• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    肉桂醛體外對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的抑菌機(jī)制

    2020-03-25 03:10:04何學(xué)文戴雨蕓李欣越何涇正尹立子
    關(guān)鍵詞:肉桂細(xì)胞膜沙門氏菌

    何學(xué)文,戴雨蕓,李欣越,何涇正,李 超,程 嬌,尹立子

    (四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,四川 成都 611130)

    【研究意義】沙門氏菌屬屬革蘭氏陰性的腸桿菌科,為兼性厭氧細(xì)菌。沙門氏菌可利用葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、山梨醇、不發(fā)酵乳糖和蔗糖在普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)形成無色半透明、光滑、邊緣整齊的菌落。菌體抗原已經(jīng)被公認(rèn)為沙門氏菌血清型分型的基礎(chǔ),沙門氏菌的抗原種類多且結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜,目前全世界已發(fā)現(xiàn)的血清型約有2 500種,我國(guó)已發(fā)現(xiàn)292個(gè)血清型[1]。沙門氏菌可引起人和動(dòng)物的敗血癥、胃腸炎和局部感染。沙門氏菌還可以導(dǎo)致懷孕母畜流產(chǎn),嚴(yán)重影響動(dòng)物的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生產(chǎn)性能[2-4]。肉類、蛋類等動(dòng)物制品在加工過程中容易被沙門氏菌污染,人類食用被沙門氏菌污染的食品后易患病,臨床癥狀表現(xiàn)為腹瀉、腸熱病、菌血癥[5-6]。沙門氏菌的防治具有重要的公共衛(wèi)生意義?!厩叭搜芯窟M(jìn)展】肉桂醛也稱桂皮醛,為中藥桂枝和肉桂中的主要成分[7-9]。肉桂醛可用于心腦血管病、糖尿病、高血壓、胃潰瘍等疾病的治療和預(yù)防。此外,肉桂醛氣味芳香怡人,且對(duì)細(xì)菌、真菌具有一定的殺滅作用,也常用來作為食用香精和飼料防腐添加劑,目前已被廣泛應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域。王帆等[10]從生長(zhǎng)、結(jié)構(gòu)和生理指標(biāo)3方面探究肉桂醛對(duì)大腸桿菌和綠膿桿菌的抑制作用,結(jié)果顯示肉桂醛能抑制細(xì)菌的增殖,并損傷大腸桿菌和綠膿桿菌的細(xì)胞膜,測(cè)定生理指標(biāo)發(fā)現(xiàn)大腸桿菌內(nèi)活性氧含量明顯升高,說明肉桂醛可能通過氧化脅迫來?yè)p傷細(xì)胞膜,殺滅細(xì)菌。Karumathil等[11]發(fā)現(xiàn)反式肉桂醛可破壞鮑曼不動(dòng)桿菌的生物膜,其作用機(jī)制為下調(diào)鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。據(jù)研究表明,肉桂醛可降低黃曲霉菌胞內(nèi)活性氧(ROS)代謝水平,并且引起菌絲細(xì)胞氧化損傷、增加細(xì)胞膜通透性[12]。王貴強(qiáng)等[13]發(fā)現(xiàn)肉桂醛可損傷耐藥白色念珠菌細(xì)胞膜,抑制細(xì)胞膜麥角甾醇的合成。此外還有研究表明肉桂醛能下調(diào)金黃色葡萄球菌毒力因子的表達(dá)[14]。【本研究切入點(diǎn)】已有的研究表明,肉桂醛對(duì)細(xì)菌和真菌都具有一定的抑制作用,但其作用機(jī)制并不相同,包括氧化損傷、下調(diào)基因轉(zhuǎn)錄水平、增加細(xì)胞膜通透性等,但肉桂醛對(duì)沙門氏菌的作用機(jī)制尚未完全明確。本文將在前人的研究基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探究肉桂醛的抑菌機(jī)制?!緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以鼠傷寒沙門氏菌為實(shí)驗(yàn)菌株,通過觀察肉桂醛對(duì)沙門氏菌增殖速率、蛋白質(zhì)、細(xì)胞膜通透性和細(xì)胞形態(tài)等方面的影響,探究肉桂醛對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的體外抑菌機(jī)制,為肉桂醛應(yīng)用于臨床抗沙門氏菌感染提供理論依據(jù)。

    1 材料和方法

    1.1 菌株

    鼠傷寒沙門氏菌(ATCC14028)由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存,將沙門氏菌活化后涂布于胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基,置37℃恒溫靜置培養(yǎng)24 h,挑取單菌落接種于胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)液,37℃,震蕩培養(yǎng)過夜,然后稀釋成OD600nm=0.2的菌懸液備用。

    1.2 試劑和儀器

    肉桂醛(HPLC≥98%)購(gòu)于成都瑞芬思生物科技有限公司;胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)和胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)購(gòu)于杭州微生物試劑有限公司;考馬斯亮藍(lán)R-250、二甲基亞砜、無水葡萄糖、無水乙醇購(gòu)于成都浩博優(yōu)科技有限公司;SDS-PAGE凝膠配置試劑盒、5×蛋白上樣緩沖液和雙色預(yù)染蛋白Marker購(gòu)于成都羅寧生物有限公司;磷酸鹽緩沖液粉末(PBS)購(gòu)于成都好校友生物科技有限公司;BCA試劑盒購(gòu)于南京建成生物科技有限公司。

    SM530C高壓蒸汽滅菌鍋、低溫恒溫培養(yǎng)箱(成都盛德先華科貿(mào)有限公司);高速冷凍離心機(jī)ST16R(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司);電子分析天平J-SKY(昆山巨天儀器設(shè)備有限公司);超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)SM-650A(南京舜瑪儀器設(shè)備有限公司);全功能凝膠成像系統(tǒng)儀(美國(guó)Bio-Rad公司);電導(dǎo)率儀DDS-307(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司);超凈工作臺(tái)SW.CJ.1D(成都市宜邦科析儀器有限公司)。

    1.3 試驗(yàn)方法

    1.3.1MIC和MBC的測(cè)定MIC的測(cè)定參照CLSI,采用微量肉湯稀釋法。向96孔板中加入TSB和肉桂醛,通過倍比稀釋法使藥物終質(zhì)量濃度為512,256,128,64,32,16,8,4,2 μg/mL,然后加入菌懸液。另外設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組(加TSB和菌懸液),陰性對(duì)照組(加TSB和藥物),空白對(duì)照組(加TSB)。96孔板在37℃靜置培養(yǎng)24 h后,陽(yáng)性對(duì)照組應(yīng)渾濁,空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組應(yīng)澄清透明。觀察每組實(shí)驗(yàn)結(jié)果,培養(yǎng)液澄清透明的最小藥物濃度為MIC。

    在MIC的基礎(chǔ)上,取藥物組澄清的培養(yǎng)基100 μL均勻涂布于TSA平板,37℃靜置培養(yǎng)24 h。然后肉眼觀察,培養(yǎng)基上菌落不超過5個(gè)視為殺滅細(xì)菌的最小藥物濃度為MBC。

    1.3.2 肉桂醛對(duì)沙門氏菌生長(zhǎng)曲線的影響 向TSB培養(yǎng)基中加入菌懸液,使培養(yǎng)基中細(xì)菌的終濃度OD600nm為0.2左右。然后加入肉桂醛,使肉桂醛最終濃度為1/8MIC、1/4MIC、1/2MIC、MIC、2MIC和4MIC。同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組(不加肉桂醛)。37 ℃震蕩(150 r/min)培養(yǎng),分別于0,1,2,3,4,6,8,10,12,24 h時(shí)吸取出培養(yǎng)液測(cè)定OD600nm的數(shù)值。以時(shí)間為橫坐標(biāo),吸光光度值為縱坐標(biāo),繪制肉桂醛作用后沙門氏菌的生長(zhǎng)曲線并確定沙門氏菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

    1.3.3 肉桂醛作用鼠傷寒沙門氏菌的SDS-PAGE分析 沙門氏菌接種于TSB培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)過夜,將菌液稀釋至OD600nm為0.2左右,分別加入不同濃度的肉桂醛藥液,使肉桂醛的終濃度為1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC,并設(shè)置空白對(duì)照組(不加肉桂醛),37℃震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期。將菌液稀釋至相同OD值后,取等體積菌液離心(6 000 r/min,10 min),棄上清,PBS清洗沉淀,重復(fù)3次后,將沉淀重懸于1 mL PBS緩沖液中。用超聲破碎儀破碎菌體,設(shè)定程序?yàn)槠扑? s,停頓2 s,75%功率,破碎時(shí)間為10 min。破碎后6 000 r/min離心取上清液。用BCA試劑盒測(cè)定上清液中的蛋白含量。取等量4倍體積上清液加入1倍體積5×上樣緩沖液,98℃變性處理5 min,各取15 μL樣品進(jìn)行電泳,電泳結(jié)束后凝膠用考馬斯亮藍(lán)R250染色過夜,然后脫色4~8 h,用凝膠成像儀拍照。

    1.3.4 掃描電子顯微鏡觀察肉桂醛對(duì)鼠傷寒沙門氏菌形態(tài)的影響 沙門氏菌接種于TSB培養(yǎng)基中,加入肉桂醛藥液,使肉桂醛最終濃度為1/8MIC、1/4MIC、1/2MIC,并設(shè)置空白對(duì)照組(不加肉桂醛),37℃震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期。取細(xì)菌懸液離心,棄上清,用滅菌的PBS緩沖液洗滌3次至上清液透明無色為止,棄上清。2.5%戊二醛溶液固定菌體后,4℃放置過夜,然后用PBS緩沖液輕柔洗滌3遍,經(jīng)過30%、50%、70%、90%、100%濃度的乙醇脫水,每個(gè)濃度各處理5 min,隨后室溫晾干、噴金,在掃描電子顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)。

    1.3.5 肉桂醛對(duì)鼠傷寒沙門氏菌細(xì)胞膜的影響 沙門氏菌接種于TSB培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期,離心棄上清液,用無菌5%葡萄糖溶液洗滌3次,然后將菌體重懸于無菌5%葡萄糖溶液中,使其濃度為1×107CFU/mL,設(shè)置藥物處理組和空白對(duì)照組(不加肉桂醛),處理組加入MIC濃度的肉桂醛藥液,空白組不加藥液。將菌液于37 ℃震蕩培養(yǎng)(150 r/min),分別于0,0.5,1,1.5,2,2.5,3 h取上清液測(cè)量電導(dǎo)率,以時(shí)間為橫坐標(biāo)、電導(dǎo)率為縱坐標(biāo)作圖。

    1.3.6 肉桂醛對(duì)鼠傷寒沙門氏菌DNA外滲量的影響 將沙門氏菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期,用無菌PBS緩沖液洗滌3次后重懸,制成1×107CFU/mL的菌懸液,設(shè)置藥物處理組和空白對(duì)照組(不加肉桂醛),處理組加入肉桂醛藥液,使其濃度為MIC,將菌液于37 ℃震蕩培養(yǎng)(150 r/min),分別于0,0.5,1,1.5,2,2.5,3 h取上清液測(cè)量260 nm處的吸光光度值,并以時(shí)間為橫坐標(biāo)、OD值為縱坐標(biāo)作圖。

    1.3.7 數(shù)據(jù)分析 每個(gè)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,用GraphPad Prism6.0軟件處理并分析電導(dǎo)率實(shí)驗(yàn)和DNA外滲實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù),組間進(jìn)行t檢驗(yàn),P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 MIC和MBC的測(cè)定

    肉桂醛對(duì)沙門氏菌的MIC為128 μg/mL,MBC為512 μg/mL。結(jié)果表明肉桂醛具有一定的抑菌效果。

    2.2 肉桂醛對(duì)鼠傷寒沙門氏菌生長(zhǎng)曲線的作用

    不同濃度肉桂醛與沙門氏菌共培養(yǎng)的生長(zhǎng)曲線見圖1。培養(yǎng)6 h后細(xì)菌達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期,12 h后細(xì)菌達(dá)到平臺(tái)期。與空白對(duì)照組相比,1/8MIC、1/4MIC、1/2MIC濃度的肉桂醛對(duì)沙門氏菌生長(zhǎng)沒有明顯的影響;MIC和2MIC濃度的肉桂醛在沙門氏菌生長(zhǎng)前期有抑制作用,隨著培養(yǎng)時(shí)間增加,抑制作用減弱;4MIC濃度的肉桂醛能完全抑制沙門氏菌的生長(zhǎng)。因此可以得出結(jié)論,肉桂醛屬于濃度依賴型的抗菌藥物,隨著藥物濃度升高,其抗菌效果逐漸增強(qiáng)。

    2.3 肉桂醛作用于鼠傷寒沙門氏菌的SDS-PAGE分析

    肉桂醛作用沙門氏菌后的蛋白質(zhì)圖譜見圖2。圖中的蛋白條帶分離良好,較清晰,條帶主要分布于20~250 ku。隨著肉桂醛濃度升高,蛋白條帶由深變淺甚至消失。結(jié)果表明肉桂醛在低于MIC的濃度下能影響沙門氏菌蛋白質(zhì)的合成,且藥物濃度越高,對(duì)蛋白質(zhì)的影響越明顯。

    圖1 肉桂醛對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的生長(zhǎng)曲線Fig.1 The growth curve of cinnamaldehyde against Salmonella typhimurium

    圖2 肉桂醛對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.2 SDS-PAGE protein atlas of Salmonella typhimurium co-cultured with cinnamaldehyde

    2.4 肉桂醛對(duì)鼠傷寒沙門氏菌形態(tài)的影響

    不同濃度的肉桂醛作用于沙門氏菌后,掃描電子顯微鏡結(jié)果見圖3??瞻讓?duì)照組(圖3A),沙門氏菌為短桿狀,細(xì)胞膜無明顯皺褶,細(xì)胞之間有絲狀蛋白質(zhì)連接。1/8MIC處理組(圖3B)中絲狀蛋白質(zhì)顯著減少,沙門氏菌細(xì)胞形態(tài)無明顯變化;1/4MIC處理組(圖3C)中沙門氏菌的細(xì)胞膜發(fā)生坍塌,細(xì)胞黏連,不能保持正常形態(tài);1/2MIC處理組(圖3D)中沙門氏菌的結(jié)構(gòu)被破壞,細(xì)胞破碎,界限模糊,細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化。掃描電鏡結(jié)果表明肉桂醛可破壞沙門氏菌的細(xì)胞膜,影響細(xì)胞形態(tài),且藥物濃度越高,對(duì)細(xì)菌影響越明顯。

    圖3 肉桂醛對(duì)鼠傷寒沙門氏菌形態(tài)的影響Fig.3 Effect of cinnamaldehyde on morphology of Salmonella typhimurium

    2.5 肉桂醛對(duì)鼠傷寒沙門氏菌細(xì)胞膜的影響

    肉桂醛作用于沙門氏菌的電導(dǎo)率曲線見圖4。由圖可知,空白對(duì)照組的電導(dǎo)率變化不明顯,只有輕微的升高,可能是細(xì)菌正常的代謝過程導(dǎo)致電導(dǎo)率上升。1MIC組的電導(dǎo)率在0~30 min處與對(duì)照組上升幅度相同,在30~60 min處迅速上升,表明肉桂醛對(duì)沙門氏菌的細(xì)胞膜造成破壞,細(xì)胞膜通透性增加,引起細(xì)胞質(zhì)外泄,電導(dǎo)率升高。電導(dǎo)率曲線說明肉桂醛可能作用于沙門氏菌的細(xì)胞膜,使細(xì)胞內(nèi)容物外流,最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡。

    圖4 肉桂醛對(duì)鼠傷寒沙門氏菌電導(dǎo)率的影響(P<0.05)Fig.4 Effect of cinnamaldehyde on conductivity of Salmonella typhimurium

    圖5 肉桂醛對(duì)鼠傷寒沙門氏菌DNA外滲量的影響(P<0.05)Fig.5 Effect of cinnamaldehyde on DNA exosmosis amount of Salmonella typhimurium

    2.6 肉桂醛對(duì)鼠傷寒沙門氏菌DNA外滲量的影響

    肉桂醛作用于鼠傷寒沙門氏菌后的DNA外滲量見圖5??瞻讓?duì)照組在260 nm處的吸光光度值沒有明顯上升,MIC濃度的肉桂醛作用后,吸光光度值明顯上升,30 min后達(dá)到峰值,說明DNA外滲嚴(yán)重。結(jié)果表明,肉桂醛對(duì)細(xì)胞膜的通透性產(chǎn)生影響,引起DNA外滲,與電導(dǎo)率實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

    3 結(jié)論與討論

    桂枝在傷寒病的治療中占據(jù)重要地位,而肉桂醛是桂枝的主要有效成分,因此本實(shí)驗(yàn)探究了肉桂醛對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的體外抑菌機(jī)制。肉桂醛的MIC為128 μg/mL,MBC為512 μg/mL,在體內(nèi)幾乎不能達(dá)到有效的抑菌濃度,但是臨床上桂枝對(duì)傷寒病具有良好的治療效果,提示肉桂醛或許不是通過抑菌或殺菌來治療沙門氏菌的感染。近年來,中藥的作用機(jī)制研究越來越深入,許多研究表明中藥提取物對(duì)細(xì)菌的作用機(jī)制與傳統(tǒng)抗生素不同,中藥提取物對(duì)細(xì)菌的細(xì)胞形態(tài)、毒力因子、生長(zhǎng)代謝等具有抑制作用[15-17]。

    與MIC濃度的肉桂醛共同培養(yǎng)后,沙門氏菌的細(xì)胞膜被破壞,細(xì)胞膜通透性升高,細(xì)胞內(nèi)容物外流,電導(dǎo)率和DNA滲出量上升,與對(duì)照組相比差異顯著。掃描電子顯微鏡的圖片同樣說明隨著藥物濃度升高,沙門氏菌的細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞膜受到影響。低濃度下沙門氏菌的菌體表面發(fā)生坍塌皺縮,1/2MIC組的菌體破碎、變形的現(xiàn)象最明顯。該現(xiàn)象與其他研究者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,可以推測(cè)肉桂醛的作用靶點(diǎn)是細(xì)胞膜,使細(xì)胞不能維持正常的生理過程,擾亂代謝途徑,進(jìn)而引起沙門氏菌死亡[18-20]。

    聚丙烯酰胺凝膠的分子篩效應(yīng)可將蛋白質(zhì)分離,加入SDS后,蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞,消除了電荷差異,因此電泳遷移率主要取決于蛋白質(zhì)或亞基的分子量大小。本實(shí)驗(yàn)取等量菌體進(jìn)行SDSPAGE,分析肉桂醛對(duì)沙門氏菌胞內(nèi)總蛋白的影響,結(jié)果顯示亞抑菌濃度的肉桂醛作用于沙門氏菌后,蛋白質(zhì)條帶變淺甚至部分條帶消失,說明肉桂醛可以抑制沙門氏菌蛋白質(zhì)的代謝。李正文[21]發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿降低了豬胸膜肺炎放線菌蛋白質(zhì)表達(dá),藥物處理后SDS-PAGE中部分條帶消失,推測(cè)鹽酸小檗堿可能作用于44.3 ku以下的蛋白質(zhì)。百里香酚作用于金黃色葡萄球菌后,菌體蛋白質(zhì)的含量顯著降低[22]。蛋白質(zhì)作為生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者,細(xì)菌的各種生命活動(dòng)都離不開蛋白質(zhì)的參與,因此肉桂醛對(duì)蛋白質(zhì)的具體作用機(jī)制有待深入研究。

    肉桂醛能抑制鼠傷寒沙門氏菌的增殖,MIC為128 μg/mL,MBC為512 μg/mL,亞抑菌濃度的肉桂醛可作用于細(xì)胞膜,破壞菌體正常形態(tài),增加細(xì)胞膜通透性,使細(xì)胞內(nèi)容物外流,同時(shí)對(duì)菌體蛋白質(zhì)的代謝具有抑制作用。由于SDS-PAGE無法確定受到影響的蛋白質(zhì)種類,因此肉桂醛對(duì)蛋白質(zhì)的抑制機(jī)制還需要深入探究。

    猜你喜歡
    肉桂細(xì)胞膜沙門氏菌
    羅定榃濱鎮(zhèn)舉行肉桂文化節(jié)
    源流(2023年5期)2023-07-01 14:07:24
    歐盟擬制定與爬行動(dòng)物肉中沙門氏菌相關(guān)
    兔沙門氏菌病的診斷報(bào)告
    不同肉桂品種光合能力差異分析
    皮膚磨削術(shù)聯(lián)合表皮細(xì)胞膜片治療穩(wěn)定期白癜風(fēng)療效觀察
    正二十面體Au13和Pt13團(tuán)簇上肉桂醛的吸附
    宮永寬:給生物醫(yī)用材料穿上仿細(xì)胞膜外衣
    肉桂油納米微乳的制備
    MSL抗菌肽對(duì)鼠傷寒沙門氏菌感染的預(yù)防作用
    香芹酚對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜的影響
    av又黄又爽大尺度在线免费看| 少妇 在线观看| 黄片无遮挡物在线观看| 高清午夜精品一区二区三区| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 99久久综合免费| 在线观看国产h片| 国产伦精品一区二区三区视频9| 国产精品一国产av| 久久婷婷青草| 亚洲av综合色区一区| 免费观看的影片在线观看| 99精品久久久久人妻精品| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 欧美一级毛片孕妇| 国产成人精品在线电影| 老汉色av国产亚洲站长工具| 亚洲少妇的诱惑av| 国产高清视频在线播放一区| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 99国产精品一区二区三区| a级毛片黄视频| 国产亚洲av高清不卡| 色老头精品视频在线观看| 黄色毛片三级朝国网站| 搡老乐熟女国产| 色婷婷av一区二区三区视频| 国产av又大| 欧美乱妇无乱码| 美女国产高潮福利片在线看| 91大片在线观看| aaaaa片日本免费| 母亲3免费完整高清在线观看| 亚洲熟妇熟女久久| 国产主播在线观看一区二区| 十八禁高潮呻吟视频| 亚洲熟女毛片儿| 真人做人爱边吃奶动态| av片东京热男人的天堂| 国产成人影院久久av| 男女免费视频国产| 两个人免费观看高清视频| 老司机靠b影院| 午夜两性在线视频| 免费日韩欧美在线观看| 精品卡一卡二卡四卡免费| 久久久久久久久免费视频了| 亚洲伊人久久精品综合| 桃红色精品国产亚洲av| 99国产综合亚洲精品| 国产精品免费一区二区三区在线 | 日韩大码丰满熟妇| 亚洲av日韩在线播放| 99精国产麻豆久久婷婷| 国产精品.久久久| 日韩欧美三级三区| 国产不卡av网站在线观看| 久久久久久久国产电影| 午夜两性在线视频| 久久热在线av| 日韩大片免费观看网站| 国产精品av久久久久免费| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 亚洲国产欧美在线一区| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| av欧美777| 热re99久久精品国产66热6| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 久久亚洲精品不卡| 精品人妻1区二区| 亚洲专区中文字幕在线| 麻豆成人av在线观看| 午夜91福利影院| 午夜成年电影在线免费观看| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 亚洲精华国产精华精| 大香蕉久久网| 嫩草影视91久久| 女同久久另类99精品国产91| 国产成+人综合+亚洲专区| 黄色怎么调成土黄色| 高清av免费在线| 免费不卡黄色视频| 久久人妻av系列| 久久99热这里只频精品6学生| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 国产av又大| 在线观看免费日韩欧美大片| 满18在线观看网站| 一个人免费在线观看的高清视频| www.999成人在线观看| 两个人免费观看高清视频| 搡老岳熟女国产| 999精品在线视频| 精品少妇久久久久久888优播| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 精品免费久久久久久久清纯 | av欧美777| 男女无遮挡免费网站观看| 韩国精品一区二区三区| 亚洲中文字幕日韩| 无限看片的www在线观看| 国精品久久久久久国模美| 黄色怎么调成土黄色| 国产亚洲欧美精品永久| 首页视频小说图片口味搜索| 女人精品久久久久毛片| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 两人在一起打扑克的视频| 首页视频小说图片口味搜索| 精品午夜福利视频在线观看一区 | 91老司机精品| 亚洲国产av新网站| 久久九九热精品免费| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 丝瓜视频免费看黄片| 欧美日韩av久久| 国产成人精品久久二区二区免费| 国产区一区二久久| 欧美精品一区二区大全| 成人免费观看视频高清| 欧美激情极品国产一区二区三区| 午夜福利,免费看| 99精品欧美一区二区三区四区| 天堂动漫精品| 亚洲中文av在线| 国产男女超爽视频在线观看| 免费观看av网站的网址| 欧美日韩成人在线一区二区| 满18在线观看网站| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 午夜成年电影在线免费观看| 亚洲综合色网址| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 操出白浆在线播放| 欧美乱妇无乱码| 超色免费av| 这个男人来自地球电影免费观看| 欧美精品一区二区大全| 久久久国产一区二区| 久久九九热精品免费| 两性夫妻黄色片| 三级毛片av免费| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 日韩有码中文字幕| 国产成人免费观看mmmm| 久久久久国产一级毛片高清牌| 高清av免费在线| 国产精品一区二区免费欧美| 亚洲午夜理论影院| 亚洲五月色婷婷综合| 婷婷成人精品国产| 日本黄色视频三级网站网址 | 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 国产麻豆69| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 最新在线观看一区二区三区| 一级片'在线观看视频| 淫妇啪啪啪对白视频| 91精品国产国语对白视频| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 日韩免费av在线播放| 极品少妇高潮喷水抽搐| 国产主播在线观看一区二区| 大香蕉久久网| 日本欧美视频一区| 亚洲第一av免费看| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 又黄又粗又硬又大视频| 国产在视频线精品| 亚洲精品久久午夜乱码| 精品国产亚洲在线| 男女无遮挡免费网站观看| 久久精品国产亚洲av高清一级| 日韩大码丰满熟妇| 国产亚洲精品久久久久5区| 精品少妇黑人巨大在线播放| av在线播放免费不卡| 少妇被粗大的猛进出69影院| 在线永久观看黄色视频| 亚洲第一青青草原| 日韩欧美三级三区| 色94色欧美一区二区| 亚洲av欧美aⅴ国产| 丝袜人妻中文字幕| 亚洲伊人久久精品综合| 男女高潮啪啪啪动态图| 脱女人内裤的视频| 国产成人精品久久二区二区免费| 久久精品国产综合久久久| 一本综合久久免费| 国产精品1区2区在线观看. | 中亚洲国语对白在线视频| 亚洲一区二区三区欧美精品| 大香蕉久久成人网| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 午夜精品久久久久久毛片777| 人人妻人人澡人人看| 桃花免费在线播放| 午夜激情久久久久久久| 国产成人啪精品午夜网站| 成人影院久久| 国产精品电影一区二区三区 | 黄色毛片三级朝国网站| 91九色精品人成在线观看| 欧美日韩av久久| 丝袜在线中文字幕| 亚洲第一av免费看| kizo精华| 中文字幕人妻丝袜制服| 一级,二级,三级黄色视频| 国产国语露脸激情在线看| 亚洲欧洲日产国产| 91精品国产国语对白视频| a级毛片黄视频| 亚洲全国av大片| 考比视频在线观看| 日韩欧美免费精品| 国产精品偷伦视频观看了| 久久久国产一区二区| 青青草视频在线视频观看| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 午夜福利乱码中文字幕| 精品少妇黑人巨大在线播放| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 国产成人精品无人区| 久久香蕉激情| 久久久精品94久久精品| 午夜91福利影院| 妹子高潮喷水视频| 欧美在线黄色| 91成年电影在线观看| 免费人妻精品一区二区三区视频| 少妇的丰满在线观看| 中文字幕av电影在线播放| 精品久久久精品久久久| 国产成人精品久久二区二区免费| 一级毛片精品| 国产精品久久久久成人av| 在线观看舔阴道视频| 一本久久精品| 欧美精品亚洲一区二区| 国产精品国产高清国产av | 一区二区三区国产精品乱码| 99国产精品一区二区三区| 激情视频va一区二区三区| 亚洲少妇的诱惑av| 十八禁网站免费在线| 亚洲一码二码三码区别大吗| 精品一区二区三区四区五区乱码| 久久影院123| 久久久久网色| 精品人妻1区二区| 国产精品九九99| 久久精品91无色码中文字幕| 免费观看a级毛片全部| 丰满饥渴人妻一区二区三| 韩国精品一区二区三区| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 极品教师在线免费播放| 亚洲人成电影观看| 亚洲伊人久久精品综合| 正在播放国产对白刺激| 亚洲午夜理论影院| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 99国产极品粉嫩在线观看| 蜜桃在线观看..| 叶爱在线成人免费视频播放| 91国产中文字幕| 欧美成人免费av一区二区三区 | 麻豆av在线久日| 国产精品亚洲av一区麻豆| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 精品一品国产午夜福利视频| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 三级毛片av免费| 精品国产乱子伦一区二区三区| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 免费少妇av软件| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | kizo精华| 国产有黄有色有爽视频| 中文字幕人妻熟女乱码| 人人澡人人妻人| 下体分泌物呈黄色| 国产一区有黄有色的免费视频| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 在线观看舔阴道视频| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 在线永久观看黄色视频| 交换朋友夫妻互换小说| 午夜激情久久久久久久| 男男h啪啪无遮挡| 我要看黄色一级片免费的| 亚洲中文字幕日韩| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 丝袜喷水一区| 国产一区二区激情短视频| 俄罗斯特黄特色一大片| 欧美精品一区二区免费开放| 久久这里只有精品19| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 久久ye,这里只有精品| 国产1区2区3区精品| 少妇粗大呻吟视频| 久久久欧美国产精品| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 国产一区二区三区视频了| 宅男免费午夜| 日韩大码丰满熟妇| 欧美成人免费av一区二区三区 | 欧美日韩视频精品一区| 免费av中文字幕在线| 国产精品久久久久成人av| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 99国产精品免费福利视频| 亚洲五月婷婷丁香| 多毛熟女@视频| 精品久久久精品久久久| 老汉色∧v一级毛片| 在线永久观看黄色视频| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 天堂俺去俺来也www色官网| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 日韩视频一区二区在线观看| 午夜精品久久久久久毛片777| 精品第一国产精品| 水蜜桃什么品种好| 天天影视国产精品| 免费观看人在逋| 色婷婷av一区二区三区视频| 午夜日韩欧美国产| 丝袜在线中文字幕| videosex国产| 国产欧美日韩一区二区精品| 国产成人av激情在线播放| 成年版毛片免费区| 国产男靠女视频免费网站| 大香蕉久久网| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 脱女人内裤的视频| 亚洲专区中文字幕在线| 一个人免费在线观看的高清视频| 一区二区av电影网| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 99国产极品粉嫩在线观看| av有码第一页| 99精品久久久久人妻精品| 日日夜夜操网爽| 婷婷成人精品国产| 国产精品免费一区二区三区在线 | 国产在线一区二区三区精| 欧美日本中文国产一区发布| av福利片在线| 亚洲国产欧美网| 国产在线一区二区三区精| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 男女免费视频国产| 精品午夜福利视频在线观看一区 | 亚洲精品在线美女| 亚洲国产看品久久| 狠狠狠狠99中文字幕| 操出白浆在线播放| 制服人妻中文乱码| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 三上悠亚av全集在线观看| 国产免费av片在线观看野外av| 俄罗斯特黄特色一大片| 久9热在线精品视频| 黑人猛操日本美女一级片| 欧美性长视频在线观看| 日韩欧美国产一区二区入口| 久久中文字幕人妻熟女| 亚洲成a人片在线一区二区| 曰老女人黄片| 男女无遮挡免费网站观看| 欧美精品一区二区大全| 国产精品 欧美亚洲| 成人特级黄色片久久久久久久 | 纵有疾风起免费观看全集完整版| 亚洲avbb在线观看| 亚洲专区国产一区二区| 高清视频免费观看一区二区| bbb黄色大片| 99国产精品一区二区三区| 亚洲精品在线观看二区| www.999成人在线观看| 国产极品粉嫩免费观看在线| 久久ye,这里只有精品| 超碰97精品在线观看| 午夜福利免费观看在线| 黄色片一级片一级黄色片| 丰满少妇做爰视频| 色在线成人网| 亚洲七黄色美女视频| 国产亚洲欧美精品永久| 欧美精品亚洲一区二区| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 岛国在线观看网站| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 欧美在线一区亚洲| av一本久久久久| 不卡一级毛片| 女性生殖器流出的白浆| 国产一区二区在线观看av| 欧美人与性动交α欧美软件| 精品一品国产午夜福利视频| 大香蕉久久成人网| 在线观看免费高清a一片| 国产真人三级小视频在线观看| 黄频高清免费视频| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 女警被强在线播放| 色婷婷久久久亚洲欧美| 亚洲成人国产一区在线观看| 一进一出抽搐动态| 国产精品98久久久久久宅男小说| 女性生殖器流出的白浆| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 蜜桃在线观看..| 国产黄频视频在线观看| 成人精品一区二区免费| 国产淫语在线视频| 后天国语完整版免费观看| 亚洲中文日韩欧美视频| 精品一区二区三卡| 波多野结衣一区麻豆| 亚洲专区字幕在线| 他把我摸到了高潮在线观看 | 国产精品98久久久久久宅男小说| 亚洲,欧美精品.| 99久久国产精品久久久| 成年版毛片免费区| 国产午夜精品久久久久久| 中文字幕色久视频| 激情视频va一区二区三区| 亚洲九九香蕉| 美女扒开内裤让男人捅视频| 女性被躁到高潮视频| www.999成人在线观看| 午夜精品久久久久久毛片777| 中文字幕av电影在线播放| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 欧美成人免费av一区二区三区 | 国产麻豆69| 国产精品免费视频内射| 久久久国产精品麻豆| 久久ye,这里只有精品| 一个人免费看片子| 久久香蕉激情| 老司机在亚洲福利影院| 成年人免费黄色播放视频| 亚洲精品乱久久久久久| 在线观看www视频免费| 免费观看人在逋| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 久久精品国产a三级三级三级| 大型av网站在线播放| 色视频在线一区二区三区| 久久精品国产a三级三级三级| 老鸭窝网址在线观看| 啦啦啦在线免费观看视频4| 国产日韩欧美在线精品| 免费观看人在逋| 最近最新中文字幕大全电影3 | 国产三级黄色录像| 国产激情久久老熟女| 午夜视频精品福利| 日韩人妻精品一区2区三区| 精品卡一卡二卡四卡免费| 欧美黑人精品巨大| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 成人特级黄色片久久久久久久 | 操出白浆在线播放| av免费在线观看网站| 国产精品九九99| 多毛熟女@视频| 成人国产一区最新在线观看| 电影成人av| 精品少妇内射三级| 亚洲男人天堂网一区| 人妻久久中文字幕网| 自线自在国产av| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 五月天丁香电影| 中文字幕人妻丝袜制服| 丰满迷人的少妇在线观看| 国产欧美日韩一区二区三| 中文字幕人妻熟女乱码| 欧美成人午夜精品| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 99热国产这里只有精品6| 欧美激情久久久久久爽电影 | 啦啦啦 在线观看视频| 国产精品久久电影中文字幕 | 我的亚洲天堂| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 成在线人永久免费视频| 黄色怎么调成土黄色| 两个人免费观看高清视频| 99久久精品国产亚洲精品| 妹子高潮喷水视频| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 蜜桃在线观看..| 婷婷丁香在线五月| 精品亚洲成a人片在线观看| 一区二区三区精品91| 搡老熟女国产l中国老女人| 久久天堂一区二区三区四区| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| av免费在线观看网站| 亚洲av日韩在线播放| 一级毛片女人18水好多| 国产不卡一卡二| 欧美成人免费av一区二区三区 | 亚洲国产中文字幕在线视频| 久久久久久久国产电影| 波多野结衣一区麻豆| 五月天丁香电影| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 欧美精品av麻豆av| 丁香六月天网| 99久久国产精品久久久| 女同久久另类99精品国产91| 国产成人精品久久二区二区91| 日韩免费高清中文字幕av| 欧美激情极品国产一区二区三区| 青青草视频在线视频观看| 国产高清激情床上av| 亚洲精品乱久久久久久| 精品人妻1区二区| 在线观看免费午夜福利视频| 日韩中文字幕欧美一区二区| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 国产成人精品在线电影| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 亚洲国产看品久久| 日本vs欧美在线观看视频| 亚洲专区中文字幕在线| 亚洲熟女精品中文字幕| 国产精品国产高清国产av | 中文字幕人妻丝袜一区二区| 国产精品欧美亚洲77777| 涩涩av久久男人的天堂| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 国产福利在线免费观看视频| 一本大道久久a久久精品| 午夜福利在线免费观看网站| 日日爽夜夜爽网站| 深夜精品福利| 最新美女视频免费是黄的| 日韩欧美一区视频在线观看| 欧美一级毛片孕妇| 波多野结衣av一区二区av| e午夜精品久久久久久久| 亚洲 国产 在线| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 热re99久久精品国产66热6| 嫁个100分男人电影在线观看| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 18禁美女被吸乳视频| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 99国产精品一区二区三区| 不卡一级毛片| 久久九九热精品免费| 国产亚洲一区二区精品| 欧美日韩成人在线一区二区| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 午夜福利在线观看吧| 又紧又爽又黄一区二区| 免费看十八禁软件| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 国产伦人伦偷精品视频| 亚洲午夜理论影院| 亚洲性夜色夜夜综合| 丝袜美足系列| 国产精品.久久久| 99精品在免费线老司机午夜| 老汉色av国产亚洲站长工具| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 免费在线观看完整版高清| 9色porny在线观看| 深夜精品福利| 久久99热这里只频精品6学生| www.999成人在线观看| 亚洲精品久久午夜乱码| 99在线人妻在线中文字幕 | 色尼玛亚洲综合影院| 国产精品国产av在线观看| 久久久久精品国产欧美久久久| 另类亚洲欧美激情| 制服人妻中文乱码| 欧美黑人欧美精品刺激| 高潮久久久久久久久久久不卡| 久久久久精品人妻al黑| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 91成年电影在线观看| 搡老熟女国产l中国老女人| 丝袜美腿诱惑在线| 757午夜福利合集在线观看| 日本黄色日本黄色录像| 精品少妇久久久久久888优播| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 黄色怎么调成土黄色|