利用餌料微藻表達抗菌肽及其初步應(yīng)用

潘玉芳, 楊歡, 陳怡雯, 韓冬, 胡晗華

利用餌料微藻表達抗菌肽及其初步應(yīng)用

潘玉芳, 楊歡, 陳怡雯, 韓冬*, 胡晗華*

(中國科學院水生生物研究所，武漢 430072)

為了解抗菌肽在餌料微藻中表達后的抗菌特性，構(gòu)建海洋微擬球藻()、湖泊微擬球藻()和三角褐指藻()的抗菌肽(源自虹鱒，)表達質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)化相應(yīng)的微藻，檢測轉(zhuǎn)化子中抗菌肽的表達量和體外抑菌效果，將藻株作為魚飼料添加劑喂食斑馬魚，初步分析了抗菌肽及藻體自身的巖藻黃素和多不飽和脂肪酸對魚免疫系統(tǒng)的影響。結(jié)果表明，外源抗菌肽在3種微藻中均可以成功表達，體外抑菌試驗表明，僅三角褐指藻對水產(chǎn)領(lǐng)域常見致病菌愛德華氏菌()有一定的抑菌效果，然而抗菌肽的表達并未使3種藻株的體外抑菌性增加。添加藻粉對斑馬魚的生長無明顯影響，通過檢測魚體肝臟中與抗氧化和免疫相關(guān)基因的表達水平及丙二醛的含量,表明添加藻粉可增強斑馬魚的抗氧化和抗炎癥能力，表達抗菌肽(PtC組)能進一步提高斑馬魚的免疫力。另外，添加Pt6 (富含巖藻黃素)藻粉組比添加PtC的抗炎效果更顯著，表明三角褐指藻中的巖藻黃素和二十碳五烯酸對增強魚的抗病能力具有潛在作用。

餌料微藻；抗菌肽；免疫；抗氧化；魚飼料

三角褐指藻()和微擬球藻()都是光合作用效率較高、生物量積累較快的單細胞真核微藻，富含多不飽和脂肪酸，三角褐指藻還富含巖藻黃素和金藻多糖，它們都是重要的經(jīng)濟型微藻[1–2]，也是野生環(huán)境和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的天然餌料。有研究報道，三角褐指藻可以作為魚粉替代品，對大西洋鮭魚的生長及飼料轉(zhuǎn)化起到積極作用[2]，微擬球藻屬是輪蟲培養(yǎng)中唯一一種在高密度培養(yǎng)條件下仍能持續(xù)不斷提供供給的微藻餌料，并且與酵母和人工飼料相比，它們能提供更好的營養(yǎng)組分[3]。三角褐指藻和海洋微擬球藻()的全基因組已公布[4–5]，成熟的遺傳轉(zhuǎn)化體系已建立[6–8]。微擬球藻屬中唯一的淡水種類湖泊微擬球藻()的基因組序列雖然尚未測定，其高效的電擊轉(zhuǎn)化遺傳體系在本實驗室也已經(jīng)建立[9]。3種微藻中都能成功地表達外源蛋白質(zhì),這為將它們改造為高效表達外源蛋白質(zhì)的生物反應(yīng)器打下了堅實的基礎(chǔ)。

抗菌肽(antimicrobial peptides, AMPs)是一種機體快速合成的具有防御功能的小分子蛋白質(zhì)，廣泛存在于植物、動物和微生物體內(nèi)[10]，對各種細菌、病毒、真菌和寄生蟲具有直接的抗菌活性[11]。抗菌肽不易導致耐藥菌的出現(xiàn)，是一種可行的抗生素替代品[12]?？咕倪€具有相當大的免疫功效，可調(diào)節(jié)動物機體的免疫力[13]，在醫(yī)藥、妝化、生物農(nóng)藥、動植物抗病基因工程、天然食品防腐劑、生物飼料添加劑等方面有著廣闊的產(chǎn)業(yè)化前景[14]。

目前，抗菌肽的獲得方式主要從生物體內(nèi)直接分離提純、化學合成、酶解和基因工程生產(chǎn)。其中基因工程法常用的抗菌肽表達宿主主要為大腸桿菌和酵母，占異源表達抗菌肽的97.4%[15]，但在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應(yīng)用并不多見。與原核表達系統(tǒng)和酵母表達系統(tǒng)相比，微藻表達系統(tǒng)同樣具備培養(yǎng)條件簡單，生長周期短，遺傳操作簡單且能穩(wěn)定遺傳的優(yōu)點，并且藻細胞安全無毒，既是蛋白質(zhì)含量豐富、營養(yǎng)配比合理的保健食品，又是許多水產(chǎn)生物的天然餌料，無需再將表達的抗菌肽分離純化，可以簡化生產(chǎn)流程。有研究報道以萊茵衣藻作為微藻表達系統(tǒng)表達抗菌肽[16]，然而，萊茵衣藻不含多不飽和脂肪酸，不屬于常用的水產(chǎn)餌料，相比于硅藻、微擬球藻和金藻等水產(chǎn)餌料藻，經(jīng)濟價值和成本效益略有不足。

本研究選用虹鱒來源的導管素家族抗菌肽基因1 (GenBank: KP347620.1)，去掉信號肽區(qū)域和Cathelin結(jié)構(gòu)域，僅保留成熟肽區(qū)域的71個氨基酸(Cathelicidins 1蛋白C端的71個氨基酸, 其中66個氨基酸是發(fā)揮抗菌效用的主體)命名為Cath-1a。將Cath-1a分別在海洋微擬球藻、湖泊微擬球藻和三角褐指藻中表達，選擇高效表達抗菌肽且具有體外抑菌活性的藻株進行擴大培養(yǎng)，作為魚飼料添加劑喂食斑馬魚，通過測定斑馬魚肝臟組織中抗氧化和免疫相關(guān)基因的表達水平及丙二醛(MDA)的含量，探討添加不同營養(yǎng)成分藻粉的斑馬魚飼料對斑馬魚免疫系統(tǒng)的影響，為商用藻種的篩選提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗藻株 試驗所用三角褐指藻(CCAP 1055/1和CCMP 631, 簡稱為Pt1和Pt6)由巴黎高師Chris Bowler教授饋贈。海洋微擬球藻(MBIC 10090)購自于日本生物資源中心(NITE Biological Resource Center, NBRC)。三角褐指藻和海洋微擬球藻的液體培養(yǎng)基為f/2加富(不含硅元素)的人工海水培養(yǎng)基, pH為7.6～7.8。固體培養(yǎng)基由液體培養(yǎng)基稀釋1倍后，加入1.2%的瓊脂配置而成。湖泊微擬球藻(KR 1998/3)由德國淡水生態(tài)和內(nèi)陸漁業(yè)研究所(Institute of Freshwater Ecology and Inland Fisheries, Neuglobsow) Lothar Krienitz教授提供，采用BG11培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基是由液體BG11培養(yǎng)基加1.2%瓊脂配制。22℃恒溫光照培養(yǎng)箱中連續(xù)光照培養(yǎng),光強約為120mol/(m2·s)。藻株的擴大培養(yǎng)在5 L玻璃瓶中進行，使用空氣泵充入經(jīng)無菌濾膜過濾的空氣培養(yǎng)6 d。

試驗菌株 大腸桿菌DH5(本實驗室保存)用于載體構(gòu)建，采用LB培養(yǎng)基于37℃振蕩(220 r/min)培養(yǎng)。無乳鏈球菌與愛德華氏菌由中國科學院水生生物研究所謝海峽研究員提供，無乳鏈球菌使用腦心浸液肉湯(BHI)培養(yǎng)基，愛德華氏菌使用胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基由液體培養(yǎng)基加入1.5%的瓊脂配置而成。

試驗斑馬魚 所用斑馬魚種魚源自中國科學院水生生物研究所斑馬魚資源中心AB系野生型,在中國科學院水生生物研究所魚類生理生態(tài)學學科組繁育。幼魚開口期的餌料為草履蟲()，孵化15 d后以豐年蟲()喂食，選取70日齡的同一批次雄魚作為試驗對象, 試驗開始前饑餓處理24 h。

1.2 蛋白原核表達和抗體制備

將Cath-1a原核表達質(zhì)粒pGEX-4T-1-Cath-1a(Cath-1a的N端融合了谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶[GST]標簽)通過熱激轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入BL21(DE3)感受態(tài)細胞中,挑取單菌落到含有氨芐抗性和氯霉素抗性的LB培養(yǎng)基中，經(jīng)菌液PCR鑒定正確的單克隆搖菌至OD600=0.6時，加1.0 mmol/L異丙基-1-硫代-d吡喃型半乳糖(IPTG)誘導表達(20℃, 6 h)。誘導后以13680×離心1 min，取菌沉淀，用1×PBS重懸后，加入等體積的2×SDS loading buffer加熱變性制樣，用12%分離膠濃度的SDS-PAGE進行電泳分析表達情況。取表達量高的菌株活化后擴大培養(yǎng)并誘導表達，送福因德科技(武漢)有限公司進行抗原純化, 制備并純化抗Cath-1a的多克隆抗體。

1.3 表達抗菌肽的轉(zhuǎn)基因藻株構(gòu)建

pPha-NoVCP載體利用海洋微擬球藻基因的啟動子(雙向啟動子)和基因的終止子實現(xiàn)外源基因的表達[9]。以質(zhì)粒pGEX-4T-1-Cath-1a為模板，用引物和進行PCR擴增得887 bp的GST+Cath-1a片段，接入pPha-NoVCP載體的I和酶切位點之間, 得到質(zhì)粒pPha-VCP-GST+Cath-1a。不帶標簽的Cath- 1a表達載體pPha-VCP-Cath-1a的構(gòu)建方法相同,基因的擴增引物為和，大小為216 bp。

根據(jù)三角褐指藻密碼子的偏好性將基因進行密碼子優(yōu)化，并在兩端加上His標簽的編碼序列，由天一輝遠生物科技有限公司合成，連到pPhaT1載體的I和dIII酶切位點之間，命名為pPha-His+Cath-1a。

將pPha-VCP-GST+Cath-1a和pPha-VCP-Cath- 1a質(zhì)粒分別用I和I線性化后轉(zhuǎn)入海洋微擬球藻和湖泊微擬球藻中，將pPha-His+Cath-1a質(zhì)粒經(jīng)I線性化后轉(zhuǎn)入三角褐指藻Pt1中，參照前人[6–7,9]的方法進行遺傳轉(zhuǎn)化。

采用CTAB法提取基因組DNA，以野生型受體為陰性對照，相應(yīng)的質(zhì)粒為陽性對照，表達帶GST標簽抗菌肽轉(zhuǎn)化子以和(在終止子上設(shè)計)為引物，表達不帶標簽抗菌肽的轉(zhuǎn)化子以和為引物，表達帶His標簽抗菌肽的轉(zhuǎn)化子以(在基因上游的pPhaT1載體骨架上設(shè)計)和(在終止子上設(shè)計)為引物，采用PCR方法檢測目的基因是否插入微藻基因組中。載體構(gòu)建和轉(zhuǎn)化子PCR檢測的引物見表1。

1.4 表達抗菌肽的轉(zhuǎn)基因藻株的Western blot篩選

隨機選擇PCR陽性的轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)至對數(shù)期, 4℃2800×離心10 min收集藻體，用預冷的1×PBS洗滌藻細胞1次后，加入適量的RIPA裂解液(碧云天)，裂解液在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑PMSF至終濃度為1 mmol/L。冰上超聲后離心提取藻株的總蛋白質(zhì)，用BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天)測定蛋白質(zhì)濃度，用1×PBS調(diào)整樣品濃度一致，以確保每個蛋白質(zhì)樣品的上樣量一致，蛋白質(zhì)樣品-20℃保存。變性后的蛋白質(zhì)經(jīng)12%分離膠濃度的SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，內(nèi)參抗體選用南京金斯瑞生物科技有限公司的抗-actin單克隆抗體，抗菌肽的免疫印跡檢測使用本研究制備的抗Cath-1a的多克隆抗體，用Millipore公司的ECL發(fā)光液對結(jié)果進行顯影。

1.5 體外抑菌效果評估

菌種于28℃液體培養(yǎng)基中搖床(200 r/min)培養(yǎng)過夜，使用無菌水稀釋菌液，將愛德華氏菌稀釋至1×106CFU，無乳鏈球菌稀釋至1×109CFU，將200L稀釋后的菌液均勻涂布于固體培養(yǎng)基平板上, 貼上6 mm滅菌后的濾紙片，紙片上滴加10L待檢藻蛋白質(zhì)提取液(1×PBS超聲提取)，以原核表達蛋白質(zhì)提取液和1×PBS為對照，平板晾干后37℃培養(yǎng)箱過夜。

下劃線表示酶切位點。

Underline indicates the restriction site.

1.6 藻粉成分測定

分別稱取50 mg干藻粉進行總蛋白質(zhì)、總糖和總脂肪的測定。蛋白質(zhì)提取使用RIPA細胞裂解液超聲法裂解細胞，蛋白質(zhì)濃度測定使用BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒；參照總糖含量試劑盒說明書, 使用水解法提取總糖，硝基水楊酸法測定藻粉總糖含量；使用氯仿-異丙醇法提取藻粉內(nèi)油脂成分，以重鉻酸鉀氧化法測定脂肪含量。

采用氯仿-甲醇法提取藻粉總油脂，將提取的總油脂甲酯化后用正己烷萃取，制備氣相色譜樣品, 送至中國農(nóng)業(yè)科學院油料作物研究所用氣相色譜測定脂肪酸組成[17]。

參照Jeffrey等[18]的方法提取藻粉中的色素，用分光光度計分別測定OD630、OD480、OD664和OD750值，計算葉綠素a (Chl a)、葉綠素c (Chl c)和類胡蘿卜素(Car)的含量。Chl a=11.47×OD664–0.4×OD630；Chl c=24.36×OD630–3.73×OD664；Car=10×(OD480–3× OD750)。

參照Yuan等[19]的方法，稱取50 mg凍干藻粉提取藻粉中色素，使用高效液相色譜法測定巖藻黃素含量。

1.7 斑馬魚飼料制備和喂養(yǎng)

將白魚粉、維生素預混物、礦物鹽預混物、微晶纖維素、凍干藻粉分別用粉碎機打磨成粉后過篩，充分混合后膨化并烘烤干燥，粉碎過篩，篩出顆粒直徑為180～250和250～380m的飼料備用。

選擇體型大小相近的120條斑馬魚分缸后稱取質(zhì)量, 分成4組，對照組投喂未添加藻粉的飼料，3個試驗組投喂的飼料分別添加1.5%的Pt1、Pt6、PtC (表達抗菌肽的Pt1轉(zhuǎn)化子)藻粉。每組喂養(yǎng)15條魚, 設(shè)置2個生物學重復，稱量每組初始體重(濕重)后養(yǎng)殖于10 L容積塑料水缸，喂養(yǎng)24 d。受試斑馬魚第一周喂食180～250m直徑的飼料，每日喂食量為魚初始體重的5%～6%，第二周起喂食250～380m直徑的飼料，每日喂食量為魚初始體重的10%～12%。

1.8 斑馬魚組織取樣和基因表達分析

對喂養(yǎng)23 d的斑馬魚進行饑餓處理24 h并稱重，然后放入加冰的1×PBS溶液中麻醉，快速取出肝臟組織放置在無RNA酶的EP管中，液氮速凍保存于?80℃。用Trizol試劑法提取斑馬魚的肝臟總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以基因做內(nèi)參，分析抗氧化和免疫相關(guān)的基因相對mRNA水平，采用2?△△CT法進行相對定量計算。

1.9 斑馬魚肝臟丙二醛(MDA )含量的測定

斑馬魚肝臟樣品加入250L PBS溶液和適量石英砂，高通量研磨儀勻漿后取上清，使用BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒測定樣品蛋白質(zhì)濃度，使用MDA測定試劑盒以硫代巴比妥酸法(TBA)測定樣品MDA含量，最終結(jié)果以mmol/mg protein表示。

2 結(jié)果和分析

2.1 陽性轉(zhuǎn)化藻株的篩選

藻株進行遺傳轉(zhuǎn)化后，隨機挑選24個轉(zhuǎn)化子置于含有博來霉素的48孔板中培養(yǎng)10 d，微擬球藻隨機挑取6株轉(zhuǎn)化子、三角褐指藻隨機挑取17株轉(zhuǎn)化子提取基因組DNA，用相應(yīng)引物進行PCR鑒定，擴增基因和轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒骨架上的部分序列。野生型基因組為模板均未擴增出條帶，全部微擬球藻轉(zhuǎn)化子(GC1-12和C1-C12) DNA和大部分三角褐指藻轉(zhuǎn)化子(除P15之外) DNA都擴增得到與質(zhì)粒對照模板(PL1-3)相當?shù)臈l帶(圖1: A)，初步表明外源基因已整合進入3種微藻的基因組中。

2.2 抗菌肽的表達

將含pGEX-4T-1-Cath-1a和pGEX-4T-1質(zhì)粒的表達宿主菌經(jīng)1.0 mmol/L IPTG于20 ℃誘導6 h后，同時以未誘導的pGEX-4T-1-Cath-1a菌株作參照, 進行SDS-PAGE電泳(圖1: B)。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化GEX- 4T-1-Cath-1a的宿主菌在33 kD附近有明顯的誘導帶，而轉(zhuǎn)化空載pGEX-4T-1質(zhì)粒的菌體主蛋白條帶在26 kD附近(GST標簽約26 kD)，說明帶有GST標簽的Cath-1a在宿主菌中得到了表達。純化原核表達的抗菌肽，免疫兔子并對抗血清進行親和純化和去GST純化，得到抗Cath-1a的多克隆抗體(福因德公司制備)。取誘導表達抗菌肽的菌體裂解液上清，制樣后梯度上樣，用12% SDS-PAGE分離總蛋白質(zhì)，以純化的抗Cath-1a的多克隆抗體為一抗, 顯影可見33 kD位置有明顯條帶，且隨上樣量的減少，目標條帶也相應(yīng)減弱，說明所制備的一抗有效(圖1: C)。

圖1 轉(zhuǎn)基因藻株篩選和Cath-1a蛋白質(zhì)的表達。A: 轉(zhuǎn)基因藻株Cath-1a基因的PCR檢測, M: Marker DL 2000; B: Cath-1a的原核表達, M: 分子量標記, 1: 經(jīng)IPTG誘導的pGEX-4T-1菌株總蛋白質(zhì); 2: 未誘導的pGEX-4T-1-Cath-1a菌株總蛋白質(zhì); 3: 經(jīng)IPTG誘導的pGEX-4T-1-Cath-1a菌株總蛋白質(zhì); C: 免疫印跡評估抗Cath-1a的多克隆抗體，1～4為梯度稀釋的表達Cath-1a的菌體裂解液上清；D: 免疫印跡檢測藻株中Cath-1a蛋白質(zhì)的表達, Cath-1a: 抗Cath-1a的多克隆抗體; β-actin: 抗β-actin的內(nèi)參單克隆抗體。NOH: 野生型海洋微擬球藻; KR98: 野生型湖泊微擬球藻; Pt1: 野生型三角褐指藻; PL1～ PL3: 質(zhì)粒; GC1～GC6, C1～C6: 海洋微擬球藻轉(zhuǎn)化子; GC7～GC12, C7～C12: 湖泊微擬球藻轉(zhuǎn)化子; P1～P17: 三角褐指藻轉(zhuǎn)化子。

為檢測抗菌肽在微藻轉(zhuǎn)化子中的表達情況，我們首先從轉(zhuǎn)入了帶有GST標簽的Cath-1a轉(zhuǎn)化子中隨機挑選2個藻株進行蛋白質(zhì)印記試驗。野生型海洋微擬球藻(NOH)和湖泊微擬球藻(KR98)樣品中均未檢測到目標條帶，在海洋微擬球藻轉(zhuǎn)化子(GC1和GC2)和湖泊微擬球藻轉(zhuǎn)化子(GC7和GC8)中均檢測到抗菌肽Cath-1a融合GST標簽蛋白質(zhì)的表達(圖1: D)。

GST標簽蛋白的大小為26 kD，遠大于預測的Cath-1a蛋白大小(7.25 kD)，用GST融合蛋白質(zhì)表達便于免疫印跡檢測，但可能會對抗菌肽的活性有影響，因此我們進一步分析了不帶標簽或帶His標簽(2個6×His)的轉(zhuǎn)化子中Cath-1a蛋白的表達情況，篩選表達抗菌肽的藻株用于下一步試驗。3個野生型藻株(NOH、KR98和Pt1)中都沒有檢測到Cath-1a蛋白的表達，而所有轉(zhuǎn)化藻株中均檢測到抗菌肽Cath-1a的表達(圖1: D)。海洋微擬球藻轉(zhuǎn)化株C3、C5，湖泊微擬球藻轉(zhuǎn)化株C7、C12和三角褐指藻轉(zhuǎn)化株P(guān)1-3的抗菌肽表達量較高，將這些轉(zhuǎn)化子用于下一步的抑菌效果評估。

2.3 抑菌效果檢測

采用紙片抑菌圈法對3種野生型微藻和表達抗菌肽的轉(zhuǎn)化子進行抑菌效果評估，受試菌為水生動物常見致病菌——革蘭氏陽性細菌無乳鏈球菌和革蘭氏陰性細菌愛德華氏菌。結(jié)果表明，在無乳鏈球菌抑菌試驗中，所有藻株的蛋白質(zhì)提取液均無抑菌圈出現(xiàn)(圖2: A～C)，表明它們對無乳鏈球菌均無抑菌效果。在愛德華氏菌抑菌試驗中，微擬球藻及其轉(zhuǎn)化子的蛋白質(zhì)提取液也沒有明顯的抑菌圈(圖2: D, E)，但滴加了野生型三角褐指藻(WT)和3株表達抗菌肽Cath-1a的三角褐指藻轉(zhuǎn)化子(P1～ P3)的蛋白質(zhì)提取液的紙片邊緣都出現(xiàn)了清晰抑菌圈(圖2: F)，而對照組未出現(xiàn)抑菌圈，各藻株抑菌圈大小無明顯差異，表明三角褐指藻及轉(zhuǎn)化子對愛德華氏菌均有抑菌效果，但表達抗菌肽似乎并未增強抑菌效果。

圖2 蛋白質(zhì)提取液的抑菌圈試驗。A, B, C: 涂布無乳鏈球菌的平板; D, E, F: 涂布愛德華氏菌的平板; N: 野生型海洋微擬球藻; C3, C5: 海洋微擬球藻轉(zhuǎn)化子; K: 野生型湖泊微擬球藻; C7, C12: 湖泊微擬球藻轉(zhuǎn)化子; +: 滴加原核表達Cath-1a蛋白質(zhì)提取液的對照; ?: 1×PBS溶液對照; WT: 野生型三角褐指藻; P1～P3: 三角褐指藻轉(zhuǎn)化子。

2.4 藻粉成分測定

我們的前期研究表明不同地域的野生型三角褐指藻Pt6比Pt1有更高的巖藻黃素含量，本研究選擇2株野生型三角褐指藻(Pt1和Pt6)和表達抗菌肽的Pt1轉(zhuǎn)化子(圖1中的P2，為表述方便以下命名為PtC)進行擴大培養(yǎng)，首先測定3種藻粉的蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂肪含量(表2)。轉(zhuǎn)化子PtC的蛋白質(zhì)和脂肪含量略高于2種野生型，碳水化合物含量略低于2種野生型，Pt6的碳水化合物略高于Pt1，蛋白質(zhì)和脂肪含量無差異。

表2 藻粉營養(yǎng)成分含量(% DW)

同行數(shù)據(jù)后不同字母表示差異顯著(<0.05)。

Data followed different letters at the same line indicate significant differences at 0.05 level by One-Way ANOVA.

從圖3: A, B可見，雖然3種藻粉的脂肪酸含量占總脂的比例略有不同，但組成上均以肉豆蔻酸(C14:0)、棕櫚酸(C16:0)、棕櫚油酸(C16:1)和二十碳五烯酸(EPA, C20:5)為主，占總脂肪酸的90%以上。Pt6藻粉中EPA占總脂的摩爾百分比雖然低于Pt1和PtC，但由于其脂肪酸總量遠高于Pt1和PtC (分別高56.5%和55.8%)，所以EPA含量也顯著高于Pt1和PtC，說明Pt6更具營養(yǎng)效益。

3種藻粉的色素組成均以Chl a為主，占總色素含量的50%以上(圖3: C)。Pt6的總色素含量顯著高于Pt1和PtC，其中Chl a含量比Pt1和PtC分別高47%和38%，類胡蘿卜素含量比Pt1和PtC分別高83%和38%，Chl c含量在3種藻粉中無顯著差異。此外，Pt6的巖藻黃素含量也顯著高于Pt1和PtC (圖3: D)。

2.5 飼料中添加藻粉對斑馬魚的影響

分別稱量斑馬魚養(yǎng)殖前后的體重，計算體重增長率(表3), 經(jīng)單因素ANOVA分析，表明4種飼料喂養(yǎng)的斑馬魚體重增長無顯著差異。

RT-qPCR分析斑馬魚肝臟中與抗氧化和免疫相關(guān)基因(引物見表1)的表達情況，結(jié)果表明(圖4: A)，與空白飼料組相比，添加藻粉影響了斑馬魚抗氧化和免疫相關(guān)基因的表達水平，其中，超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、免疫球蛋白D (IgD)、M (IgM)和溶菌酶(Lyz)的編碼基因表達水平相對增加，toll樣受體1、2、4和22 (TLR1、TLR2、TLR4和TLR22)、髓樣分化因子88 (MyD88)、腫瘤壞死因子(TNF)、白細胞介素1、6和8 (IL1β、IL6、IL8)的編碼基因表達水平相對減少。添加藻粉組的MDA含量均低于空白飼料組，Pt6和PtC的MDA含量低于Pt1，Pt6和PtC間無顯著差異(圖4: B)。

表3 飼料中添加藻粉對斑馬魚生長的影響

3 結(jié)論和討論

3.1 餌料微藻中表達抗菌肽

三角褐指藻和微擬球藻具有較高的光合作用效率和生物量，并富含多不飽和脂肪酸，特別是EPA，可作為生物反應(yīng)器工業(yè)化生產(chǎn)各行業(yè)所需要的高附加值原料，也能作為魚類幼體和輪蟲的餌料，甚至可能成為人類的食品[20–22]。有報道在單細胞真核藻類中表達抗菌肽多使用萊茵衣藻[16]，然而衣藻不是水產(chǎn)餌料微藻，藻種本身的營養(yǎng)價值不如金藻、硅藻、微擬球藻等餌料藻類。為提高外源蛋白質(zhì)的表達量，可以通過優(yōu)化外源基因的密碼子,以符合宿主的密碼子偏好。由于湖泊微擬球藻的基因組序列尚未測定，對海洋微擬球藻密碼子偏好性分析表明，虹鱒來源的基因并不存在特殊偏好，因此本研究只對三角褐指藻抗菌肽表達質(zhì)粒的抗菌肽基因序列進行了密碼子優(yōu)化。使用融合表達載體表達抗菌肽Cath-1a，有利于降低抗菌肽對宿主細胞的毒性，提高表達量，簡化純化過程[23]。本研究分別將帶有GST標簽、His標簽和未帶任何標簽的抗菌肽基因經(jīng)過電轉(zhuǎn)化方法導入藻細胞，在DNA和蛋白質(zhì)水平均檢測到的成功插入與表達。

圖3 藻粉的脂肪酸組成和色素含量。A: 脂肪酸組成; B: 脂肪酸含量; C: 色素含量; D: 巖藻黃素含量。柱上不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同

圖4 斑馬魚免疫相關(guān)基因的表達(A)和肝臟的MDA含量(B)

3.2 餌料微藻中表達抗菌肽的體外抑菌效果

對微藻表達的抗菌肽進行抑菌效果評價，已往研究是提取藻株總蛋白質(zhì)后親和純化或超濾濃縮純化，再使用抑菌圈法或比濁法驗證[16,24]。本研究探討使用藻株飼喂水產(chǎn)動物的應(yīng)用價值，不考慮提取純化抗菌肽，直接使用轉(zhuǎn)化藻株蛋白質(zhì)提取液進行抑菌效果評價。

抗菌肽具有廣譜抗菌性，不僅對細菌有效，對真菌和寄生蟲均有抑制或殺死作用。天蠶素對多種革蘭氏陽性和陰性菌具有抑制作用，且能抑制艾滋病病毒基因表達，從而減少艾滋病病毒的增殖[25]。防御素和導管素可以在體外殺死細菌、真菌和具膜結(jié)構(gòu)的病毒[26]；部分抗菌肽可以殺死草履蟲和變形蟲等原生動物[27]；某種牛的抗菌肽可以激活細胞凋亡，清除炎癥部位的有害細胞，達到抗腫瘤的目的[28]。動物體內(nèi)的抗菌肽還可在體內(nèi)引發(fā)體液和細胞免疫反應(yīng)，調(diào)節(jié)動物機體的免疫力[13]。本研究在3種微藻中表達的抗菌肽都沒有顯著的體外抑菌效果，可能是因為Cath-1a體外的抗菌性能不顯著，也可能是Cath-1a有更廣譜的抑菌和增強動物免疫力的功效，需要在動物機體內(nèi)的才會顯現(xiàn)出作用，還可能與微藻中抗菌肽的表達量不高有關(guān)，后續(xù)的研究可以嘗試將抗菌肽在藻細胞葉綠體中進行表達，進一步提高其表達量。

3.3 飼料中添加藻粉對斑馬魚抗氧化能力和免疫力的影響

三角褐指藻是水產(chǎn)動物的天然餌料，其富含的巖藻黃素具有抗氧化、抗炎等多種效用，本研究在魚飼料中添加了野生型三角褐指藻Pt1和Pt6 (巖藻黃素含量較高)、表達抗菌肽的PtC藻粉，結(jié)果表明飼料中添加藻粉對斑馬魚的體質(zhì)量無影響。相似的，S?rensen等[2]報道，成年斑馬魚在喂養(yǎng)添加三角褐指藻藻粉的飼料21 d后，體重也無變化。這可能與實驗魚的年齡、喂養(yǎng)時間、藻粉的添加量有關(guān)。

SOD是抗氧化防御系統(tǒng)的第一道防線，催化超氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)生成過氧化氫，隨后過氧化氫在CAT的催化下生成水和氧分子。所以SOD和CAT具有清除細胞內(nèi)活性氧，保護魚體免受氧化損傷的作用[29]。此外，MDA含量也常用于反映機體的抗氧化能力，用以評價生物體內(nèi)脂質(zhì)的過氧化水平[30]。本研究中，相比于空白飼料組，3個添加藻粉組的和/或表達水平有增加趨勢，并且添加藻粉組的MDA含量均低于空白飼料組，說明添加藻粉組斑馬魚受到的氧化損傷低于空白飼料組，具有較強的抗氧化能力，添加不同藻粉組的MDA含量無明顯差異。由此推測，三角褐指藻藻粉可能改變抗氧化酶的基因表達，減少氧自由基對機體的破壞。

通常而言，硬骨魚類依賴非特異性免疫執(zhí)行免疫應(yīng)答，對抗病原體感染[31]。免疫球蛋白和溶菌酶是魚類體液免疫(非特異性免疫的第二道防線)的重要組成部分[32]。IgD和IgM均由B淋巴細胞分泌，IgD可以通過與多種病原體結(jié)合，阻止病原體進入器官從而發(fā)揮免疫作用，IgM可通過調(diào)節(jié)炎癥細胞因子的產(chǎn)生來抵抗細菌感染[33–34]。溶菌酶在魚體內(nèi)發(fā)揮的溶菌作用，可以保護魚類，抵抗病原微生物的入侵[35]。因此，這三者的表達水平可以反映魚體的免疫水平。本研究中，添加藻粉組的、和的表達水平比對照組均有所增加，可能說明添加食用藻粉的飼料提高了斑馬魚的免疫力。

免疫細胞介導的非特異免疫是通過細胞表面或細胞質(zhì)內(nèi)的模式識別受體識別病原相關(guān)的分子模式，然后激活一系列抗微生物信號通路來實現(xiàn)的。toll樣受體(TLRs)主要存在于脊椎動物的免疫細胞中，通過識別微生物產(chǎn)物從而誘導激活免疫反應(yīng)[36]。TLRs均可通過髓MyD88依賴型信號通路轉(zhuǎn)導信號，傳遞活化信號至下游，誘導促炎基因的表達[37]。有研究表明，某些活性成分可以降低大鼠腸道中的和表達，影響MyD88信號通路，減少促炎性因子的釋放，進而推斷這些成分具有治療效果[38–39]。TNF是一種促進腫瘤細胞壞死的蛋白質(zhì)，可以調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答，協(xié)助機體抵抗細菌和病毒感染[40]。IL1是一種促炎因子,能誘導趨化因子、粘附分子等的合成，IL6和IL8既是一種細胞趨化因子，也是促炎因子，能誘導IL1和TNF生成，均可作為炎癥監(jiān)測指標預測魚體炎癥性疾病[41]。本研究中，添加藻粉組的、、、、、、、和表達量比對照組均降低，總體上Pt6組的基因表達水平比Pt1和PtC組低，PtC組的基因表達水平比Pt1組略微下降。據(jù)此推測，本研究的3種藻粉可能具有提高斑馬魚機體免疫的功能和增強斑馬魚抗病能力的效果，且Pt6和PtC藻粉的效果比Pt1藻粉好，表明三角褐指藻中表達抗菌肽能進一步提高斑馬魚的免疫力。EPA和巖藻黃素在抗炎和免疫調(diào)節(jié)方面有重要作用[42–43]，野生型三角褐指藻株P(guān)t6中有更高的EPA和巖藻黃素含量，結(jié)合基因表達情況分析，推測EPA和巖藻黃素在增強斑馬魚的抗病力方面也有重要作用。

綜上所述，本研究利用湖泊微擬球藻、海洋微擬球藻和三角褐指藻3種餌料微藻為宿主，均可成功表達外源抗菌肽，并且三角褐指藻蛋白提取液表現(xiàn)出一定的體外抑菌性，初步揭示了餌料微藻三角褐指藻能增強斑馬魚的抗氧化和抗炎癥能力，三角褐指藻中表達抗菌肽能進一步提高斑馬魚機體免疫力。本研究為餌料微藻高效表達抗菌肽提供了有力支撐，也為餌料微藻表達抗菌肽在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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Expression of Antimicrobial Pepetides in Microalgae for Aquaculture and Its Preliminary Application

PAN Yufang, YANG Huan, CHEN Yiwen, HAN Dong*, HU Hanhua*

(Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences,Wuhan 430072, China)

To understand the roles of antimicrobial peptides expressed in microalgae for aquaculture, expression vectors containing(from rainbow trout) gene were constructed and introduced to,and, respectively.Randomly selected transformants were confirmed by PCR and Western Blot. Positive clones were used for thebacteriostatic experiments, and some lines were used as additives to feed zebrafish in order to test the effect of different nutrients on the immune system of fish. The results showed that all the three algal strains had successfully expressed exogenous antimicrobial peptides. Onlyshowed a bacteriostatic effect on, a common pathogenic bacterium in aquaculture, and there was no significant difference in the bacteriostatic effect between the wild-type and transformants of the three species of microalgae. The growth of zebrafish fed with algae as additives had no significant difference compared with the control (without additives). The expression levels of antioxidant and immune related genes together with the content of malondialdehyde (MDA) in the liver of zebrafish indicated that zebrafish fed with additives showed stronger antioxidant and anti-inflammatory ability than the control, and expression of antimicrobial peptides (PtC, a wild-typestrain Pt1 transformant expressinggene) could further enhance the immunity of zebrafish. In addition, the anti-inflammatory capacity of the group with Pt6 (a wild-typestrain with high fucoxanthin content) additives is more significant than that of the group with PtC additives, which indicated that fucoxanthin and eicosapentaenoic acid (EPA) inmight enhance disease resistance of zebrafish.

Microalgae for aquaculture; Antimicrobial peptide; Immunity; Antioxidation; Fish meal

10.11926/jtsb.4634

2022-03-07

2022-05-10

中國科學院水生生物研究所特色研究所服務(wù)項目(Y85Z061601)；中國科學院國際伙伴計劃項目(152342KYSB20200031)；國家重點研發(fā)計劃項目(2018YFD0901500)資助

This work was supported by the Featured Institute Service Projects of Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences (Grant No. Y85Z061601), the International Partnership Program of Chinese Academy of Sciences (Grant No. 152342KYSB20200031), and the National Key Research & Development Program of China (Grant No. 2018YFD0901500).

潘玉芳(1987年生)，女，博士，實驗師，主要從事藻類分子生物學研究。E-mail: panyufang@ihb.ac.cn

. E-mail: hand21cn@ihb.ac.cn; hanhuahu@ihb.ac.cn