延齡草皂苷對(duì)腦缺血大鼠梗死灶周圍皮層少突膠質(zhì)細(xì)胞GSK-3/β-catenin/CRMP2信號(hào)表達(dá)的影響

莊雨明，楊樂(lè)，歐陽(yáng)俊搖，鄒海艷，馮雪楓，陸允，李明聰，趙暉

首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，中醫(yī)絡(luò)病研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100069

缺血性卒中具有致殘率高的特點(diǎn)[1-2]。腦缺血缺氧后不僅誘導(dǎo)大量神經(jīng)元死亡，還損傷少突膠質(zhì)細(xì)胞，造成髓鞘脫失、軸突功能障礙，是肢體感覺(jué)運(yùn)動(dòng)和學(xué)習(xí)記憶障礙的重要原因[3-4]。促進(jìn)髓鞘修復(fù)和軸突重構(gòu)對(duì)改善腦缺血后神經(jīng)功能缺損癥狀具有重要意義[5]。延齡草為百合科延齡草屬多年生草本植物延齡草Trillium tschonoskiiMaxim.的干燥根及根莖，具有活血、通絡(luò)、安神功效。臨床以單味藥或配伍應(yīng)用治療眩暈頭痛、腦震蕩后遺癥等疾病[6]。延齡草主要活性成分為延齡草皂苷（total saponin ofTrillium tschonoskiiMaxim.，TSTT），前期研究結(jié)果顯示，TSTT可減輕腦缺血大鼠軸突髓鞘損傷[7]，并通過(guò)誘導(dǎo)內(nèi)源性少突膠質(zhì)前體細(xì)胞增殖分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞，啟動(dòng)再髓鞘化過(guò)程[8]，促進(jìn)軸突損傷后的修復(fù)。其分子機(jī)制尚待進(jìn)一步闡明。

研究發(fā)現(xiàn)，糖原合成酶激酶-3（GSK-3）是TSTT抗炎、抗腫瘤的重要作用靶點(diǎn)[9]。GSK-3是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，腦缺血發(fā)生后，GSK-3作為β-連環(huán)蛋白（β-catenin）、腦衰蛋白反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白-2（CRMP2）的負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白，抑制新生細(xì)胞增殖與軸突延伸[10]，在新生細(xì)胞增殖、分化、成熟過(guò)程中產(chǎn)生重要的調(diào)控作用[11-12]。在前期研究基礎(chǔ)上，本研究分析TSTT影響腦缺血大鼠少突膠質(zhì)前體細(xì)胞增殖及保護(hù)成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞的作用機(jī)制，為進(jìn)一步明確TSTT抗腦缺血損傷的藥理作用提供研究基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠65只，8周齡，體質(zhì)量330～360 g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2021-0011。動(dòng)物飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，溫度18～22 ℃，濕度40%～60%，自由攝食飲水。動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（京）2021-0030。本實(shí)驗(yàn)過(guò)程符合動(dòng)物倫理相關(guān)規(guī)定，并經(jīng)過(guò)首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（AEEI-2019-221）。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后正式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物與試劑

延齡草藥材購(gòu)自湖北恩施，由首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院李佳副教授鑒定為百合科延齡草屬植物延齡草Trillium tschonoskiiMaxim.的干燥根及根莖，存放于中醫(yī)絡(luò)病研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。TSTT由首都醫(yī)科大學(xué)中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究實(shí)驗(yàn)室提供，每克提取物相當(dāng)于原藥材16.55 g，經(jīng)課題組前期測(cè)定，重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷Ⅵ、偏諾皂苷元-3-O-α-L-鼠李糖基(1→4)-[O-α-L-鼠李糖基(1→2)]-O-β-D-葡萄糖苷、偏諾皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、重樓皂苷Ⅴ含量分別為43.96、98.83、75.27、4.98、4.57 mg/g[7]。使用時(shí)分別稱取TSTT 65、33 mg，用10 mL蒸餾水溶解，配制成6.5、3.3 mg/mL溶液。金納多（批號(hào)1380817），德國(guó)威瑪舒培博士藥廠。使用時(shí)將60 mg金納多溶于10 mL蒸餾水，配成濃度為6 mg/mL溶液。

蛋白聚糖（NG2）抗體（批號(hào)ab50009）、2′,3′-環(huán)核苷酸-3′-磷酸二酯酶（CNPase）抗體（批號(hào)ab6319）、CRMP2抗體（批號(hào)ab62478），英國(guó)Abcam公司；β-catenin抗體（批號(hào)1247-1），美國(guó)Epitomics公司；GSK-3β抗體（批號(hào)GTX111192），美國(guó)GeneTex公司；Goat anti-mouse IgG-FITC抗體（批號(hào)1036-02）、goat anti-rabbit IgG-TRITC抗體（批號(hào)4030-03），美國(guó)SouthernBiotech公司；RNAprep Pure Tissue Kit動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒（批號(hào)cat#DP431）、RNase-Free DNaseⅠ試劑盒（批號(hào)RT411），北京天根生化科技有限公司。

1.3 儀器

渦旋混勻器（江蘇海門(mén)其林貝爾儀器制造有限公司，型號(hào)VORTEX-5），pH儀（德國(guó)Sartorius公司，型號(hào)PB-21），電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司，型號(hào)101-OAB型），磁力加熱攪拌器（德國(guó)IKA公司，型號(hào)C-MAG HS7），實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)Applied Biosystems公司，型號(hào)7300Real time PCR System），梯度PCR儀（德國(guó)Eppendorf公司，型號(hào)Mastercycler pro），臺(tái)式離心機(jī)（德國(guó)Sartorius公司，型號(hào)138727）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模、分組及給藥

參照文獻(xiàn)[13]制備永久性大腦中動(dòng)脈栓塞（pMCAO）致大鼠局灶性腦缺血模型。55只造模大鼠經(jīng)異氟烷吸入麻醉（5%誘導(dǎo)麻醉，2%維持麻醉）后，仰臥位固定，頸前皮膚消毒，正中切口，鈍性分離皮下組織。暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA）、頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA）及頸外動(dòng)脈（ECA），分離迷走神經(jīng)，結(jié)扎ECA主要?jiǎng)用}分支，并用動(dòng)脈夾夾閉ICA遠(yuǎn)心端和CCA近心端。在ECA遠(yuǎn)心端兩處結(jié)扎并在結(jié)扎點(diǎn)間剪一小口，將已備好的尼龍線栓（直徑0.265 mm）插入ECA，移去ICA遠(yuǎn)心端的動(dòng)脈夾，將線栓沿ECA推向ICA，向內(nèi)推入16～18 mm，感到阻力后停止進(jìn)線，結(jié)扎動(dòng)脈殘端，移去CCA動(dòng)脈夾，縫合皮膚。假手術(shù)組10只大鼠麻醉后僅暴露ECA、ICA，不結(jié)扎。大鼠完全清醒后進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)觀察，以大鼠不能完全伸展左前爪、不能自行行走、不能向左側(cè)旋轉(zhuǎn)為造模成功。參考文獻(xiàn)[14]將造模成功大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組15只、TSTT 65 mg/kg組12只、TSTT 33 mg/kg組12只和金納多組（60 mg/kg）12只[15]。于術(shù)后第6小時(shí)開(kāi)始各給藥組灌胃相應(yīng)藥物，假手術(shù)組、模型組予等量生理鹽水（10 mL/kg），每日1次，連續(xù)15 d。

2.2 取材

干預(yù)結(jié)束后，每組隨機(jī)選5只大鼠麻醉，生理鹽水300 mL快速左心室灌注沖洗，4%多聚甲醛-0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.4）心內(nèi)灌注固定，固定充分后，開(kāi)顱取腦，切取視交叉后4 mm×15 mm×4 mm組織塊，投入固定液，4 ℃固定1周，常規(guī)石蠟包埋，切片機(jī)連續(xù)切取4 μm冠狀切片，進(jìn)行HE染色、LFB染色及免疫熒光染色。各組剩余大鼠麻醉后斷頭取腦，分離梗死灶周圍皮層組織，液氮中貯存，進(jìn)行組織檢測(cè)。

2.3 HE染色

石蠟切片二甲苯脫蠟，經(jīng)逐級(jí)乙醇至蒸餾水洗脫，蘇木素染色10 min，蒸餾水沖洗；鹽酸乙醇分化30 s，蒸餾水浸泡15 min；1%伊紅染液浸泡15 min，蒸餾水沖洗，常規(guī)脫水，中性樹(shù)膠封片。光學(xué)顯微鏡下用NIS-Elements Basic Research圖像采集系統(tǒng)對(duì)染色圖像進(jìn)行觀察和采集，獲取患側(cè)梗死灶周圍皮層3個(gè)不重疊視野進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)每個(gè)視野下的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量，參照文獻(xiàn)[16]計(jì)算單位面積視野下神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量（神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量÷視野面積）。

2.4 LFB染色

石蠟切片二甲苯脫蠟，經(jīng)逐級(jí)乙醇至水洗；LFB染液染色，4 ℃孵育過(guò)夜；95%乙醇沖洗后，蒸餾水沖洗；0.05%碳酸鋰分化10 s，蒸餾水立即沖洗終止；70%乙醇分化，觀察著色情況，重復(fù)碳酸鋰和乙醇分化步驟直至灰白質(zhì)可明顯分辨。常規(guī)脫水，中性樹(shù)膠封片。利用NIS-Elements Basic Research圖像采集系統(tǒng)對(duì)圖像進(jìn)行采集，獲取大鼠健側(cè)及患側(cè)梗死灶周圍皮層3個(gè)不重疊視野進(jìn)行分析。利用Image J軟件統(tǒng)計(jì)每個(gè)視野下LFB染色的積分光密度（IOD），計(jì)算患側(cè)/健側(cè)相對(duì)IOD[17]。

2.5 免疫熒光染色

石蠟切片電熱鼓風(fēng)干燥機(jī)60 ℃干燥1 h，二甲苯脫蠟，乙醇水化，0.01 mol/L PBS沖洗3次，檸檬酸緩沖液熱修復(fù)抗原。冷卻至室溫，PBS洗滌2次，10%羊血清37 ℃封閉1 h，加一抗：CNPase（1∶300）、GSK-3β（1∶400）；CNPase（1∶300）、β-catenin（1∶250）；NG2（1∶100）、GSK-3β（1∶400）；NG2（1∶100）、β-catenin（1∶250），4 ℃孵育48 h。復(fù)溫，PBS洗滌5次，避光滴加goat anti-mouse IgG-FITC（1∶300）、goat anti-rabbit IgG-TRITC（1∶400），37 ℃封閉2 h。0.01 mol/L PBS洗滌6次，DAPI染細(xì)胞核，避光冷藏保存。熒光顯微鏡下觀察切片，每張切片在梗死灶周圍皮層選取3個(gè)固定視野進(jìn)行觀察。激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)470/490 nm條件下，CNPase、NG2陽(yáng)性細(xì)胞呈綠色熒光，分別統(tǒng)計(jì)CNPase和NG2陽(yáng)性表達(dá)的IOD；激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)595/618 nm條件下，GSK-3β、β-catenin陽(yáng)性細(xì)胞呈紅色熒光，利用NIS-Elements Basic Research圖像采集系統(tǒng)計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

2.6 RT-PCR檢測(cè)

按試劑盒說(shuō)明提取大鼠缺血邊緣腦組織總RNA，以總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，配制反應(yīng)體系混合液進(jìn)行PCR。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性15 min，95 ℃變性10 s，共40個(gè)循環(huán)，52 ℃退火31 s，72 ℃延伸30 s。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。引物由日本Takara公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 各基因PCR引物序列

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS Statistics 26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料用表示，符合正態(tài)分布且方差齊用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊采用Tamhane's T2檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布采用非參數(shù)檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

最終存活大鼠為假手術(shù)組10只、模型組10只、TSTT 65 mg/kg組10只、TSTT 33 mg/kg組9只、金納多組10只。

4.1 延齡草皂苷對(duì)模型大鼠腦組織病理變化的影響

假手術(shù)組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)正常、核仁清晰、胞漿豐富、排列整齊；模型組大鼠患側(cè)腦組織出現(xiàn)明顯壞死區(qū)，神經(jīng)細(xì)胞大量死亡，胞體皺縮，胞核深染固縮，胞膜輪廓不清；與模型組比較，TSTT 65 mg/kg組、TSTT 33 mg/kg組及金納多組大鼠患側(cè)梗死灶周圍皮層神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)有所改善，排列較為整齊。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠梗死灶周圍皮層腦組織形態(tài)（HE染色，×400）

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠梗死灶周圍皮層單位面積神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量顯著減少（P＜0.01）；與模型組比較，TSTT 65 mg/kg組、TSTT 33 mg/kg組和金納多組大鼠梗死灶周圍皮層單位面積神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠梗死灶周圍皮層神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量比較（，個(gè)/mm2）

表2 各組大鼠梗死灶周圍皮層神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量比較（，個(gè)/mm2）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量組別只數(shù)386.27±16.24 73.24±43.58**338.41±93.57#312.16±52.58##330.69±35.18##假手術(shù)組模型組TSTT 65 mg/kg組TSTT 33 mg/kg組金納多組5 5 5 5 5

4.2 延齡草皂苷對(duì)模型大鼠神經(jīng)纖維損傷的影響

假手術(shù)組大鼠腦組織神經(jīng)纖維排列致密有序，髓鞘結(jié)構(gòu)清晰完整；模型組大鼠患側(cè)神經(jīng)纖維大量丟失，纖維排列混亂無(wú)序，髓鞘中有大量空泡形成；與模型組比較，TSTT 65 mg/kg組、TSTT 33 mg/kg組及金納多組大鼠患側(cè)神經(jīng)纖維排列較有序，軸突外有致密的髓鞘包裹，髓鞘中空泡較少。見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠梗死灶周圍皮層腦組織形態(tài)（LFB染色，×400）

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠梗死灶周圍皮層神經(jīng)纖維相對(duì)IOD顯著減少（P＜0.01）；與模型組比較，TSTT 65 mg/kg組、TSTT 33 mg/kg組及金納多組大鼠梗死灶周圍皮層神經(jīng)纖維相對(duì)IOD顯著增加（P＜0.01）。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠梗死灶周圍皮層神經(jīng)纖維相對(duì)IOD比較（）

表3 各組大鼠梗死灶周圍皮層神經(jīng)纖維相對(duì)IOD比較（）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

相對(duì)IOD組別只數(shù)1.00±0.02 0.40±0.22**0.87±0.05##0.78±0.08##0.85±0.09##假手術(shù)組模型組TSTT 65 mg/kg組TSTT 33 mg/kg組金納多組5 5 5 5 5

4.3 延齡草皂苷對(duì)模型大鼠梗死灶周圍皮層CNPase、NG2表達(dá)的影響

NG2為少突膠質(zhì)前體細(xì)胞標(biāo)志蛋白，CNPase為成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白。采用免疫熒光染色檢測(cè)梗死灶周圍皮層CNPase、NG2表達(dá)，結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠皮層CNPase陽(yáng)性表達(dá)明顯，幾乎不表達(dá)NG2；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠梗死灶周圍皮層CNPase陽(yáng)性表達(dá)顯著降低，NG2陽(yáng)性表達(dá)顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，TSTT 65 mg/kg組、TSTT 33 mg/kg組及金納多組大鼠梗死灶周圍皮層CNPase、NG2陽(yáng)性表達(dá)顯著升高（P＜0.01）。見(jiàn)圖3、表4。

表4 各組大鼠梗死灶周圍皮層CNPase、NG2表達(dá)比較（，IOD）

表4 各組大鼠梗死灶周圍皮層CNPase、NG2表達(dá)比較（，IOD）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

組別假手術(shù)組模型組TSTT 65 mg/kg組TSTT 33 mg/kg組金納多組NG2 0 164 415.71±51 911.62**353 648.83±53 557.37##260 287.63±48 273.40##401 797.33±44 513.46##只數(shù)5 5 5 5 5 CNPase 592 690.42±44 825.43 282 167.21±47 423.48**435 087.20±17 927.84##341 818.85±31 622.01##458 615.40±29 546.07##

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠梗死灶周圍皮層NG2/GSK-3β、NG2/β-catenin、CNPase/GSK-3β、CNPase/β-catenin陽(yáng)性細(xì)胞顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，TSTT 65 mg/kg組、TSTT 33 mg/kg組及金納多組大鼠梗死灶周圍皮層NG2/GSK-3β、CNPase/GSK-3β陽(yáng)性細(xì)胞顯著減少，NG2/β-catenin、CNPase/β-catenin陽(yáng)性細(xì)胞顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）。見(jiàn)圖4、圖5、表5。

圖4 各組大鼠梗死灶周圍皮層NG2/GSK-3β、NG2/β-catenin陽(yáng)性表達(dá)（免疫熒光染色，標(biāo)尺=50 μm）

圖5 各組大鼠梗死灶周圍皮層CNPase/GSK-3β、CNPase/β-catenin陽(yáng)性表達(dá)（免疫熒光染色，標(biāo)尺=50 μm）

表5 各組大鼠梗死灶周圍皮層NG2/GSK-3β、NG2/β-catenin、CNPase/GSK-3β、CNPase/β-catenin陽(yáng)性細(xì)胞比較（，個(gè)）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

CNPase/β-catenin 5.83± 3.93 79.50±12.98**130.17±12.77##97.40± 7.84##135.00±38.93##組別假手術(shù)組模型組TSTT 65 mg/kg組TSTT 33 mg/kg組金納多組只數(shù)5 5 5 5 5 NG2/GSK-3β 0 140.50±22.60**82.50±16.05##105.33±16.91##74.00±14.14##NG2/β-catenin 0 68.77±15.49**118.00±17.07##105.13±32.95##149.50±24.32##CNPase/GSK-3β 45.30±10.54 115.00±36.12**78.33±18.89##91.50±29.29#85.22±16.43##

4.4 延齡草皂苷對(duì)模型大鼠腦組織GSK-3/β-catenin/CRMP2基因表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠梗死灶周圍皮層GSK-3α mRNA表達(dá)顯著升高，β-catenin、CRMP2 mRNA表達(dá)顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，TSTT 65 mg/kg組大鼠梗死灶周圍皮層GSK-3α、GSK-3β mRNA表達(dá)顯著降低，β-catenin、CRMP2 mRNA表達(dá)顯著升高，TSTT 33 mg/kg組大鼠梗死灶周圍皮層GSK-3α、GSK-3β mRNA表達(dá)顯著降低，金納多組CRMP2 mRNA表達(dá)顯著升高（P＜0.01）。見(jiàn)表6。

表6 各組大鼠梗死灶周圍皮層GSK-3α、GSK-3β、β-catenin、CRMP2 mRNA表達(dá)比較（）

表6 各組大鼠梗死灶周圍皮層GSK-3α、GSK-3β、β-catenin、CRMP2 mRNA表達(dá)比較（）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別假手術(shù)組模型組TSTT 65 mg/kg組TSTT 33 mg/kg組金納多組CRMP2 2.16±0.81 1.17±0.26*2.17±0.69#1.98±0.62 2.52±1.35##只數(shù)5 5 5 4 5 GSK-3α 0.91±0.27 1.40±0.41*1.03±0.26#0.93±0.30#1.18±0.12 GSK-3β 1.27±0.11 1.61±0.91 0.99±0.29#0.83±0.37#1.25±0.29 β-catenin 1.83±0.57 1.14±0.18**1.63±0.40#1.24±0.35 1.41±0.38

5 討論

腦卒中發(fā)生后，缺血誘導(dǎo)組織損傷，造成神經(jīng)元大量死亡丟失。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠缺血腦區(qū)出現(xiàn)明顯梗死灶，血管水腫明顯，神經(jīng)細(xì)胞變性壞死，腦缺血導(dǎo)致梗死灶周圍皮層區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少；TSTT能增加腦缺血大鼠梗死灶周圍皮層神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量，減輕腦組織損傷。腦白質(zhì)主要由大量少突膠質(zhì)細(xì)胞和髓鞘構(gòu)成，少突膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)髓鞘化神經(jīng)纖維發(fā)揮傳導(dǎo)功能，維持神經(jīng)元正常功能[5]。腦缺血后，少突膠質(zhì)細(xì)胞在數(shù)分鐘至數(shù)小時(shí)內(nèi)腫脹、死亡，導(dǎo)致神經(jīng)纖維脫髓鞘損傷。腦白質(zhì)由穿支動(dòng)脈供血，對(duì)缺血性損傷極為敏感[18]。缺血導(dǎo)致嚴(yán)重的腦白質(zhì)損傷，表現(xiàn)為少突膠質(zhì)細(xì)胞死亡、髓鞘脫失，軸突功能受損[19-20]。LFB染色顯示，模型組大鼠缺血腦區(qū)神經(jīng)纖維大量斷裂，纖維排列混亂無(wú)序，髓鞘中有大量空泡形成，定量分析結(jié)果顯示，模型組大鼠梗死灶周圍皮層神經(jīng)纖維相對(duì)IOD顯著降低，TSTT能增加模型大鼠梗死灶周圍皮層神經(jīng)纖維相對(duì)IOD，提示TSTT可減輕腦缺血后神經(jīng)病理?yè)p傷，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，減少神經(jīng)纖維髓鞘脫失。腦白質(zhì)損傷后內(nèi)源性修復(fù)啟動(dòng)，少突膠質(zhì)前體細(xì)胞增殖分化為成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)腦缺血損傷后髓鞘修復(fù)[21]。本研究結(jié)果顯示，腦缺血能下調(diào)少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白CNPase，上調(diào)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞標(biāo)志蛋白NG2表達(dá)，說(shuō)明腦缺血可損傷少突膠質(zhì)細(xì)胞，誘導(dǎo)內(nèi)源性少突膠質(zhì)前體細(xì)胞增殖，促進(jìn)髓鞘損傷后的修復(fù)。但機(jī)體內(nèi)源性修復(fù)能力有限[22]，受損的少突膠質(zhì)細(xì)胞不足以維持髓鞘形成，缺血誘導(dǎo)的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞很難分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞[23]。因此，減輕少突膠質(zhì)細(xì)胞損傷，刺激內(nèi)源性少突膠質(zhì)前體細(xì)胞增殖、分化，對(duì)髓鞘再生具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)，TSTT能上調(diào)腦缺血大鼠梗死灶周圍皮層CNPase和NG2表達(dá)，提示TSTT可減輕少突膠質(zhì)細(xì)胞損傷，促進(jìn)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞增殖，對(duì)缺血損傷后的髓鞘重構(gòu)產(chǎn)生積極的干預(yù)作用。

內(nèi)源性少突膠質(zhì)前體細(xì)胞增殖、分化過(guò)程涉及不同的分子信號(hào)級(jí)聯(lián)。Wnt信號(hào)通路對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的作用受到廣泛關(guān)注。當(dāng)β-catenin水平低下時(shí)，Wnt途徑關(guān)閉；β-catenin水平升高時(shí)，Wnt途徑開(kāi)啟[24]。GSK-3β是β-catenin信號(hào)分子的關(guān)鍵負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白，其表達(dá)升高可促進(jìn)β-catenin磷酸化及降解過(guò)程，抑制Wnt信號(hào)向下傳遞[25]。當(dāng)GSK-3活性被抑制時(shí)，可解除對(duì)β-catenin的磷酸化作用，導(dǎo)致β-catenin在胞漿內(nèi)累積并入核，從而影響少突膠質(zhì)前體細(xì)胞增殖、存活及向少突膠質(zhì)細(xì)胞分化[26]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步采用免疫熒光雙標(biāo)法觀察GSK-3β、β-catenin在CNPase、NG2陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，TSTT下調(diào)模型大鼠梗死灶周圍皮層CNPase、NG2陽(yáng)性細(xì)胞GSK-3β表達(dá)的同時(shí)，上調(diào)CNPase、NG2陽(yáng)性細(xì)胞β-catenin表達(dá)。GSK-3、β-catenin轉(zhuǎn)錄水平分析結(jié)果也顯示，TSTT可下調(diào)梗死灶周圍皮層GSK-3基因表達(dá)，上調(diào)β-catenin基因表達(dá)。進(jìn)一步檢測(cè)GSK-3β下游底物微管相關(guān)蛋白CRMP2表達(dá)。CRMP2作為介導(dǎo)軸突和樹(shù)突特異性生長(zhǎng)的胞漿磷蛋白，通過(guò)將微管蛋白單體沉積到神經(jīng)絲的生長(zhǎng)端，促進(jìn)軸突的生長(zhǎng)和延伸[27]。GSK-3β能夠磷酸化CRMP2蛋白，導(dǎo)致生長(zhǎng)錐坍塌，抑制軸突再生[28]。抑制GSK-3活性，升高CRMP2表達(dá)，可促進(jìn)軸突的生長(zhǎng)與修復(fù)，調(diào)節(jié)髓鞘形成[29]。本研究結(jié)果顯示，TSTT可明顯上調(diào)CRMP2轉(zhuǎn)錄活性。研究顯示，陽(yáng)性藥金納多可明顯下調(diào)模型大鼠梗死灶周圍皮層NG2、CNPase陽(yáng)性細(xì)胞GSK-3β表達(dá)，上調(diào)β-catenin表達(dá)。基因檢測(cè)結(jié)果顯示，金納多雖可明顯上調(diào)缺血腦組織CRMP基因表達(dá)，但GSK-3、β-catenin基因表達(dá)較模型組無(wú)明顯差異，結(jié)合免疫熒光結(jié)果，提示金納多主要通過(guò)影響NG2、CNPase陽(yáng)性細(xì)胞GSK-3β、β-catenin表達(dá)，促進(jìn)軸突生長(zhǎng)和修復(fù)。

TSTT主要成分為甾體皂苷類，包括偏諾皂苷類與薯蕷皂苷類。相關(guān)研究顯示，延齡草中偏諾皂苷元、偏諾皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷等4個(gè)單體成分能夠抑制MCAO大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞激活，減少腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-6等多種炎癥因子釋放，發(fā)揮抗炎作用，通過(guò)升高M(jìn)CAO大鼠血清超氧化物歧化酶活性，降低丙二醛含量，抑制谷氨酸合成和分泌，減少一氧化氮和Ca2+釋放，從而減弱機(jī)體的氧化損傷程度，保護(hù)缺血腦組織[30]。薯蕷皂苷可通過(guò)調(diào)控HMGB-1/RAGE信號(hào)通路發(fā)揮抗炎、抗凋亡和抗氧化作用，對(duì)腦缺血后的海馬神經(jīng)元起保護(hù)作用[31]。本研究發(fā)現(xiàn)，TSTT可減輕腦缺血大鼠梗死灶周圍皮層少突膠質(zhì)細(xì)胞損傷，促進(jìn)OPC增殖，并對(duì)GSK-3/β-catenin/CRMP2信號(hào)軸產(chǎn)生重要的調(diào)控作用，這對(duì)于促進(jìn)髓鞘缺血性損傷后的重構(gòu)具有重要意義，值得深入研究。