檳榔堿細(xì)胞毒性及其作用機(jī)制研究進(jìn)展

胡 晨，張昊芃，張曉朦，張爍穎，胡曉艷

（1.西南醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，四川 瀘州 646000； 2.西南醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)教研室，四川 瀘州 646000）

隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展，人們生活壓力逐漸增大，咀嚼檳榔已成為一種常用的提神醒腦方式。檳榔為棕櫚科常綠喬木檳榔的種子，可以藥食兩用，原產(chǎn)于馬來(lái)西亞，主要分布于南亞、東南亞國(guó)家及我國(guó)臺(tái)灣、福建、廣東、廣西等地。我國(guó)已有兩千多年的檳榔用藥史，《本草綱目》記載其“通關(guān)節(jié)，利九竅，補(bǔ)五勞七傷，健脾調(diào)中，除煩，破癥結(jié)”?，F(xiàn)代藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)，檳榔具有抑菌、驅(qū)蟲(chóng)、促胃腸道消化運(yùn)動(dòng)、抗腫瘤等藥理作用［1-5］。如今，由于食用檳榔人數(shù)的增加和現(xiàn)象的普遍，其導(dǎo)致的一系列疾病也備受重視。

檳榔化學(xué)成分復(fù)雜，含有多種生物堿，包括檳榔堿、檳榔次堿、甲基檳榔堿等［6］，其中檳榔堿含量最高，為主要藥理和毒性成分［7］。檳榔堿是一種有機(jī)物，化學(xué)式C8H13NO2，臨床用于治療青光眼、產(chǎn)后子宮出血等癥。長(zhǎng)期咀嚼所釋放出的檳榔堿可以誘發(fā)口腔黏膜下纖維化、心血管病變、高血壓、腎臟損傷等，甚至致癌［8-9］，且深入研究發(fā)現(xiàn)，檳榔堿具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性，內(nèi)皮、成纖維、上皮等細(xì)胞為其主要作用靶點(diǎn)，除表現(xiàn)抑制細(xì)胞增殖、促使細(xì)胞凋亡的共同影響外，檳榔堿對(duì)不同細(xì)胞的毒性作用存在一定的差異。本文將檳榔堿主要的細(xì)胞毒性及可能的作用機(jī)制進(jìn)行綜述，以期為期深入研究提供依據(jù)。

1 對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的毒性作用

內(nèi)皮細(xì)胞存在于血液與血管平滑肌之間，具有局部血管調(diào)節(jié)作用。Tseng 等［10］研究了檳榔堿對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的毒性作用，MTT 結(jié)果表明，0.8 mmol/L 檳榔堿作用24 h后能夠抑制細(xì)胞增殖，細(xì)胞數(shù)量減少31%，具有量效和時(shí)效依賴(lài)關(guān)系，隨劑量的增加，細(xì)胞收縮程度升高，G0/G1期、S 期占比分別降低14.1%、9.4%，G2/M 期細(xì)胞增加19.3% （P＜0.05），推測(cè)是由于檳榔堿能夠阻斷細(xì)胞分裂間期的物質(zhì)準(zhǔn)備，從而阻礙DNA 的復(fù)制和相關(guān)蛋白的合成，使細(xì)胞無(wú)法完成增殖。靳婷［11］將大鼠細(xì)胞暴露于高濃度檳榔堿24 h 后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活性降低，出現(xiàn)細(xì)胞凋亡的典型形態(tài)學(xué)改變，細(xì)胞內(nèi)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3） 水平升高，提示檳榔堿可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且caspase-3 可能在檳榔堿誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中起重要作用。

檳榔堿對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的毒性還可能與細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽轉(zhuǎn)化酶（glutathione S-transferase，GST） 活性有關(guān)，GST 是維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)的重要組成部分。Shakya 等［12］對(duì)果蠅體內(nèi)檳榔堿的毒性評(píng)估實(shí)驗(yàn)表明，果蠅體內(nèi)GST 活性降低，當(dāng)檳榔堿濃度為0.02、0.04、0.08 mmol/L 時(shí)，幼蟲(chóng)中GSH 活性分別降低1.36、1.60、1.80 倍，氧自由基（oxygen free-radicals，OFR） 水平升高（P＜0.05）?？赡苁前麅?nèi)谷胱甘肽損耗，OFR 的產(chǎn)生和清除之間的平衡遭到破壞，使線(xiàn)粒體膜通透性增大，細(xì)胞能量代謝活力降低，ATP 生成減少，促使細(xì)胞凋亡。Wu 等［13］研究檳榔堿對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的作用，發(fā)現(xiàn)檳榔堿可引起血管內(nèi)皮細(xì)胞胞內(nèi)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶活性升高，刺激NO 過(guò)度分泌導(dǎo)致血管內(nèi)皮擴(kuò)張，血管穩(wěn)態(tài)失衡。

綜上所述，檳榔堿作用于內(nèi)皮細(xì)胞后，造成細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變，血管內(nèi)皮的損傷，細(xì)胞內(nèi)OFR 水平的升高，凋亡相關(guān)蛋白的激活，影響凝血、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等功能障礙。

2 對(duì)上皮細(xì)胞的毒性作用

上皮細(xì)胞位于皮膚或腔道表層，具有保護(hù)、吸收、分泌等功能，進(jìn)入體內(nèi)的檳榔堿很容易損傷上皮細(xì)胞。將濃度為0.15、0.3 mmol/L 的檳榔堿分別作用于上皮細(xì)胞48 h后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞活力分別降低22%、30%，細(xì)胞收縮成紡錘形或圓形，細(xì)胞間隙變大，大量細(xì)胞溶解，并存在量效依賴(lài)性（P＜0.05）［14］。這一結(jié)果與Ren 等［15］研究結(jié)果一致，檳榔堿可促使轉(zhuǎn)化因子SAA1、IL-6、IL-36G 水平升高，使上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)分子表達(dá)異常，導(dǎo)致細(xì)胞極性喪失，細(xì)胞間連接方式被破壞。Shih 等［16］用0.4 mmol/L 檳榔堿染毒正常前列腺上皮細(xì)胞48 h 后，發(fā)現(xiàn)除細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變外，檳榔堿能抑制上皮細(xì)胞的活性，G1期和S 期細(xì)胞占比降低?？谇火つは吕w維化的特征之一是上皮細(xì)胞的萎縮，Li 等［17］利用口腔角質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行檳榔堿的毒性研究，結(jié)果表明，0.16 mmol/L 檳榔堿能抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，細(xì)胞骨架蛋白關(guān)鍵基因TPM1 表達(dá)降低，而敲除TPM1 削弱了檳榔堿對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，因此可推論TPM1 是導(dǎo)致細(xì)胞毒性的原因之一，也是治療口腔黏膜下纖維化的重要靶點(diǎn)。Voigt等［18］發(fā)現(xiàn)，檳榔堿可與脯氨酸競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合人質(zhì)子偶聯(lián)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1，從而減少腸上皮細(xì)胞對(duì)脯氨酸的攝取，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。而Lin 等［19］進(jìn)行小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，檳榔堿對(duì)細(xì)胞活力沒(méi)有影響，但劑量依賴(lài)性地升高腎皮質(zhì)纖連蛋白和纖溶酶原激活劑抑制蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)小鼠腎小管間質(zhì)纖維化，提示咀嚼檳榔可增加腎纖維化的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。此外，Uehara 等［20］將0.3 mmol/L 檳榔堿作用于人類(lèi)牙齦上皮細(xì)胞30 d 后與同時(shí)期陰性對(duì)照組比較，發(fā)現(xiàn)檳榔堿組細(xì)胞活性降低，基質(zhì)金屬蛋白酶9 （matrix metalloproteinase-9，MMP-9） 活性升高。MMP-9 活性升高可導(dǎo)致牙齦上皮細(xì)胞衰老，使上皮細(xì)胞獲得侵襲、轉(zhuǎn)移能力［21］，為檳榔堿致癌的潛在機(jī)制提供參考。綜上所述，上皮細(xì)胞毒性反應(yīng)因來(lái)源或部位而異，在一定條件下為患者個(gè)體化治療提供了可能，但目前缺乏體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)，且不排除其他因素可能的協(xié)同作用，仍有待進(jìn)一步研究。

檳榔堿能夠引起細(xì)胞的凋亡，具有潛在的致癌作用。Li 等［17］將濃度為0.16 mmol/L 的檳榔堿作用上皮細(xì)胞48 h，結(jié)果顯示，細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡現(xiàn)象，這可能與TPM1 表達(dá)降低和caspase 活性升高有關(guān)。這在張睿等［22］的研究結(jié)果得到了驗(yàn)證，檳榔堿可誘導(dǎo)凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、caspase-8 （外源性凋亡途徑的主要蛋白）、caspase-9（內(nèi)源性凋亡途徑的相關(guān)蛋白） 表達(dá)升高。但未發(fā)現(xiàn)caspase-9 有劑量依賴(lài)性［23］，表明檳榔堿主要以外源性途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。但目前未見(jiàn)檳榔堿對(duì)于上皮細(xì)胞安全劑量的探討，這也是深入研究的方向之一。

3 對(duì)成纖維細(xì)胞的毒性作用

成纖維細(xì)胞主要參與膠原的合成、降解、吞噬。體外研究發(fā)現(xiàn)，檳榔堿能影響成纖維細(xì)胞增殖、合成膠原蛋白等［24］。低劑量檳榔堿（濃度＜0.1 mmol/L） 能升高分泌型糖蛋白Wnt5a 表達(dá)來(lái)促進(jìn)人口腔成纖維細(xì)胞的增殖［25］，但高劑量檳榔堿（濃度＞0.2 mmol/L） 卻會(huì)使細(xì)胞活力降低，細(xì)胞增殖受到抑制［26］。表明檳榔堿對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的影響可能與使用劑量和細(xì)胞耐受程度有關(guān)。此外，Ku 等［27］在進(jìn)行大鼠體內(nèi)檳榔堿毒性研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，檳榔堿促使膠原蛋白在上皮組織下過(guò)度沉積，致使心臟纖維化，且轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1 （transforming growth factor-β1，TGF-β1） 表達(dá)升高約1.7 倍。推測(cè)TGF-β1 的高表達(dá)是檳榔堿促使膠原積累、產(chǎn)生細(xì)胞的毒性的重要機(jī)制。近年來(lái)研究證實(shí)，TGF-β1 是一種有效的促纖維化細(xì)胞因子，檳榔堿通過(guò)長(zhǎng)鏈非編碼RNA （LINC00974） 介導(dǎo)TGF-β/Smad信號(hào)通路刺激成纖維細(xì)胞活化［28］，激活膠原基因（COL1A2、COL3A1、COL6A1、COL6A3、COL7A1），誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化和膠原沉積［29］。Ho 等［30］和Yang 等［31］同樣利用TGF-β/Smad 信號(hào)通路進(jìn)行檳榔堿的毒性研究，結(jié)果表明，檳榔堿可介導(dǎo)TGF-β 使缺氧誘導(dǎo)因子-1 的mRNA、致癌基因miR-21 表達(dá)升高，促進(jìn)纖維化的發(fā)生。此外，檳榔堿還可介導(dǎo)HIF-1α/TGF-β/CTG 通路誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞中纖維相關(guān)分子（COL1A2、COL3A） 的表達(dá)，降低基質(zhì)金屬蛋白酶2 活性，促使異常細(xì)胞增殖和遷移［32］。綜上所述，檳榔堿能有效調(diào)節(jié)細(xì)胞因子增加細(xì)胞內(nèi)膠原蛋白的合成，這可能是檳榔堿誘發(fā)口腔黏膜下纖維化的原因之一。

4 對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用

自噬參與蛋白質(zhì)和細(xì)胞器的分解，在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中起重要作用，有利于細(xì)胞清除外來(lái)毒性物質(zhì)［33］。Gao 等［34］研究發(fā)現(xiàn)，2 mmol/L 檳榔堿可升高PC12 細(xì)胞自噬相關(guān)分子LC3 Ⅱ/LC3I 的比值和p62 蛋白表達(dá)，降低PC12 細(xì)胞的自噬作用。Jiang 等［35］將檳榔堿暴露于PC12細(xì)胞24 h 后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)Bcl-2 蛋白（抗凋亡蛋白） 表達(dá)降低，Bax 蛋白（促凋亡相關(guān)蛋白） 表達(dá)升高，且Bcl-2、Bax 等進(jìn)入線(xiàn)粒體后促使線(xiàn)粒體膜釋放細(xì)胞色素C，激活caspase 級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。同時(shí)小鼠耳蝸組織外植體實(shí)驗(yàn)研究證明，檳榔堿能劑量依賴(lài)性地降低超氧化物歧化酶活性和谷胱甘肽水平，抑制細(xì)胞抗氧化能力，產(chǎn)生活性氧和活化NADPH 氧化酶等酶類(lèi)，導(dǎo)致神經(jīng)元內(nèi)氧化還原反應(yīng)失衡及感覺(jué)神經(jīng)性聽(tīng)力障礙［36］。因此，檳榔堿對(duì)于神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用多面性大大提高了神經(jīng)疾病的發(fā)生率。

據(jù)報(bào)道，檳榔堿是世界上第四大最常用的人類(lèi)精神活性物質(zhì)（僅次于酒精、尼古丁、咖啡因），對(duì)中央和周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)也有一定的影響，長(zhǎng)期食用會(huì)導(dǎo)致成癮、出現(xiàn)沮喪、焦慮、注意力不集中、乏力等戒斷反應(yīng)［37-38］。Liu等［39］初步推測(cè)檳榔堿可能具有M 膽堿、擬副交感神經(jīng)毒性。這在Siregar 等［40］的研究得到證實(shí)，檳榔堿能與毒蕈堿、乙酰膽堿受體對(duì)接，使斑馬魚(yú)運(yùn)動(dòng)過(guò)度亢進(jìn)。但兩者廣譜的結(jié)合特性［41］使得基于藥理學(xué)和分子對(duì)接的方法難以獲得清晰的結(jié)果，且目前檳榔堿的神經(jīng)毒性研究相對(duì)較少，僅僅初步闡述了其基本毒性機(jī)制，故有待進(jìn)一步研究。

5 對(duì)脂肪細(xì)胞的毒性作用

檳榔堿染毒脂肪細(xì)胞后，能改變細(xì)胞周期不同階段的細(xì)胞分布，影響前脂肪細(xì)胞的生長(zhǎng)［42］。Hsieh 等［43］發(fā)現(xiàn)前脂肪細(xì)胞因子-1 （preadipocyte factor-1，Pref-1） 作為前脂肪細(xì)胞標(biāo)記物和脂肪細(xì)胞分化抑制劑，在前脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化為脂肪細(xì)胞的過(guò)程中，Pref-1 的mRNA 及蛋白表達(dá)降低，暴露于檳榔堿后，表達(dá)部分逆轉(zhuǎn)。表明檳榔堿能在一定程度上干擾前體脂肪細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的分化。除影響前脂肪細(xì)胞分化外，檳榔堿還會(huì)降低脂肪細(xì)胞儲(chǔ)脂能力。凌宏艷等［44］將0.1 mmol/L 檳榔堿作用于3T3-L1 脂肪細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)水平明顯降低，細(xì)胞儲(chǔ)脂功能異常。此外，絲氨酸307 磷酸化能減弱胰島素信號(hào)傳導(dǎo)［45］。濃度為0.1 mmol/L 的檳榔堿染毒脂肪細(xì)胞6 h 后，胰島素受體底物-1（insulin receptor substrate-1，IRS-1） 絲氨酸307 磷酸化基礎(chǔ)水平升高，阻斷胰島素介導(dǎo)的IRS-1 酪氨酸、脂質(zhì)激酶蛋白、蛋白激酶磷酸化［44］，表明檳榔堿能通過(guò)阻斷胰島素信號(hào)傳導(dǎo)產(chǎn)生胰島素抵抗，抑制脂肪細(xì)胞的脂質(zhì)儲(chǔ)存，促進(jìn)脂肪分解，升高血清中脂類(lèi)水平。這為檳榔咀嚼者?；加? 型糖尿病、高脂血癥、高甘油三脂血癥、代謝綜合癥作出了合理解釋。有文獻(xiàn)報(bào)道檳榔堿可能具有潛在的降糖作用。凌宏艷等［46］將1、5 mg/kg 檳榔堿注射于2 型糖尿病大鼠后，發(fā)現(xiàn)大鼠空腹血糖降低，而此處理對(duì)于正常大鼠來(lái)說(shuō)無(wú)影響。姚起鑫等［47］用同樣的模型進(jìn)行研究，指出1、5 mg/kg 為檳榔堿的安全降糖劑量，高劑量（質(zhì)量濃度＞5 mg/kg） 則具有明顯的細(xì)胞毒性，引起細(xì)胞水樣變性，脂肪空泡，這提示檳榔堿的毒性作用與劑量有關(guān)，且可能存在著種屬及機(jī)體狀態(tài)的差異。但目前檳榔堿對(duì)脂肪細(xì)胞的毒性研究仍是體外實(shí)驗(yàn)，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)及對(duì)糖尿病等相關(guān)代謝疾病的影響及其機(jī)制還有待明確。

6 對(duì)生殖細(xì)胞的毒性作用

檳榔堿可損傷男（雄） 性及女（雌） 性的生殖細(xì)胞，主要體現(xiàn)在氧化應(yīng)激反應(yīng)的產(chǎn)生。Wu 等［48］給予小鼠100 mg/kg 檳榔堿，發(fā)現(xiàn)小鼠精子內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化，抗氧化酶、唾液酸水平降低，從而損害精子數(shù)量和活性，影響精子頂體反應(yīng)與受精能力。這與Li 等［49］對(duì)女（雌） 性生殖細(xì)胞毒性機(jī)制的研究結(jié)果相似，將處于生發(fā)囊泡階段小鼠卵母細(xì)胞和1、1.15、1.2 mmol/L 檳榔堿溶液共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)檳榔堿量效依賴(lài)性地破壞線(xiàn)粒體完整性，引起ATP 產(chǎn)生的減少和活性氧合成的增加，影響肌動(dòng)蛋白分布及提高染色體排列異常的發(fā)生率，抑制小鼠卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂成熟，導(dǎo)致卵母細(xì)胞凋亡。這一作用會(huì)降低生殖細(xì)胞的質(zhì)量和數(shù)量，影響精卵識(shí)別和受精過(guò)程，最終可能導(dǎo)致生殖困難甚至不孕不育。而氧化應(yīng)激的產(chǎn)生進(jìn)一步誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子（COX-2、TNF-α、IL-6 等） 的釋放。檳榔堿能夠升高COX-2 表達(dá)，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，破壞負(fù)責(zé)鞭毛運(yùn)動(dòng)的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而降低精子運(yùn)動(dòng)能力［50］。Kuo 等［51］研究表明，檳榔堿劑量依賴(lài)性地誘導(dǎo)TNF-α 高表達(dá)，減少或重排細(xì)胞連接蛋白，破壞血-睪屏障，進(jìn)一步導(dǎo)致精子數(shù)量與活動(dòng)力，受精能力降低。且女性長(zhǎng)期咀嚼檳榔會(huì)減少妊娠早期胚胎的植入，抑制胚泡滋養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)，出現(xiàn)早產(chǎn)、流產(chǎn)等癥狀，并影響胎兒后續(xù)生長(zhǎng)，所生嬰兒大多表現(xiàn)為體重過(guò)輕和發(fā)育不良［52-53］。然而，有關(guān)檳榔或檳榔堿對(duì)生殖細(xì)胞的毒性機(jī)制目前仍相對(duì)缺乏，且檳榔堿對(duì)生殖細(xì)胞的直接毒性或其他作用機(jī)制還有待研究。

7 結(jié)語(yǔ)

檳榔堿作為傳統(tǒng)中藥檳榔的有效成分之一，具有許多藥理作用。然而，檳榔堿也對(duì)多種細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，表現(xiàn)為細(xì)胞活性降低、細(xì)胞氧化損傷、細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)改變、細(xì)胞凋亡等，進(jìn)而導(dǎo)致口腔黏膜下纖維化、2 型糖尿病、鱗狀上皮癌、不育不孕等疾病的發(fā)生。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)檳榔堿有許多臨床治療價(jià)值，可作為治療多種疾病的藥物。因此，研究檳榔堿細(xì)胞毒性作用及其可能存在的機(jī)制，可為臨床應(yīng)用提供一定的參考，同時(shí)需要更深入的研究以減少或者消除其毒性作用。