油茶DELLA基因的克隆和表達(dá)分析

諶琦, 駱夢琳, 李佳玲, 周會汶, 張立莎, 劉亞男, 吳楊, 朱智國

油茶基因的克隆和表達(dá)分析

諶琦, 駱夢琳, 李佳玲, 周會汶, 張立莎, 劉亞男, 吳楊, 朱智國*

(九江學(xué)院藥學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院, 江西油茶研究中心, 江西 九江 332000)

為了解油茶()中基因功能及其表達(dá)特性，采用PCR技術(shù)從‘長林4號’油茶中克隆了5個基因，命名為～，對其編碼的5個CoDELLA蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并對5個基因的表達(dá)模式以及激素響應(yīng)活性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，5個基因的編碼區(qū)長度分別為1 791、1 875、1 848、1 593和1 581 bp,分別編碼597、625、616、531和527個氨基酸。5個CoDELLA蛋白的氨基酸序列相似度較高，絲氨酸殘基為主要的潛在磷酸化位點，CoDELLA蛋白N端均含有典型的DELLA結(jié)構(gòu)域。不同物種中DELLA蛋白的系統(tǒng)發(fā)育存在差異，CoDELLA與茶樹的CsDELLA同源性最高?；蛟谟筒璨煌M織中的表達(dá)也存在差異，且赤霉素和獨腳金內(nèi)酯等多種激素和非生物脅迫對其表達(dá)具有調(diào)控作用?；蚩赡茉谟筒璧纳L發(fā)育和非生物脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

油茶；DELLA；基因；生物信息學(xué)；基因表達(dá)

油茶()是重要的木本油料樹種，茶籽中提取的茶油被譽(yù)為“東方橄欖油”，不飽和脂肪酸含量可高達(dá)90%，且富含維生素E，具有極高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟(jì)價值[1]。油茶植株生長發(fā)育、果實發(fā)育和種子萌發(fā)等生長發(fā)育過程，受植物體內(nèi)的生長素、赤霉素、脫落酸、細(xì)胞分裂素等多種植物激素的調(diào)控。近年來研究表明，作為一種重要植物激素，赤霉素在油茶等植物的花芽分化、枝條生長、種籽品質(zhì)與萌發(fā)等多方面都具有影響[2–6]。

赤霉素(gibberellic acid, GA)在種子萌發(fā)、花芽分化、側(cè)枝伸長和生長發(fā)育中具有重要作用，其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子調(diào)控過程相對明確；DELLA蛋白作為赤霉素信號傳導(dǎo)途徑的負(fù)調(diào)控因子，對赤霉素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮抑制作用[7–9]。DELLA蛋白不具有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，當(dāng)沒有活性GA刺激存在時，DELLA蛋白通過與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，抑制或激活轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合活性，從而抑制或激活靶基因表達(dá)，調(diào)控下游GA響應(yīng)基因的表達(dá)，阻遏植物的生長發(fā)育；而GA可通過激活GA受體GID1與DELLA蛋白結(jié)合形成GID1-GA-DELLA復(fù)合體，誘導(dǎo)DELLA蛋白的泛素化降解，從而達(dá)到去阻遏的效果[10]。DELLA蛋白屬于GRAS家族，也是GRAS家族研究最廣泛的亞群部落之一[11]，已在擬南芥()[12]、茶樹()[13]、番茄()[14]、水稻()[11]、大麥()[15]等許多植物中鑒定到，但對油茶中基因家族的分離鑒定和進(jìn)化分析還未見報道。DELLA蛋白不僅作為GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵調(diào)控因子，也是赤霉素與生長素、脫落酸、獨腳金內(nèi)酯等多個信號通路之間的相互作用節(jié)點[16]。

本研究通過同源克隆分離鑒定了油茶的5個基因，對其編碼的蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)、氨基酸序列比對及系統(tǒng)進(jìn)化等生物信息學(xué)分析，并對其表達(dá)模式、對植物激素和非生物脅迫的響應(yīng)活性進(jìn)行研究，為油茶DELLA蛋白的功能解析和DELLA介導(dǎo)的生長發(fā)育調(diào)控研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

本研究選取2 a生的‘長林4號’油茶()為材料，采集幼嫩葉片、花、莖、果實和芽，放于液氮中速凍，在-80 ℃冰箱保存，用于總RNA的提取。分別用50mol/L赤霉素(GA3)、獨腳金內(nèi)酯(SL)、玉米素(KT)、脫落酸(ABA)、茉莉酸(JA)和10mol/L 2,4-D進(jìn)行噴施，以0.01%乙醇水溶液噴施作為對照。非生物脅迫包括脫水干旱、300 mmol/L NaCl和4 ℃低溫處理, 分別于處理0、3、6、9、12、24 h后采集幼芽，置于液氮中速凍，在–80 ℃冰箱保存，用于熒光定量PCR分析。每處理3個重復(fù)。

1.2 總RNA提取與cDNA合成

樣品在研缽中液氮低溫研磨，按照植物RNA快速提取試劑盒說明書(RNA Easy Fast Plant Tissue Kit, 天根)提取RNA，然后用瓊脂糖凝膠電泳檢測，RNA提取質(zhì)量符合標(biāo)準(zhǔn)后，使用MLV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑(Promega)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，5倍稀釋后儲存于–20℃冰箱備用。

1.3 DELLA基因克隆

利用Phytozome網(wǎng)站(https://phytozome-next.jgi. doe.gov/)檢索擬南芥、番茄、水稻、茶樹中的基因數(shù)據(jù)，根據(jù)序列比對分析，選定基因克隆區(qū)域，利用Primer Premier 5軟件設(shè)計基因克隆引物(表1)。以油茶cDNA為模板，使用高保真DNA聚合酶(PrimeSTAR Max polymerase, TaKaRa)擴(kuò)增目的基因。PCR反應(yīng)體系和程序按照DNA聚合酶操作說明實施。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，轉(zhuǎn)移至pMD19-T載體，將陽性DH5菌株送至測序公司進(jìn)行Sanger測序。

1.4 生物信息學(xué)分析

利用在線軟件ProtParam (https://web.expasy.org/ protparam/)預(yù)測基因編碼區(qū)長度、蛋白的氨基酸序列長度、分子量、分子式、等電點、疏水指數(shù)和脂溶系數(shù)等；利用在線軟件NetPhos 3.1 Server (https:// services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1)對DELLA蛋白磷酸化位點進(jìn)行預(yù)測；在植物基因組網(wǎng)站Phytozome中獲取擬南芥、番茄、水稻及茶樹等物種的同源基因數(shù)據(jù)，使用DNAMAN軟件對DELLA家族成員的氨基酸序列進(jìn)行比對，利用在線工具M(jìn)EME (https://meme-suite.org/meme/tools/ meme)對DELLA的保守基序進(jìn)行預(yù)測。利用MEGA 7.0軟件對不同植物的DELLA構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；使用SWISS-MODEL在線軟件(https://swissmodel.expasy. org/)，以2ZSH.1.B蛋白模型為模板，采用同源建模方式進(jìn)行蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析。

1.5 基因表達(dá)分析

對克隆的油茶基因進(jìn)行核苷酸序列分析，利用Primer Premier 5軟件設(shè)計熒光定量PCR引物(表1)，引物參數(shù)為：PCR產(chǎn)物長度100～200 bp，引物退火溫度約為60 ℃。以和為內(nèi)參基因[17]，使用SYBR Green I嵌合熒光法(2×RealStar Fast SYBR qPCR Mix, GenSTAR)進(jìn)行熒光定量PCR檢測，分析基因在油茶不同組織中的相對表達(dá)量。實驗設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)和3個技術(shù)重復(fù)，采用2–△△CT計算相對表達(dá)量。

表1 所用引物

2 結(jié)果和分析

2.1 DELLA基因的克隆

將提取的油茶總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA, PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測，獲得5個克隆片段，長度均為1 500～2 000 bp，與其他物種中已知基因相似(圖1)。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化回收連接至克隆載體中，轉(zhuǎn)化DH5大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，菌落PCR篩選獲得陽性菌落，經(jīng)測序獲得油茶基因序列。所克隆的5個油茶基因分別命名為、、、和，其編碼區(qū)長度為1 581～1 875 bp。

圖1 油茶DELLA基因的PCR擴(kuò)增。M: Marker; 1～5: 5個CoDELLA基因。

2.2 DELLA蛋白的生物信息學(xué)分析

利用在線軟件ProtParam對油茶s基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行理化性質(zhì)預(yù)測，s基因分別編碼527～625個氨基酸，蛋白質(zhì)分子量為5.78～ 6.90 kD，等電點為5.24～5.52，脂溶系數(shù)為–0.314～ –0.091，疏水指數(shù)為75.83～91.10，均為親水性蛋白(表2)。

經(jīng)在線軟件NetPhos 3.1 Server預(yù)測，油茶CoDELLAs蛋白的磷酸化位點中以絲氨酸殘基最多，其次為蘇氨酸和酪氨酸殘基(圖2)。同時，磷酸化位點多分布于CoDELLAs蛋白的N端DELLA結(jié)構(gòu)域，CoDELLA1和CoDELLA2蛋白的磷酸化位點最為典型，在DELLA結(jié)構(gòu)域和GRAS結(jié)構(gòu)域之間(polyS/T/V)存在大量磷酸化位點(圖2)，表明CoDELLAs蛋白具有典型的DELLA蛋白磷酸化位點。

2.3 DELLA氨基酸序列比對

利用DNAMAN軟件對油茶的DELLAs、擬南芥的RGA、GAI、RGL1、RGL2和RGL3、番茄的GAI及水稻的SLR1進(jìn)行氨基酸序列比對，結(jié)果表明(圖3)，這些物種的DELLA蛋白均有典型的DELLA結(jié)構(gòu)域(DELLA基序、TVHYNP結(jié)構(gòu)域)、GRAS結(jié)構(gòu)域(VHVID基序、RVER基序、SAW基序)和核定位信號(NLS)。進(jìn)一步利用MEME軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)保守域分析，結(jié)果表明，這些物種DELLA氨基酸序列的保守基序存在差異，但均含有高度保守的特征性結(jié)構(gòu)域，DELLA蛋白特有的結(jié)構(gòu)域中, DELLA-LExLE基序(基序5)、TVHYNP基序(基序8)均存在(圖4: B～D)。此外，油茶DELLA蛋白的N端序列均具有典型DELLA結(jié)構(gòu)域(圖4: E～I(xiàn))。這說明，油茶的5個CoDELLA蛋白均具有保守的DELLA結(jié)構(gòu)域和GRAS結(jié)構(gòu)域，都屬于典型的DELLA蛋白，這些蛋白可能在功能上也具有高度保守性。

表2 油茶5個DELLA的基本信息

圖2 油茶CoDELLA1～CoDELLA5 (A～E)的磷酸化位點預(yù)測

圖3 不同物種中DELLA的氨基酸序列比對。Co: 油茶; At: 擬南芥; Le: 番茄; Os: 水稻; *: DELLA-LExLE和TVHYNP基序。

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用MEGA 7.0序列分析軟件，對油茶和茶樹的DELLA家族、擬南芥的DELLA家族(GAI、RGA、RGL1、RGL2和RGL3)、番茄的PRO、水稻的SLR1以及楊樹的DELLA1、DELLA2和DELLA3進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。從圖5可見，相較于擬南芥和水稻等物種，油茶的5個DELLA分別與茶樹的CsDELLA1～CsDELLA5具有較高同源性，這與油茶和茶樹同屬山茶科植物的分類是相符的，說明油茶的5個DELLA蛋白在進(jìn)化方面是相對較為保守的。油茶的CoDELLA1、CoDELLA2與擬南芥的AtGAI、AtRGA同源性較高，而CoDELLA3與番茄SlPRO的同源性較高，表明他們在功能上可能具有一定的相似性。

2.5 表達(dá)模式與激素響應(yīng)活性分析

基因在植物不同組織中的表達(dá)特征與其功能發(fā)揮的組織特異性緊密相關(guān)。采用實時熒光定量PCR對5個基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析。結(jié)果表明，油茶基因在不同組織中均有表達(dá)，且均以花中的表達(dá)水平較高(圖6: A)。和的表達(dá)模式相似，均以花中的表達(dá)較高。在莖和果實中的表達(dá)要低于葉片和花。和在果實中的表達(dá)水平均高于葉、莖和花。這表明可能在油茶不同組織對赤霉素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮調(diào)控作用。

用50/L赤霉素(GA3)處理油茶植株，取處理3、6、9、12、24 h后的幼芽進(jìn)行熒光定量PCR檢測，結(jié)果表明，與對照相比，GA3處理6 h的表達(dá)量提高；而和在6～9 h的表達(dá)量略微下降，但在處理12 h后表達(dá)量提高；與的表達(dá)量差異不大(圖6: B)。這說明不同對GA3的響應(yīng)時間存在差異。

圖4 油茶DELLA蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測。A: 不同物種的DELLA蛋白保守基序; B: 保守基序的氨基酸序列; C: DELLA基序的氨基酸分布特征; D: TVHYNP基序氨基酸分布特征; E～I(xiàn): CoDELLA1～CoDELLA5蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測。

圖5 基于DELLA氨基酸序列的不同物種系統(tǒng)進(jìn)化樹。Co: 油茶; Cs: 茶樹; At: 擬南芥; Le: 番茄; Os: 水稻; Pt: 楊樹。

圖6 油茶CoDELLAs基因的表達(dá)模式。A: 組織表達(dá)模式; B: 赤霉素; C: 獨腳金內(nèi)酯; D: 激素和非生物脅迫; *: P<0.05

和經(jīng)50/L外源獨腳金內(nèi)酯(SL)處理3、12和24 h后的表達(dá)量比對照提高，而處理6、9 h的表達(dá)量略有下降(圖6: C), 而和的表達(dá)量變化不大，推測獨腳金內(nèi)酯可能對赤霉素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活性有影響。

此外，植物在激素與脅迫響應(yīng)中存在大量信號交聯(lián)，為進(jìn)一步了解基因的潛在功能, 分別對激素和脅迫處理6 h的油茶幼芽中s的表達(dá)特性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明, 與對照相比, 激素和脅迫處理對表達(dá)的影響不同(圖6: D),和的表達(dá)均受ABA、JA和干旱脅迫的誘導(dǎo)，且的表達(dá)受2,4-D的誘導(dǎo)；、、的表達(dá)則受2,4-D、鹽脅迫等的抑制。這說明，油茶中不同的表達(dá)受多種激素和脅迫的調(diào)控,基因可能參與多種激素和脅迫調(diào)控的復(fù)雜生長發(fā)育過程。

3 結(jié)論和討論

在植物生長發(fā)育過程中，赤霉素通過抑制DELLA蛋白，激活大量下游響應(yīng)基因的表達(dá)，從而影響種子休眠與萌發(fā)、植株大小及脅迫響應(yīng)等生長發(fā)育過程[12,15,18–19]。赤霉素對油茶側(cè)枝發(fā)育、種子萌發(fā)、花芽分化及茶籽油脂代謝等方面都具有重要調(diào)控作用，但其調(diào)控作用的分子機(jī)制尚需深入研究[5,20–22]。本研究根據(jù)油茶全基因組序列，通過Primer Primer 5設(shè)計基因引物，采用PCR技術(shù)成功克隆了油茶的5個基因，通過對不同植物的DELLA氨基酸序列進(jìn)行比對，結(jié)果表明DELLA蛋白具有典型的DELLA結(jié)構(gòu)域和GRAS結(jié)構(gòu)域，且保守基序的位置相近。DELLA蛋白N端的DELLA結(jié)構(gòu)域，是其與赤霉素受體GID1蛋白結(jié)合互作的重要部位，具有調(diào)控細(xì)胞內(nèi)赤霉素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用[18,23]。將油茶、茶樹、擬南芥、番茄和楊樹的DELLA家族構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，可見油茶CoDELLAs與茶樹的CsDELLAs具有較高的同源性，且CoDELLA1、CoDELLA2、CoDELLA3與擬南芥和番茄的DELLA具有較高同源性，表明其在功能上可能也具有一定相似性。磷酸化等多種翻譯后修飾對蛋白穩(wěn)定性具有重要影響， DELLA蛋白的絲氨酸、蘇氨酸的磷酸化參與DELLA蛋白穩(wěn)定性調(diào)控，該磷酸化作用主要出現(xiàn)在DELLA蛋白的DELLA/TVHYNP基序,以及位于DELLA結(jié)構(gòu)域與GRAS結(jié)構(gòu)域之間的富含絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸(polyS/T/V)的調(diào)控位點[11,24–25]。CoDELLA的N端和polyS/T/V區(qū)域存在大量潛在的磷酸化位點, 表明這些CoDELLA均具有典型的蛋白穩(wěn)定性調(diào)控機(jī)制。

實時熒光定量PCR分析表明，在花、莖、葉、果實中均有表達(dá)。、和均在花中的表達(dá)量最高，和在果中的表達(dá)均高于葉、莖和花。已有研究表明，擬南芥的在所有組織中均有表達(dá)，的表達(dá)主要集中在花器官，而、和僅在萌發(fā)種子、花和果中表達(dá)量較高[19,26]。同時,花生()的和基因在花、種子中的表達(dá)量高于其他組織，暗示其在這些部位的功能特異性[27]，故推測可能在油茶赤霉素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮調(diào)控作用。

本研究表明，外源赤霉素處理油茶，的表達(dá)量在6 h、和在12 h提高，這與植物體內(nèi)赤霉素的反饋調(diào)節(jié)相符。同樣，獨腳金內(nèi)酯處理油茶，和在3、12和24 h的表達(dá)量提高, 而在6、9 h時略微下降。已有研究表明，DELLA蛋白介導(dǎo)的赤霉素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑通常與生長素、細(xì)胞分裂素等植物激素信號途徑存在信號交聯(lián)作用，其中獨腳金內(nèi)酯作為一種新發(fā)現(xiàn)的植物激素，與赤霉素信號途徑之間也存在潛在相互作用[28]，且其分子機(jī)制也比較相似[29],故推測獨腳金內(nèi)酯可能對赤霉素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的活性有一定影響。此外，油茶的表達(dá)也受生長素、細(xì)胞分裂素及鹽脅迫等不同途徑的調(diào)控，表明其可能在植物赤霉素信號抑制作用和赤霉素信號途徑與多種不同途徑之間的信號交聯(lián)作用發(fā)揮重要調(diào)控作用。

綜上，油茶中的5個DELLA蛋白均與茶樹等植物的DELLA同源性較高，且在花和果實中表達(dá)較高，說明該類蛋白的結(jié)構(gòu)保守性和在不同組織中作用的差異性。GA3和SL等激素及干旱等非生物脅迫下表達(dá)水平的差異說明功能的多樣性。

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Cloning and Expression Analysis ofGenes in

CHEN Qi, LUO Menglin, LI Jialing, ZHOU Huiwen, ZHANG Lisha, LIU Yanan, WU Yang, ZHU Zhiguo*

(College of Pharmacy and Life Sciences, Institute of Jiangxi Oil-tea Camellia, Jiujiang University,Jiujiang 332000, Jiangxi, China)

To reveal the function and expression pattern ofgenes in,fivegenes, namedand, were cloned from ‘Changlin 4’ by PCR technique. The bioimformation of 5 encoding CoDELLA were analyzed, as well as expression patterns of 5and hormone response activities. The results showed that the CDS length of fivegenes were 1 791, 1 875, 1 848, 1 593 and 1 581 bp, encoding 597, 625, 616, 531 and 527 amino acids, respectively. The amino acid sequences of the five CoDELLA proteins were highly similar, and serine residues were the main potential phosphorylation sites. The N-terminal of CoDELLA proteins all contained typical DELLA domains. There were differences in the phylogeny of DELLA proteins from different species, CoDELLA had the highest homology with CsDELLA in. The expression ofgene in different tissues was also different, which was regulated by various hormones and abiotic stresses such as gibberellin and aurolactone. Therefore, it was suggested thatgenes might play important role in the growth ofand response to abiotic stress.

;DELLA; Gene; Bioinformatic; Gene expression

10.11926/jtsb.4670

2022-05-12

2022-06-20

江西省教育廳科技項目(GJJ201803)；江西省自然科學(xué)基金項目(20202BABL215016)資助

This work was supported by the Project for Science and Technology of Department of Education in Jiangxi (Grant No. GJJ201803), and the Project for Natural Science in Jiangxi (Grant No. 20202BABL215016).

諶琦(2001年生)，碩士研究生，研究方向為林木遺傳育種。E-mail: chenqi_0928@163.com

. E-mail: zhuzhiguo_jju@163.com