定總多酚含量。

1.3.3 可信度檢測 為保證結(jié)果的可信度，分別進(jìn)行精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和加標(biāo)回收率檢測試驗。

1）精密度檢測。分別配制標(biāo)準(zhǔn)液葡萄糖、駱駝蓬堿、蘆丁、齊墩果酸、沒食子酸1.25、1.00、1.00、1.20、1.50 mL，按照相對應(yīng)的顯色方法顯色，分別于490、345、510、550、765 nm 測定吸光度，每種標(biāo)準(zhǔn)液均測定6 次，計算標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

2）穩(wěn)定性檢測。測得顯色后的5 種標(biāo)準(zhǔn)液和樣品的最大吸光度，在最大波長處，每隔0.5 h 測定其吸光度，測定6 次，并計算RSD。

3）重復(fù)性檢測。取同一批菊苣種子粉碎后，過20 目篩，按照5 種樣品液制備方法，分別配制5 組樣品液，每組6 份，于相應(yīng)波長處測定吸光度，計算RSD。

4）加標(biāo)回收率。使用重復(fù)性試驗中剩余的樣品液，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線中的濃度梯度隨機抽取3 個濃度，每組按相同體積顯色，在每種成分的最大波長處測定其OD值，計算回收率、平均回收率及RSD。

2 結(jié)果與分析

2.1 可信度檢測

如表1 所示，標(biāo)準(zhǔn)液總多糖、總生物堿、總黃酮、總皂苷、總多酚精密度檢測RSD分別為1.74%、1.83%、1.73%、0.64%、1.71%，符合檢測要求，精密度良好；穩(wěn)定性檢測中3 h 內(nèi)5 種標(biāo)準(zhǔn)品、樣品成分均具有較強的穩(wěn)定性；重復(fù)性檢測RSD分別為0.79%、2.35%、2.03%、2.10%、1.79%，符合檢測要求，測定方法重復(fù)性良好，表明該檢測方法可靠，具有參考應(yīng)用價值。

表1 加標(biāo)回收率試驗結(jié)果 （單位：%）

2.2 菊苣種子5 種活性成分含量測定

如表2 所示，菊苣種子5 種活性成分測定中，活性成分含量大小依次為總多糖（29%）＞總黃酮（19%）＞總多酚（11%）＞總皂苷（8%）＞總生物堿（2%）。由此可見，菊苣種子中總多糖、總黃酮含量較高，合理利用具有很大的經(jīng)濟價值。

表2 菊苣種子5 種活性成分含量回歸方程

3 討論

菊苣所含生物活性物質(zhì)具有降血糖、抗氧化、增強免疫、降血脂等多種功效，被40 多個國家認(rèn)可、允許作為食品的營養(yǎng)增補劑。菊苣種植范圍廣、藥材廉價、安全性高，菊苣露、護(hù)肝布祖熱顆粒（種子∶根為2∶1）［6］、炎消迪娜兒糖（種子∶根為1∶2）［7］、復(fù)方木尼孜其顆粒（種子∶根為1∶1）［8］等產(chǎn)品已廣泛應(yīng)用于脂肪肝、肝炎、調(diào)節(jié)體液等疾病。臧薇等［9］報道毛菊苣粗提物（種子∶根為1∶2 和2∶1）對HepG2 細(xì)胞產(chǎn)生的抑制率、凋亡率高于單個給藥劑量，顯著增加S期細(xì)胞占比和降低G2 期細(xì)胞占比。

通過已報道菊苣相關(guān)文獻(xiàn)分析，菊苣中多糖類、黃酮類、多酚類、皂苷類、生物堿類生物活性物質(zhì)含量均有一定的差異，一方面與菊苣所生長的地理環(huán)境、種植年限、密度、野生、栽培、品種因素有關(guān)。卓瑪草等［10］選取菊苣Puna Ⅱ和Choice 2 個品種，研究黃土高原產(chǎn)草量及營養(yǎng)品質(zhì)，結(jié)果表明品種Puna Ⅱ的營養(yǎng)價值高于Choice。王貴等［11］選取菊苣TOPSCORE 品種分析不同種植密度對根用菊苣表型性狀及營養(yǎng)品質(zhì)的影響，結(jié)果顯示種植密度為1.33×105株/hm2的菊苣營養(yǎng)品質(zhì)指標(biāo)含量較高。另一方面與現(xiàn)代提取工藝、溶劑、儀器等因素有關(guān)。本研究區(qū)域菊苣種子中總多糖（29%）含量最高，其次為總黃酮（19%）。吳雨龍［12］報道菊苣多糖分離率為46.75%，由果糖、葡萄糖、山梨醇等成分組成。薛順［13］采用水提法測得菊苣粗多糖分離率為18.93%。研究表明，菊苣多糖能夠促進(jìn)胰島素分泌，影響糖代謝酶的活性，抑制糖異生，改善腎臟過氧化狀態(tài)，起到保護(hù)腎臟的作用［14，15］。莊紅艷等［16］報道菊苣中多糖含量為53.82%，不同產(chǎn)地、不同批次菊苣總多糖含量存在差異。許芳等［17］報道優(yōu)化超聲波協(xié)同酶法提取菊苣根多糖獲得率為46.75%。

黃酮類化合物是藥用植物產(chǎn)生的一類次級代謝產(chǎn)物，具有抗氧化、抗炎、改善心血管等多種作用。菊苣檢測出黃酮類成分40 余種，其中以黃酮醇、黃酮、花色素和苷類為主［13］。趙月等［18］通過響應(yīng)面法確定超聲-微波協(xié)同萃取栽培菊苣種子總黃酮，結(jié)果表明總黃酮提取得率為93.23 mg/g，栽培菊苣種子中的主要黃酮成分是綠原酸和洋薊素，洋薊素對DPPH 自由基的清除作用較大。劉馨瑤等［19］采用加熱回流法提取結(jié)球菊苣中總黃酮取率為4.11%；陳永平［20］報道菊苣根采取超聲波、復(fù)合酶解提取方法測得總黃酮得率為（5.43±0.12）mg/g。翁馨等［21］對毛菊苣地上部分的化學(xué)成分進(jìn)行研究，分離出新的黃酮苷化合物槲皮素-3-O-［6"-O-（3-乙氧基-1，3-二氧代丙基）］-β-D-吡喃葡糖苷（1）。

多酚類化合物有良好的清除體內(nèi)自由基、抑制脂質(zhì)過氧化等作用［22］。菊苣含有菊苣酸、綠原酸等多酚類物質(zhì)，其中綠原酸具有抗氧化作用，菊苣酸具有增強免疫功能、抗炎作用。尚紅梅等［23］報道菊苣種子總酚含量為10.17 mg/g，菊苣酚類化合物與菊苣根的抗氧化活性具有較大的關(guān)系。菊苣中含有咖啡因等生物堿，略帶苦味，能增加浸煮液色澤，提高咖啡的溶解質(zhì)量，紀(jì)可［24］報道菊苣根咖啡因提取率為2.14 mg/g。因此，常用作咖啡的添加物或代用品。

菊苣還有秦皮甲素、秦皮乙素、山萵苣素和山萵苣苦素等具有特殊生物活性的物質(zhì)，也是菊苣保健功能的重要指標(biāo)［25］。葉銀松等［26］報道菊苣成分山萵苣素、山萵苣苦素具有較強的抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用，尤其對乳腺癌和結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制作用較強。楊建等［27，28］報道毛菊苣種子中山萵苣素、山萵苣苦素、單咖啡酰酒石酸、綠原酸、菊苣酸含量分別為0.381 5、0.331 8、0.197 0、1.714 0、1.247 0 mg/g。布威海麗且姆·阿巴拜科日等［29］認(rèn)為毛菊苣莖、根、葉秦皮乙素含量隨著生長發(fā)育進(jìn)程而發(fā)生變化，6—7 月枝葉茂盛時秦皮乙酸含量最高。努力比亞·阿不都克尤木等［30］報道毛菊苣中分離得到的母菊素可阻斷大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6 的TGF-β/Smad 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制HSC-T6 激活，防止大鼠肝纖維化現(xiàn)象。