新加蓯蓉菟絲子湯通過調控AMPK/SIRT1 信號通路對卵巢儲備功能減退大鼠線粒體功能的影響

史 薇，銀雪梅，王智超，吳也可，吳克明*

（1.成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，四川 成都 610000； 2.山西大學中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，山西 太原 030000）

卵巢儲備功能減退 （diminished ovarian reserve，DOR） 是指育齡期女性卵母細胞質量和（或） 數(shù)量過早減退的病理狀態(tài)［1-2］。臨床根據生育力減退、抗苗勒管激素（anti-mullerian hormone，AMH） 下降、基礎血清促卵泡生成素 （follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH） 升高等臨床癥狀和指標異常予經驗性診斷和治療［3］。輔助生殖技術等療法在提高臨床妊娠率和降低流產率方面仍存在難點及不良反應諸多等問題，DOR 對生殖健康的不良影響已成為亟待解決的醫(yī)學和社會問題。

腎精是生殖的基礎，精血同源。吳克明教授認為DOR 根本病機是腎中精血虧虛，因虛致瘀，以補腎養(yǎng)血活血為治法創(chuàng)制的新加蓯蓉菟絲子湯可有效提高生育能力，延緩卵巢功能減退進程［4-5］。課題組前期研究證實，新加蓯蓉菟絲子湯及其藥物單體可抑制卵巢顆粒細胞凋亡和自噬，對抗氧化應激，促進卵泡發(fā)育［6-8］。Kasapo ?ɡlu 等［9］研究發(fā)現(xiàn)，卵泡儲備和卵子質量與線粒體功能障礙相關； 能量穩(wěn)態(tài)靶點腺苷活化蛋白激酶 （adenosine-activated protein kinase，AMPK） 和線粒體損傷應答關鍵沉默信息調節(jié)因子1 （silent mating type information regulator 1，SIRT1） 介導的信號通路可增加卵泡儲備和卵巢壽命［10-11］。因此，本研究建立雷公藤甲素誘導的DOR 大鼠模型，給予新加蓯蓉菟絲子湯和調經促孕丸進行干預，探究其對DOR 大鼠線粒體功能和AMPK/SIRT1 通路的影響，以期為中醫(yī)藥研究和臨床治療提供新的靶點和實驗依據。

1 材料

1.1 動物 動情周期正常的3 月齡健康成年雌性SD 大鼠24 只，體質量200 ～250 g，由成都達碩實驗動物有限公司提供 ［實驗動物生產許可證號SCXK （川） 2020-030］，分籠飼養(yǎng)于四川生物醫(yī)藥產業(yè)技術研究院，溫度24～26 ℃，相對濕度50% ～70%，晝夜光照，適應性喂養(yǎng)5 d，測試大鼠反應靈敏后用于實驗。實驗經成都中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審批通過。

1.2 藥物 新加蓯蓉菟絲子湯由菟絲子15 g、肉蓯蓉15 g、黃精10 g、淫羊藿15 g、覆盆子10 g、山茱萸10 g、熟地黃10 g、當歸10 g、澤蘭10 g、烏藥10 g、山藥10 g、枸杞子10 g 組成，經成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院華潤三九藥房以單味中藥顆粒混合制成全方免煎顆粒（每135 g 生藥加工成24.35 g免煎顆粒），根據《藥理實驗方法學》 等效劑量系數(shù)折算結合課題組前期實驗，選擇最佳劑量為5.11 g/kg［12］。調經促孕丸（水蜜丸5 g/袋，國藥準字Z11020027） 購自北京同仁堂國藥有限公司，研磨后用雙蒸水配制成混懸液，成人臨床用量為每天10 g，根據《藥理實驗方法學》 等效劑量系數(shù)折算成大鼠給藥劑量為1.05 g/kg。雷公藤甲素（粉劑1 000 mg/支，批號DST210929-034） 購自成都德思特生物技術有限公司。

1.3 試劑 FSH、AMH、抑制素B （inhibin B，INHB） 酶聯(lián)免疫吸附劑測定 （enzyme linked immunosorbent assay，ELISA） 試劑盒、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP） 試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，貨號E-EL-R0391c、E-EL-R3022、E-EL-R1027c、E-BC-K157-M）； 電鏡固定液 （武漢谷歌生物科技有限公司，貨號G1102）； 活性氧（reactive oxygen，ROS）、線粒體膜電位 （mitochondrial membrane potential，MMP）檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，貨號S0033S、C2006）； BCA 蛋白濃度測定試劑盒（合肥白鯊生物科技有限公司，貨號BL521A）； 兔β-actin 抗體、兔AMPK 抗體、兔SIRT1 抗體、兔過氧化物酶體增殖物激活受體γ 輔助活化因子1（peroxlsomeproliferator-activated receptor-γ coactlvator-1α，PGC-1α） 抗體 （美國Affinity 公司，貨號AF7018、AF6423、DF6033、DF7081）。

1.4 儀器 正置白光拍照顯微鏡（日本尼康公司）； 光譜儀（美國伯騰公司）； 透射電子顯微鏡（日本日立公司）； 流式細胞儀（德國貝克曼庫爾特公司）； 電泳儀、垂直電泳槽及組件（美國伯樂公司）； 化學發(fā)光成像系統(tǒng)（上海勤翔科學儀器有限公司）； 臺式高速冷凍型微型離心機（美國賽洛捷克公司）。

2 方法

2.1 模型建立 篩選動情周期正常的24 只大鼠，隨機分為空白組、模型組、調經促孕丸組、新加蓯蓉菟絲子湯組，每組6 只。除空白組外其余各組大鼠灌胃給予500 μg/kg 雷公藤甲素，連續(xù)30 d［12］。從造模第26 天起，每天上午9 點進行陰道脫落細胞涂片，連續(xù)5 d，觀察動情周期變化，當大鼠均出現(xiàn)動情周期紊亂時可認為造模成功。

2.2 分組及給藥 空白組、模型組大鼠灌胃給予生理鹽水（1 mL/100 g），調經促孕丸組大鼠灌胃給予1.05 g/kg 調經促孕丸懸濁液，新加蓯蓉菟絲子湯組大鼠灌胃給予新加蓯蓉菟絲子湯5.11 g/kg每天1 次，連續(xù)2 周。

2.3 取材 各組大鼠末次給藥1 h 后麻醉，腹主動脈采血，分離得到血清，于-20 ℃保存?zhèn)溆?。無菌分離雙側卵巢，并分別用電鏡固定液、4%多聚甲醛固定卵巢組織。

2.4 指標檢測

2.4.1 一般情況、動情周期 每天定時觀察大鼠飲水攝食、精神狀態(tài)、皮毛光澤、行為反應。在造模第26～30 天、給藥后第10 ～14 天進行陰道脫落上皮涂片，觀察動情周期。

2.4.2 蘇木素-伊紅（HE） 染色觀察卵泡發(fā)育情況 4%多聚甲醛固定的大鼠卵巢組織經脫水、包埋、切片、染色、封片，于顯微鏡下放大100 倍觀察卵泡發(fā)育情況，規(guī)范各級卵泡、黃體判定圖例；放大20 倍拍攝并計算初級卵泡、次級卵泡、成熟卵泡、閉鎖卵泡、黃體數(shù)量。

2.4.3 ELISA 法檢測血清FSH、AMH、INHB水平 大鼠全血2 000 r/min 離心10 min，取上清，按照ELISA 檢測試劑盒說明書檢測FSH、AMH、INHB 水平。

2.4.4 透射電鏡觀察卵巢組織線粒體結構 電鏡液固定的大鼠卵巢組織經脫水、滲透、包埋、切片、染色，在透射電子顯微鏡下放大7 000 倍觀察并采集圖像。

2.4.5 流式細胞術檢測卵巢組織ROS、MMP水平 取適量大鼠卵巢組織，加入含酶緩沖液，過濾后獲取細胞懸液，離心棄上清，PBS 洗滌細胞，加入流式上樣緩沖液重懸細胞并調整細胞密度，一部分細胞加入DCFH-DA 探針，于流式細胞儀上分析，以DCF 相對熒光量表示ROS 水平； 另一部分細胞加入JC-1 染色緩沖液，于流式細胞儀上分析檢測，以JC-1 形成聚合物和單體的比值表示MMP水平。

2.4.6 分光光度法檢測卵巢組織ATP 水平 使用裂解液充分勻漿裂解大鼠卵巢組織，按照ATP 試劑盒說明書加入工作液，采用分光光度法檢測ATP 水平。

2.4.7 Western blot 法檢測卵巢組織AMPK、SIRT1、PGC-1α 蛋白表達 采用RIPA 裂解提取大鼠卵巢組織總蛋白，蛋白定量試劑盒測定濃度，經電泳、轉膜、封閉、孵育一抗、孵育二抗、顯影，在化學發(fā)光成像系統(tǒng)下采集圖像，以β-actin 為內參，通過Image J 軟件測定灰度值。

2.5 統(tǒng)計學分析 通過SPSS 22.0 軟件進行處理，符合正態(tài)分布的數(shù)據以（±s） 表示，組間比較采用單因素方差分析，事后多重比較采用Tukey 檢驗； 若數(shù)據不符合正態(tài)分布，采用非參數(shù)Kruskal-Wallis 檢驗，事后兩兩比較采用Mann-Whitney 法。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 新加蓯蓉菟絲子湯對大鼠一般情況的影響 造模前大鼠反應靈敏，造模后大鼠逐漸出現(xiàn)反應遲鈍、少量體毛脫落、喜蜷縮扎堆等表現(xiàn)，飲食和攝水量無明顯變化，體質量降低（P＜0.01）； 新加蓯蓉菟絲子湯干預后，大鼠脫毛現(xiàn)象好轉，反應、活動敏捷度提升，體質量增加，見圖1。

圖1 各組大鼠體質量Fig.1 Rat body weight of each group

3.2 新加蓯蓉菟絲子湯對大鼠動情周期的影響 大鼠動情周期約4～5 d，分為動情前期（有核上皮細胞為主）、動情期（角化上皮細胞為主）、動情后期（有核、角化上皮細胞和白細胞均可見）、動情間期（白細胞為主），若周期延長（≥6 d）、停滯（≥3 d） 或無周期（無序） 則判定為動情周期紊亂。造模的18 只大鼠均出現(xiàn)動情周期紊亂（延長44.44%，停滯16.67%，無周期38.89%），說明大鼠卵巢功能抑制，動情周期紊亂。調經促孕丸、新加蓯蓉菟絲子湯干預后，部分大鼠恢復動情周期（周期正常50%，延長25%，停滯8.33%，無周期16.67%），其中新加蓯蓉菟絲子湯干預后有4 只大鼠恢復動情周期，有效率為66.67%。動情周期判定標準見圖2。

圖2 大鼠動情周期（×100）Fig.2 Estrous cycle of rats （×100）

3.3 新加蓯蓉菟絲子湯對大鼠卵巢各級卵泡及黃體數(shù)量的影響 與空白組比較，模型組初級卵泡、成熟卵泡數(shù)無明顯變化（P＞0.05），次級卵泡、黃體數(shù)減少（P＜0.05，P＜0.01），閉鎖卵泡數(shù)增加（P＜0.01）； 與模型組比較，調經促孕丸組、新加蓯蓉菟絲子湯組初級卵泡、次級卵泡、黃體數(shù)增加（P＜0.05，P＜0.01），其中新加蓯蓉菟絲子湯組閉鎖卵泡數(shù)減少（P＜0.01）。各級卵泡、黃體典型圖見圖3，卵巢HE 染色見圖4，卵泡、黃體計數(shù)見表1。

表1 新加蓯蓉菟絲子湯對大鼠卵巢各級卵泡及黃體數(shù)的影響（±s，n＝6）Tab.1 Effects of Modified Congrong Tusizi Decoction on follicles at various levels and corpus luteum of rats （±s，n＝6）

表1 新加蓯蓉菟絲子湯對大鼠卵巢各級卵泡及黃體數(shù)的影響（±s，n＝6）Tab.1 Effects of Modified Congrong Tusizi Decoction on follicles at various levels and corpus luteum of rats （±s，n＝6）

注： 與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01； 與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別初級卵泡/個次級卵泡/個成熟卵泡/個閉鎖卵泡/個黃體/個空白組1.67±1.214.17±1.721.33±1.510.17±0.415.17±2.14模型組0.67±0.520.33±0.82**0.17±0.414.00±2.00**2.83±0.98*調經促孕丸組3.00±1.67＃5.67±4.27＃＃0.50±0.842.67±2.075.83±2.23＃＃新加蓯蓉菟絲子湯組3.33±2.16＃＃7.67±4.50＃＃1.33±1.2210.17±0.41＃＃9.00±5.06＃

圖3 各級卵泡、黃體（×100）Fig.3 Follicles and corpus luteum at all levels

圖4 各組大鼠卵巢組織HE 染色（×20）Fig.4 HE staining for rat ovarian tissue of each group

3.4 新加蓯蓉菟絲子湯對大鼠血清FSH、AMH、INHB 水平的影響 與空白組比較，模型組大鼠血清FSH 水平升高（P＜0.01），AMH 水平降低（P＜0.05），INHB 水平無明顯變化（P＞0.05）； 與模型組比較，調經促孕丸組、新加蓯蓉菟絲子湯組大鼠血清FSH 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），INHB水平無明顯變化（P＞0.05），其中新加蓯蓉菟絲子湯組大鼠血清AMH 升高（P＜0.05），見表2。

表2 新加蓯蓉菟絲子湯對大鼠血清FSH、AMH、INHB 水平的影響（±s，n＝6）Tab.2 Effects of Modified Congrong Tusizi Decoction on serum FSH，AMH and INHB levels of rats （±s，n＝6）

表2 新加蓯蓉菟絲子湯對大鼠血清FSH、AMH、INHB 水平的影響（±s，n＝6）Tab.2 Effects of Modified Congrong Tusizi Decoction on serum FSH，AMH and INHB levels of rats （±s，n＝6）

注： 與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01； 與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別FSH/（ng·mg-1）AMH/（pg·mg-1）INHB/（pg·mL-1）空白組21.20±5.18743.73±123.7130.86±7.80模型組37.46±8.71**534.76±38.85*24.92±6.42調經促孕丸組20.25±3.45＃＃815.34±277.2729.70±11.57新加蓯蓉菟絲子湯組23.70±11.22＃745.03±166.16＃29.49±11.02

3.5 新加蓯蓉菟絲子湯對大鼠卵巢組織線粒體結構的影響 空白組大多為正常線粒體，大小均勻，形態(tài)正常，膜結構完整，嵴清晰可見； 模型組多為嚴重損傷線粒體，其形態(tài)崩解、明顯腫脹，部分膜結構模糊、嵴斷裂甚至空泡化； 調經促孕丸組、新加蓯蓉菟絲子組既有正常線粒體，也有損傷線粒體，部分形態(tài)損傷，輕度腫脹，膜結構基本完整，內部嵴結構模糊，見圖5。

圖5 新加蓯蓉菟絲子湯對大鼠卵巢線粒體結構的影響（×7 000）Fig.5 Effects of Modified Congrong Tusizi Decoction on the structure of ovary mitochondria in rats （×7 000）

3.6 新加蓯蓉菟絲子湯對大鼠卵巢線粒體功能的影響 與空白組比較，模型組大鼠卵巢組織ROS 水平升高（P＜0.01），ATP、MMP 水平降低（P＜0.01）；與模型組比較，調經促孕丸組、新加蓯蓉菟絲子湯組大鼠卵巢組織ROS 水平降低（P＜0.01），ATP、MMP 水平升高（P＜0.01），見表3。

表3 新加蓯蓉菟絲子湯對大鼠卵巢線粒體功能的影響（±s，n＝6）Tab.3 Effects of Modified Congrong Tusizi Decoction on the function of ovarian mitochondrial in rats （±s，n＝6）

表3 新加蓯蓉菟絲子湯對大鼠卵巢線粒體功能的影響（±s，n＝6）Tab.3 Effects of Modified Congrong Tusizi Decoction on the function of ovarian mitochondrial in rats （±s，n＝6）

注： 與空白組比較，**P＜0.01； 與模型組比較，＃＃P＜0.01。

組別ROSATP/（μmol·L-1）MMP空白組26 754.45±7 434.3616.35±1.0827.24±6.32模型組155 401.62±17 582.89**6.88±1.03**2.38±0.13**調經促孕丸組45 711.55±3 116.16＃＃9.52±1.44＃＃7.15±0.40＃＃新加蓯蓉菟絲子湯組72 322.13±1 000.79＃＃11.61±0.20＃＃6.17±4.25＃＃

3.7 新加蓯蓉菟絲子湯對大鼠卵巢組織AMPK、SIRT1、PGC-1α 蛋白表達的影響 與空白組比較，模型組大鼠卵巢組織AMPK、SIRT1、PGC-1α 蛋白表達降低（P＜0.01）； 與模型組比較，調經促孕丸組、新加蓯蓉菟絲子湯組大鼠卵巢組織AMPK、SIRT1、PGC-1α 蛋白表達升高 （P＜0.05，P＜0.01），見圖6。

圖6 新加蓯蓉菟絲子湯對大鼠卵巢組織AMPK、SIRT1、PGC-1α 蛋白表達的影響（±s，n＝6）Fig.6 Effects of Modified Congrong Tusizi Decoction on the ovarian protein expressions of AMPK，SIRT1 and PGC-1α of rats （±s，n＝6）

4 討論

腎為天癸之源，腎中精氣充盛則卵子發(fā)育成熟排出以受孕。婦人以血為本，腎精所化陰血是月經來潮和孕育胎兒的前提。調經促孕丸中菟絲子、淫羊藿、丹參和雞血藤共用，溫腎且養(yǎng)血活血，具備臨床療效循證依據［13-16］。新加蓯菟絲子湯中菟絲子和肉蓯蓉補腎益精共為君藥； 黃精、山茱萸、熟地黃、枸杞子、淫羊藿和覆盆子補腎之陰陽，當歸和山藥健脾養(yǎng)血，為臣藥； 澤蘭活血化瘀為佐藥；烏藥理氣行滯為使藥，諸藥合用補腎益精、養(yǎng)血活血，治療包括卵巢儲備功能下降在內的卵巢功能減退類疾病。

卵巢是女性的生育調控中心，卵泡成熟與否決定女性生育力。顆粒細胞是卵泡發(fā)育的基礎，線粒體是細胞能量供應的關鍵細胞器，對維持卵泡發(fā)育和產生高質量卵子具有重要作用［17］。線粒體呼吸鏈是細胞內ROS 產生的重要位點，因氧化損傷造成線粒體功能障礙是DOR 的重要發(fā)病機制［18-19］。氧化應激時，線粒體氧化磷酸化加快引起ROS 累積，造成線粒體腫脹、嵴斷裂等結構損傷以及ATP合成障礙、線粒體膜電位失衡等功能損傷，顆粒細胞能量代謝異常而干擾卵泡發(fā)育進程［20-21］。AMPK是線粒體因子SIRT1 和PGC-1α 的上游控制靶點［22］。研究發(fā)現(xiàn)AMPK 在卵母細胞、顆粒細胞等中均有表達，參與卵泡發(fā)育的正負反饋調節(jié)，其失活會加速線粒體自噬并啟動細胞程序性死亡［23-25］。Zhou 等［26］研究發(fā)現(xiàn)激活SIRT1 可抑制卵泡募集、發(fā)育與閉鎖，減緩始基卵泡消耗速率，保護卵巢儲備功能。在神經［27-28］、骨骼［29］、腎臟細胞［30］中均證實調控AMPK/SIRT1 通路可活化AMPK，激活SIRT1 和PGC-1α，抵消過度累積的ROS，調節(jié)線粒體能量代謝，對抗氧化應激，改善線粒體功能。

雷公藤對生殖系統(tǒng)有較強毒性，其提取物可抑制卵巢細胞增殖，誘導卵母細胞和顆粒細胞凋亡，加速卵泡消耗趨向枯竭［31-32］，是制備卵巢功能減退的常用造模方法。本實驗結果顯示，雷公藤甲素可引起大鼠動情周期紊亂，減少生長卵泡和黃體數(shù)，升高血清FSH 水平，降低AMH 和INHB 水平，與DOR 臨床表現(xiàn)及輔助檢查具有較高擬合度，提示DOR 疾病模型建立成功。而新加蓯菟絲子湯給藥后，大鼠部分恢復動情周期，各階段卵泡數(shù)增加，血清激素水平得到改善，卵巢功能得以恢復；且給藥后大鼠卵巢線粒體結構損傷較輕，ROS 累積減少，ATP 合成增加并恢復MMP 水平，說明其可有效糾正線粒體形態(tài)損傷和功能障礙。此外，新加蓯菟絲子可上調AMPK、SIRT1 和PGC-1α 蛋白表達，說明新加蓯蓉菟絲子湯可通過活化AMPK及其下游因子SIRT1 和PGC-1α 發(fā)揮線粒體保護作用。

綜上所述，新加蓯蓉菟絲子湯可通過激活AMPK/SIRT1 信號通路，糾正卵巢組織線粒體形態(tài)損傷和功能障礙，改善性激素紊亂，促進卵泡生長發(fā)育，延緩生殖衰老。但本實驗未探究線粒體生成等質量控制機制，并且未提取顆粒細胞和線粒體精確研究，后續(xù)可進一步深入探索完善相關分子生物學機制。