不同環(huán)境中纖維素降解菌群多樣性差異分析

楊 明，袁 悅，李憲臻，楊 帆

（大連工業(yè)大學 生物工程學院，遼寧 大連 116034）

【研究意義】纖維素是地球上最豐富的有機聚合物，平均占植物生物量的30%～50%[1-2]。研究纖維素降解相關(guān)菌群對于解決農(nóng)業(yè)廢棄物的回收利用、可再生能源的開發(fā)等環(huán)境和能源問題有著重要意義[3-4]。纖維素是由D-葡萄糖以β-1，4糖苷鍵連接構(gòu)成，由于聚合度高加之結(jié)晶度高的特性，導致其難以降解，極大地限制了纖維素在上述相關(guān)領(lǐng)域的應用[5]。纖維素的生物降解需要多種纖維素酶協(xié)同完成，包括內(nèi)切葡聚糖酶，外切葡聚糖酶，纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶等[6-7]。纖維素酶是由纖維素降解菌合成分泌，纖維素降解菌廣泛存在于自然界中，多分布在纖維素聚集和降解的環(huán)境[8]。這些環(huán)境中多以微生物復合菌系協(xié)同作用的方式完成纖維素的降解，因此研究環(huán)境細菌多樣性對于闡明纖維素生物降解機理顯得尤為重要?！厩叭搜芯窟M展】瘤胃、堆肥和森林土壤等是研究的較多的纖維素降解環(huán)境[9]，其中含有大量能夠降解纖維素的微生物。目前已有很多關(guān)于纖維素酶產(chǎn)生菌的研究報道，其中大多數(shù)中篩選自動物瘤胃、堆肥、森林土壤等環(huán)境[10-11]。然而，基于純培養(yǎng)的傳統(tǒng)分析方法存在很大的局限性，自然界中超過99%的微生物都是不可培養(yǎng)的[12]。隨著高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展，16S rDNA基因擴增子高通量測序分析技術(shù)可直接針對細菌群落進行分析，基于16S rDNA的高變區(qū)序列信息對微生物群落中的細菌進行物種種類和豐度的鑒定[13]，能夠更全面地分析微生物多樣性。Li等[14]應用16S rDNA基因測序方法對牛瘤胃菌群進行了分析，獲得了以45個核心微生物屬為主的共107個細菌屬，展現(xiàn)出豐富的菌群多樣性。Ren等[15]對牛糞堆肥中的微生物群落進行了16S r DNA基因高通量測序分析，發(fā)現(xiàn)其優(yōu)勢菌門包括擬桿菌門、變形菌門、厚壁菌門和放線菌門，并且發(fā)酵的不同階段具有不同的細菌。王志方等[16]應用16S rDNA高通量測序技術(shù)對棉秸稈自然腐解過程中不同時間點的樣品進行分析，發(fā)現(xiàn)在第7天時細菌群落多樣性在屬水平上與腐解起始階段差異顯著（P＜0.05），隨著腐解時間延長，菌落多樣性趨于一致；在整個腐熟過程中始終存在5個優(yōu)勢屬，功能預測為降解纖維素、木質(zhì)素、果膠類物質(zhì)以及提供氮素營養(yǎng)。【本研究切入點】近年來，測序技術(shù)以超摩爾定律的速度在不斷發(fā)展，測序成本越來越低[17]，16S rDNA基因測序數(shù)據(jù)也在不斷加速積累，且海量的數(shù)據(jù)被公開于NCBI-SRA數(shù)據(jù)庫，這其中也包括瘤胃、堆肥、土壤等不同自然環(huán)境下纖維素降解菌群數(shù)據(jù)。此外，盡管16S rDNA基因測序技術(shù)在纖維素降解菌群的結(jié)構(gòu)和多樣性研究方面取得了進展，但這些研究多數(shù)僅僅關(guān)注的是來自某種特定環(huán)境的纖維素降解菌群，卻很少有研究對不同環(huán)境下的纖維素降解菌群進行比較分析?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究選取了來自NCBI-SRA數(shù)據(jù)庫中的牛瘤胃、牛糞堆肥、森林土壤3種代表性的纖維素降解菌群和作為對照的家犬腸道微生物群落共102個的16S rDNA樣本的高通量測序數(shù)據(jù)，對這些數(shù)據(jù)進行了細菌群落多樣性的共性和差異分析，以評估不同來源的纖維素降解菌群在各個分類級別上的共性和差異特征，鑒定各類菌群的生物標志物，對功能主導性菌群進行挖掘，為進一步探索纖維素降解菌群的功能、研究纖維素降解生物學機制以及開發(fā)有利用價值的微生物提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 數(shù)據(jù)采集 16S rDNA Illumina Miseq高通量測序數(shù)據(jù)搜索自NCBI（National Center of Biotechnology Information）的SRA（Sequence Read Archive）數(shù)據(jù)庫中收錄的牛瘤胃BR（SRA ID：SRP156364）、牛糞堆肥CDC（SRA ID：SRP074428）、森林土壤FS（SRA ID：SRP125392）和家犬糞便DF（SRA ID：SRP092477）4個項目的樣本數(shù)據(jù)。

1.1.2 數(shù)據(jù)篩選標準 將搜索到的數(shù)據(jù)進行篩選，保留16S rDNA數(shù)據(jù)篩選均需符合下列生物學標準和相應的技術(shù)標準。生物學標準：（1）牛瘤胃菌群來自愛爾蘭米斯郡歐洲農(nóng)業(yè)食品有限公司的健康牛瘤胃；（2）牛糞堆肥菌群來自加拿大農(nóng)業(yè)與食品學會的牛糞好氧堆肥；（3）森林土壤菌群FS采集自中國遼寧省撫順市林場的針葉林表層土（深度不超過10 cm）細菌；（4）家犬糞便DF微生物樣本為未作處理的健康狀態(tài)下家犬的新鮮糞便樣本，來自密蘇里大學（美國密蘇里州哥倫比亞）。技術(shù)標準：（1）16S rDNA基因擴增序列為V4區(qū)；（2）測序平臺為Illumina Miseq測序平臺；（3）測序數(shù)據(jù)量不小于30 Mbp。

1.2 實驗方法

應用SRA Toolkit軟件中的fastq-dump命令將sra格式的文件轉(zhuǎn)換為FastQ格式[18]。FastQ格式的雙末端reads經(jīng)過濾獲得高質(zhì)量reads[19]。應用FLASH軟件[20]將雙末端reads拼接成Tags，并去除沒有overlap關(guān)系的reads，低質(zhì)量的Tags（雙末端reads最小重疊長度為15 bp，其重疊區(qū)域錯配率＞10%）以及攜帶的引物序列的Tags，從而得到高質(zhì)量Tags。應用SRA Toolkit軟件中的fastq-dump命令下載SRA格式的文件并轉(zhuǎn)換為FastQ格式。應用USEARCH GLOBAL方法，將Tags重新比對回OTU序列得到每個樣品在每個OTU的豐度統(tǒng)計表[24]。應用RDP classifier（v2.2）[25]將OTU與Greengenes數(shù)據(jù)庫[26]比對進行物種注釋（如果Tag長度大于等于250 bp，置信度閾值設(shè)置為0.8，否則設(shè)置為0.5），去除沒有注釋結(jié)果和非細菌物種的OTU，并根據(jù)注釋結(jié)果計算每個樣本組在各分類水平（門、綱、目、科和屬）的群落組成結(jié)構(gòu)信息。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

Alpha多樣性反映了單個樣本內(nèi)物種的多樣性。mothur軟件計算Alpha多樣性的觀察指數(shù)（observed species index）、趙氏指數(shù)（chao1 index）、艾斯指數(shù)（abundance-based coverage estimator index，ACE index）、香農(nóng)-維納指數(shù)（shannon-wiener index）和辛普森指數(shù)（simpson index）。觀察指數(shù)反映的是已經(jīng)檢測到的物種數(shù)量；趙氏指數(shù)和艾斯指數(shù)則是基于物種和豐度值對真實物種數(shù)的推測；香農(nóng)-維納指數(shù)和辛普森指數(shù)則反映群落的多樣性，是物種數(shù)量和豐度分布均一性的綜合反映。Beta多樣性分析用于評估樣品在物種復雜性上的差異距離。通過QIIME（v1.80）[27]計算加權(quán)和非加權(quán)Unifrac距離[28]，主坐標分析（PCoA）使用的是R軟件（v3.0.3）的WGCNA，stats和ggplot2軟件包，即將加權(quán)或非加權(quán)UniFrac距離矩陣轉(zhuǎn)化為一組新的正交軸，其中最大變異的因子作為第一主坐標，第二大變異因子作為第二主坐標表示。R軟件的VennDiagram包用于繪制Venn圖，ggplot2包用于繪制箱線圖和柱狀圖。Metastats軟件（http://metastats.cbcb.umd.edu）用于組間顯著性差異分析。統(tǒng)計假設(shè)檢驗均以α=0.05為標準界定是否具有統(tǒng)計學意義。LEfSe（v1.0）[29]用于發(fā)現(xiàn)各組中物種生物標志物（Biomarker），其LDA分數(shù)的閾值設(shè)為4。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同纖維素降解環(huán)境菌群多樣性分析與比較

牛瘤胃BR、牛糞堆肥CDC、森林土壤FS和家犬糞便DF 4個組共102個樣本的16S rDNA基因擴增子測序數(shù)據(jù)經(jīng)過前處理，共獲得8 122 885條高質(zhì)量16S rDNA標簽序列，平均每個樣本的數(shù)量約為79 636，在97%的相似水平上進行操作分類單元（OTU）序列聚類，共獲得80 386個OTU類群。觀察物種指數(shù)（observed species index）結(jié)果顯示物種平均豐富度由高到低為牛糞堆肥、家犬糞便、牛瘤胃，森林土壤僅顯著低于牛糞堆肥，但與其他兩組無顯著差異。趙氏指數(shù)（chao1 index）和艾斯指數(shù)（ACE index）結(jié)果均顯示平均物種豐富度最高為牛糞堆肥，其次為家犬糞便和牛瘤胃，而森林土壤與其他環(huán)境未表現(xiàn)出顯著差異。香農(nóng)-維納指數(shù)（shannon-wiener index）和辛普森指數(shù)（simpson index）均可以用來估算細菌多樣性。香農(nóng)-維納指數(shù)值越大，細菌多樣性越高；辛普森指數(shù)介于0和1之間，與香農(nóng)-維納指數(shù)相反，數(shù)值越低細菌的多樣性越高。因此，這兩個細菌多樣性指數(shù)均顯示牛糞堆肥菌群多樣性顯著高于其他環(huán)境，且牛瘤胃的香農(nóng)-維納指數(shù)顯著高于家犬糞便。

本研究對4個群落的Unifrac Beta多樣性進行分析并用主坐標分析（PCoA）的可視化方式進行展示，以評估各樣本之間的相似度和差異。如圖2所示，非加權(quán)Unifrac PCoA的第一主坐標貢獻率達19.6%，第二主坐標貢獻率達15.2%，共代表總變量的34.8%；加權(quán)Unifrac PCoA的第一主坐標貢獻率達31.2%，第二主坐標貢獻率達16.3%，共代表總變量的47.5%。基于OTU豐度數(shù)據(jù)可以把同一個樣本組的菌群樣本聚集在一定區(qū)域內(nèi)，而不同樣本組間獲得了很好的分離。

2.2 不同纖維素降解環(huán)境菌群的組成差異

所有樣本組中總共檢測出55個門，其中Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes和Actinobacteria是4個最優(yōu)勢門，他們均在牛瘤胃和牛糞堆肥中均占有很大比例（圖3a）。作為對照的家犬糞便菌群以Bacteroidetes、Firmicutes、梭桿菌門（Fusobacteria）和Proteobacteria為最優(yōu)勢門，F(xiàn)usobacteria是其特有門，另外存在極少量的Actinobacteria。牛糞堆肥中Bacteroidetes相對豐度顯著低于其他菌群（圖3d），而Actinobacteria的相對豐度顯著高于其他菌群（圖3e）。與牛瘤胃和牛糞堆肥不同，森林土壤環(huán)境中的Proteobacteria顯著高于其他纖維素降解環(huán)境（圖3b），僅存在極低豐度的Firmicutes（圖3c）。

屬水平上所有樣本中總共檢測到1 936個屬，選取相對豐度最高的前17個屬（不包括Unclassified、Others和Uncultured）進行了比較（圖4a）。家犬糞便中的優(yōu)勢屬包括梭桿菌屬（Fusobacterium）、擬桿菌屬（Bacteroides）、糞桿菌屬（Faecalibacterium）、Prevotella-9和乳酸菌屬（Lactobacillus），除了Lactobacillus外其余均為家犬糞便中的特有菌屬。牛瘤胃中相對豐度較高的屬有琥珀酸弧菌UCG-001屬（SuccinivibrionaceaeUCG-001）、Prevotella-7、甲烷短桿菌屬（Methanobrevibacter）、Succiniclasticum、Prevotella-1和少量的Lactobacillus，其中SuccinivibrionaceaeUCG-001和Succiniclasticum僅在牛瘤胃中被觀察到，而Prevotella在動物消化道來源的環(huán)境中均有發(fā)現(xiàn)，不同的是Prevotella-7和Prevotella-1存在于牛瘤胃中，而Prevotella-9存在于家犬糞便中。Methanobrevibacter在牛瘤胃和牛糞堆肥中均被檢測到，牛糞堆肥中的相對豐度較低。牛糞堆肥中的觀察到的特有菌屬包括Halocella、Limnochordaceae-ge和氫孢菌屬（Hydrogenispora）。另外，Pseudomonas僅在牛糞堆肥和森林土壤中被檢測到，且在前者中相對豐度極顯著低于后者（P＜0.01）。此外，黃桿菌屬（Flavobacterium）、NS3a海洋菌屬（NS3amarine group）和假噬纖維菌屬（Pseudarcicella）屬為森林土壤中所特有。

圖3 不同環(huán)境菌群門水平相對豐度分布和優(yōu)勢菌門差異比較Fig.3 Relative abundance distribution at phylum level and the difference of relative abundance of dominant phylum in different environments

圖4 不同環(huán)境菌群下屬水平優(yōu)勢菌群相對豐度分布和Venn圖Fig.4 Relative abundance distribution and Venn diagram at genus level in different environments

韋恩圖分析（圖4b）表明僅有73（4.44%）個屬是4類菌群共有的，86個屬是3類纖維素降解菌群共有的。而森林土壤和牛糞堆肥中的特有屬較多，分別為677和224個；牛瘤胃和家犬糞便中的特有的屬分別僅觀察到10和56個。屬水平統(tǒng)計的物種豐富度從高到低表現(xiàn)為森林土壤、牛糞堆肥、牛瘤胃、家犬糞便，分別檢測到1 413、1 044、414和269個屬。

圖5 不同環(huán)境菌群的LEfSe分析Fig.5 LEfSe analysis of bacterial communities from different environments

2.3 不同纖維素降解環(huán)境菌群生物標志物分析

為了更進一步考察不同環(huán)境中纖維素降解菌的差異尋找不同環(huán)境的關(guān)鍵菌群，本研究對物種注釋后獲得的OTUs豐度譜進行了線性判別分析效應值（LEfSe）分析（圖5）。LEfSe為最近出現(xiàn)的一種基于線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）效應量（effect size）的分析方法，其本質(zhì)是將非參數(shù)統(tǒng)計檢驗（Kruskal-Wallis多組檢驗與Wilcoxon秩和檢驗）與線性判別分析相結(jié)合，從而篩選關(guān)鍵的生物標志物（比如關(guān)鍵功能類群/物種）[30]。結(jié)果顯示，牛瘤胃、牛糞堆肥、森林土壤及家犬糞便組間具有顯著差異的不同級別分類單元重要的生物標志物數(shù)量分別為12、5、9和13。由于不同分類級別的生物標志物之間存在從屬關(guān)系，表1對LEfSe分析結(jié)果進行了整理，并對各個生物標志物的相對豐度進行標識，以直觀展示不同環(huán)境中重要生物標志性物種及其相對豐度。生物標志物將以門水平和最低級別分類水平加以描述。對照組家犬糞便的生物標志物包括Bacteroidetes的Bacteroides、Fusobacteria的Fusobacterium以及來自Firmicutes的Faecalibacterium。與對照組同為動物消化系統(tǒng)直接來源菌群，牛瘤胃組中的生物標志物包括廣古菌門（Euryarchaeota）、來自Proteobacteria的SuccinivibrionaceaeUCG-001、來自Bacteroidetes的Prevotella-7、來自Firmicutes的Selenomonadales和Lachnospiraceae；作為動物消化系統(tǒng)和體外環(huán)境來源的混合菌群，牛糞堆肥組的生物標志物為來自Actinobacteria門Actinobacteria綱和來自Firmicutes的Bacillales；作為體外環(huán)境來源菌群森林土壤組生物標志物以Proteobacteria為主，包括Pseudomonas、Alphaproteobacteria、伯克氏菌科（Burkholderiaceae）以及Bacteroidetes門的Flavobacteriaceae。

表1 不同環(huán)境菌群的生物標志物及其相對豐度*Tab.1 Relative abundance of biomarkers from different environments

3 討論

隨著二代測序技術(shù)成本逐漸降低和技術(shù)的不斷更新，16S rDNA擴增子測序技術(shù)被廣泛用于纖維素降解菌群多樣性的研究中，加強了人們對纖維素降解菌群結(jié)構(gòu)和功能的認知。然而大多數(shù)研究者僅關(guān)注于單一環(huán)境類型中的纖維素降解菌群，卻鮮有對不同環(huán)境下的纖維素降解菌群進行分析。本研究以家犬糞便菌群16S rDNA序列數(shù)據(jù)為對照，選擇來自牛瘤胃、牛糞堆肥、森林土壤的3類菌群數(shù)據(jù)作為不同環(huán)境條件下的纖維素降解菌群，對其菌群結(jié)構(gòu)多樣性進行對比分析，旨在闡明菌群的結(jié)構(gòu)和功能，為進一步挖掘有潛在應用價值的纖維素降解菌以及解析纖維素降解功能奠定理論基礎(chǔ)。

菌群多樣性分析發(fā)現(xiàn)，牛糞堆肥菌群在物種種類和物種豐度的均一性上均高于其他組別，牛糞堆肥菌群是來自于厭氧牛體內(nèi)環(huán)境和體外環(huán)境的混合菌群，這可能是造成上述現(xiàn)象的一個原因。森林土壤組內(nèi)樣本的alpha多樣性指數(shù)之間差異較大，可能與其復雜多變的環(huán)境和采樣的時間地點有關(guān)，菌群多樣性高可能更有利于應對復雜多變環(huán)境，比如對溫差、濕度等的適應性。此外，物種豐度分析顯示森林土壤中屬的數(shù)量高于牛糞堆肥，可能是由森林土壤組內(nèi)樣本差異大造成。PCoA分析結(jié)果充分說明了樣本分組的可靠性，同時表明來源于不同環(huán)境的菌群之間的群落多樣性存在較大差異。

本研究檢測到Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes和Actinobacteria 4個來自纖維素降解菌群的優(yōu)勢門，這與先前的許多報道一致[31-34]。Firmicutes存在大量纖維素降解菌[35]，可能是牛瘤胃和牛糞堆肥菌群中降解纖維素的主要門。Bacteroidetes對多糖等碳水化合物具有較好的降解能力[36]，在4個菌群中均大量存在，是家犬腸道中的生物標志物。有研究表明，Actinobacteria是降解木質(zhì)素與纖維素的主要功能菌門[2，37]。在土壤有機層中豐度最高的門為Proteobacteria和Bacteroidetes，而Firmicutes則更多的存在于礦物土壤中[38]，這與本研究結(jié)果一致，說明Proteobacteria是森林土壤中纖維素降解重要門。此外，Euryarchaeota常被發(fā)現(xiàn)于牛瘤胃中，然而很少有證據(jù)證明其纖維素降解能力，盡管Sorokin等[39]首次鹽古菌（Haloarchaea）具備降解幾丁質(zhì)和纖維素的能力，然而本研究中并未檢出鹽古菌。

LEfSe分析可幫助研究者發(fā)現(xiàn)生物標志物，但也存在靈敏度不足的情況導致一些特異性的功能性細菌漏檢，因此對LEfSe分析結(jié)果和環(huán)境特異性屬進行整合可作為一種優(yōu)化的方法鑒定環(huán)境特異性纖維素降解菌。家犬糞便以Fusobacterium、Bacteroides和Faecalibacterium為生物標志物，其特有優(yōu)勢菌屬為Prevotella-9和Lactobacillus，均為雜食性哺乳動物腸道常見菌株[40]。牛瘤胃的生物標志物包括Lachnospiraceae、Euryarchaeota、SuccinivibrionaceaeUCG-001、Prevotella-7和Selenomonadales，除此之外其特有優(yōu)勢菌屬還包括Prevotella-1，Succiniclasticum和Methanobrevibacter。Clostridiales是瘤胃中纖維小體的主要生產(chǎn)者[41]。Lachnospiraceae屬于Clostridiales，是牛瘤胃中的優(yōu)勢菌，存在能夠降解纖維素的細菌，如丁酸弧菌屬（Butyrivibrio）和互養(yǎng)球菌屬（Syntrophococcus）等[42]。另外，Seshadri等[43]在410個瘤胃細菌和古細菌基因組中發(fā)現(xiàn)大量參與形成纖維素體的Clostridiales細菌。SuccinivibrionaceaeUCG-001是Aeromonadales中的最優(yōu)勢屬，Succinivibrionaceae可發(fā)酵淀粉等碳水化合物產(chǎn)生琥珀酸和醋酸鹽，有可能參與纖維素代謝中間產(chǎn)物的降解，但尚未發(fā)現(xiàn)文獻報道該科可降解纖維素。Prevotella是纖維素降解過程中的優(yōu)勢屬[44-46]，Prevotella的細菌（如P.ruminicola等）可直接生產(chǎn)纖維素酶，厭氧環(huán)境中可與其他纖維素降解菌協(xié)同降解纖維素[35，47]。Selenomonadales來自厭氧菌綱（Negativicutes）最優(yōu)勢的屬為月形單胞菌屬（Selenomonas），以降解淀粉為主[48]，但某些菌株（如S.ruminantium）具備纖維素降解功能[49]。Succiniclastium是典型的纖維降解菌，能發(fā)酵降解纖維素或纖維二糖產(chǎn)生琥珀酸、乙酸和二氧化碳等[50]。Methanobrevibacter是Euryarchaeota門的最優(yōu)勢屬，是一類產(chǎn)甲烷菌[51]。牛糞堆肥中的生物標志物為Actinobacteria和Bacillales。Bacillales中存在較多纖維素降解菌，比如常見的來源于堆肥或土壤纖維素降解菌Bacillus等[52]。Actinobacteria（綱）有著基因組GC含量高以及細胞壁厚的特點，能適應高溫、強堿等極端環(huán)境，其中很多細菌具有纖維素降解能力，如Actinanyces cellulose、諾卡氏菌屬（Nocardia）和鏈霉菌屬（Streptomyces）等[53-55]，因此Actinobacteria可能是牛糞堆肥中重要的纖維素降解菌。另外，牛糞堆肥中特有優(yōu)勢菌屬包括Halocella、Limnochordaceae-ge和Hydrogenispora，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的Halocella包括H.cellulosilytica和H.sp.SP3-1，可在高鹽環(huán)境下生存，均具備降解纖維素和纖維二糖的能力[56-57]。Hydrogenispora來自梭菌綱（Clostridia），與Clostridiumsp.6-31較為近緣，能夠發(fā)酵降解多種碳水化合物[58]，但尚無充分證據(jù)支持其纖維素降解能力。有關(guān)Limnochordaceae-ge屬的相關(guān)報道并不多，有待于進一步研究。森林土壤組的生物標志物包括Alphaproteobacteria、Pseudomonas、Flavobacteriaceae以及Burkholderiaceae。Pseudomonas屬于嚴格好氧型纖維素降解菌，可產(chǎn)生纖維素酶[59-60]，在牛糞堆肥中的豐度低于森林土壤，可能是森林土壤和牛糞堆肥的重要的纖維素降解菌。Flavobacteriaceae的優(yōu)勢屬為NS3amarine group和Flavobacterium，僅發(fā)現(xiàn)于森林土壤。Flavobacterium能夠降解復雜有機物質(zhì)如纖維素、半纖維素、幾丁質(zhì)等有機聚合物[61-63]。NS3amarine group常常在海洋藻類中與Flavobacterium一起被發(fā)現(xiàn)[64]，推測其可能具備纖維素降解功能。Alphaproteobacteria在森林土壤中被大量發(fā)現(xiàn)，最優(yōu)勢屬包括Brevundimonas、生絲單胞菌屬（Hyphomonas）和紫桿菌屬（Porphyrobacter）等，物種種類較為豐富，但各屬的相對豐度較低，但其中也存在纖維素降解菌，比如Rhodobacterales中Brevundimonas和Hyphomonas均具備降解纖維素能力，其中Brevundimonas可在低溫環(huán)境下產(chǎn)生纖維素酶[65-66]。森林土壤樣本中的Burkholderiaceae的諸多細菌具備降解纖維素的能力如伯克氏菌屬（Burkholderia）[67]。Pseudarcicella屬是2012年K?mpfer等[68]在醫(yī)用水蛭皮膚上發(fā)現(xiàn)的一個新屬，被歸屬于噬纖維菌科（Cytophagaceae），其中絕大多數(shù)物種均有纖維素降解功能[69]，故推測其具備纖維素降解功能。

4 結(jié)論

本研究對4組來自于不同環(huán)境的共102個環(huán)境微生物群落樣本數(shù)據(jù)進行了分析。Alpha多樣性顯示，牛糞堆肥中物種種類和豐度的alpha多樣性指數(shù)顯著高于其他兩種纖維素降解菌群?；诜羌訖?quán)和加權(quán)Unifrac距離的PCoA分析說明不同環(huán)境中的纖維素降解菌群的微生物多樣性差異較大。Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes和Actinobacteria是本研究在各類環(huán)境菌群間檢測到的最具優(yōu)勢的4個門，不同環(huán)境間在門水平就存在著顯著差異，表現(xiàn)出了特異性。各類環(huán)境菌群間在屬水平上差異極大，絕大多數(shù)屬表現(xiàn)出有和無的定性差異，進一步說明不同樣本的纖維素降解菌群多樣性的不同。LEfSe分析鑒定到了牛瘤胃、牛糞堆肥、森林土壤中的生物標志物分別有5、2和4個。最后，LEfSe結(jié)果、屬水平相對豐度信息以及先前的文獻報道的綜合分析和討論，鑒定到牛瘤胃、牛糞堆肥、森林土壤中同時具備環(huán)境特異性和纖維素降解功能的細菌分類單元分別有4，3和5個。本研究從宏觀層面即來自不同環(huán)境的纖維素降解菌群的多樣性和差異進行了分析，為進一步闡明天然細菌群落的纖維素降解的協(xié)同作用機理奠定了基礎(chǔ)，同時為構(gòu)建具備相應環(huán)境適應性的纖維素降解菌群以及篩選在生產(chǎn)生活中有應用價值的菌株提供了理論指導。