缺血性腦卒中病證結(jié)合實驗動物模型構(gòu)建研究進展

秦文秀，杜健強 ，許軍峰，高瑩，王坪霏，楊婷

1.天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，天津 300381；2.國家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學研究中心，天津 300381；3.天津中醫(yī)藥大學，天津 301617； 4.甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅 蘭州 730000

缺血性腦卒中（ischemic stroke，IS）是腦卒中的亞型之一，占比超過80%[1]。IS具有高致殘率、高病死率和高復發(fā)率的特點，目前已成為僅次于心血管疾病和癌癥的第三大全球健康問題，嚴重影響患者的生活質(zhì)量，給社會帶來沉重的經(jīng)濟負擔[2]。臨床上，IS患者仍依賴于靜脈溶栓與機械取栓等再灌注治療，以重建腦內(nèi)血液循環(huán)[3-4]。然而，重組組織型纖溶酶原激活劑（rt-PA）等溶栓藥物的應用常因治療時間窗和較多的不良反應而受限[5-6]。

中醫(yī)辨證論治被廣泛應用于腦血管疾病的治療，療效顯著，但相關(guān)機制仍需進一步明確闡述，提供科學的循證依據(jù)。因此，越來越多的研究者致力于中西醫(yī)結(jié)合防治IS的研究，以促進中西醫(yī)學的優(yōu)勢互補、互相融合。近年來相繼成功建立了多種兼具西醫(yī)疾病和中醫(yī)證候特點的IS病證結(jié)合動物模型，并應用于中醫(yī)IS干預等研究，為揭示中醫(yī)藥療效、深入了解中醫(yī)藥防治IS相關(guān)機制奠定一定基礎(chǔ)[7]。本文對目前IS病證結(jié)合模型的構(gòu)建和評價方法進行簡要總結(jié)和評論。

1 中西醫(yī)認識

IS損傷主要由于大腦特定區(qū)域的血流突然中斷，引發(fā)腦組織局部供血障礙，進而發(fā)生一系列復雜的病理生理級聯(lián)反應，包括血腦屏障滲漏、興奮性毒性、Ca2+超載、氧化應激、異常免疫反應和能量代謝障礙等[8-10]。這些因素發(fā)生在不同的時間點，相互影響、相互促進，最終導致神經(jīng)發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的功能損害[11]。

IS屬中醫(yī)學“中風”范疇?！爸酗L”首見于《金匱要略·中風歷節(jié)病脈證并治》，后世沿用至今。半身不遂、口眼歪斜、共濟失調(diào)、神志不清等是常見的臨床癥狀。主要由于內(nèi)傷積損、情志過極、飲食不節(jié)、體態(tài)肥盛等引起虛氣留滯，或氣虛痰濕，或痰熱內(nèi)生，或肝陽暴張，導致內(nèi)風旋動，氣血逆亂，橫竄經(jīng)脈，直沖犯腦，發(fā)為中風。總體來說，本病的病機演變常見于本虛標實之間[12]。急性期以風、火（熱）、痰、瘀為主，常見風痰上擾、風火相煽、痰瘀互阻、氣血逆亂等“標”實之象。恢復期及后遺癥期則以虛中夾實為主，多見氣虛血瘀、陰虛陽亢，或血少脈澀、陽氣衰微等“本”虛之征。

關(guān)于中風病的中醫(yī)辨證分型尚存在不同觀點。根據(jù)患者是否存在神識昏蒙，可分為中經(jīng)絡(luò)與中臟腑，根據(jù)證候表現(xiàn)可將中經(jīng)絡(luò)分為風陽上擾證、風痰入絡(luò)證、陰虛風動證，中臟腑可分為閉證、脫證，閉證可分為陰閉、陽閉。脫證多為陰竭陽亡證[12]。由于中風病的病因病機復雜，在臨床實踐中辨證論治更具靈活性。各醫(yī)家辨治中風的關(guān)注點不盡相同。石學敏院士強調(diào)“腦神”在中風病發(fā)病中的主導作用，創(chuàng)造性提出“竅閉神匿”是中風病機之根本[13]；丁元慶教授認為營衛(wèi)理論與中風病因病機密切相關(guān)，營衛(wèi)失常為基本病機環(huán)節(jié)并貫穿始終，構(gòu)建營衛(wèi)失常、正虛邪結(jié)、血脈受損、氣機逆亂、生風動腦的中風病機理論[14]；以章次公、朱良春為代表的章朱學派認為，中風的病因繁多，病機總不離肝腎陰虛、肝陽偏亢、肝風內(nèi)動[15]。另外，缺血性中風病患者地域不同、病理階段不同等因素也影響中醫(yī)證候的分布與辨析[16]?？傊嗅t(yī)藥基于辨證論治理論防治IS應用廣泛，療效明確，自古至今逐漸形成諸如醒腦開竅、通調(diào)營衛(wèi)、益氣活血[17]、腎腦同治[18]等多種具有辨證特色的臨床診療思維，并不斷地探索、完善相關(guān)理論。

2 缺血性腦卒中病證結(jié)合模型研究

2.1 氣虛血瘀證

氣虛血瘀證多見于發(fā)病急性期或恢復期，是最為常見的證型之一，病機與氣血虧虛、瘀血阻滯有關(guān)[19]。主要證候表現(xiàn)為半身不遂，肌膚不仁，口舌歪斜，言語不利，面色無華，氣短乏力，舌苔薄白或膩，脈沉細或細弦。

譚輝等[20]將老齡大鼠作為研究對象，首先采用多因素方法復制中醫(yī)證候特征，具體操作為：給予正常飲食量的60%飼養(yǎng)以模擬饑餓因素，給予24 h照明與游泳以模擬疲勞因素，給予低氧裝以模擬低氧因素，給予脂肪乳劑灌胃以模擬肥甘厚味因素，連續(xù)進行10 d后實施線栓法。結(jié)果顯示，模型動物氣虛證評分、血瘀證評分均有所升高，有效模擬制備IS病證結(jié)合動物模型。該研究發(fā)現(xiàn)腦絡(luò)欣通和通心絡(luò)等益氣活血方能改善模型大鼠神經(jīng)功能缺損及氣虛血瘀相關(guān)癥狀。

李瑩等[21]對大鼠采用水環(huán)境小平臺法剝奪睡眠，1周后實施腦梗死手術(shù)，繼續(xù)4周睡眠剝奪，分別于48 h、第1周、第4周測定反映大鼠特征和病理生理動態(tài)變化的指標。結(jié)果顯示，模型大鼠神經(jīng)功能障礙、腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的病理改變隨時間推移而加重，伴體型瘦弱、精神萎靡、喜靜臥、毛發(fā)失澤、便溏，成功建立IS氣虛血瘀證模型。采用益氣活血方干預后，模型大鼠的一般狀態(tài)、行為障礙及腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的病理變化明顯減輕。

楊璐平等[22]首先對SD雄性大鼠給予多因素復合復制氣虛血瘀證候，具體措施為：第1日持續(xù)光照24 h、灌胃脂肪乳劑，第2日給予負重力竭游泳、禁食24 h，第3日同第1日，第4日同第2日，4種方法循環(huán)往復2周后行線栓法制備大腦中動脈閉塞模型。經(jīng)氣虛證評分、血瘀證評分判定病證結(jié)合模型構(gòu)建成功。補陽還五湯能通過改善大鼠脂質(zhì)代謝狀態(tài)，調(diào)整腦血流，從而發(fā)揮防治IS氣虛血瘀證的作用。

2.2 風痰入絡(luò)證

風痰入絡(luò)證常見于疾病急性期[23-24]，病機主要與肝陽上亢、痰熱內(nèi)生有關(guān)，多表現(xiàn)為肌膚不仁，甚則半身不遂，口舌歪斜，言語不利或蹇澀，頭暈目眩，舌質(zhì)黯淡，舌苔白膩，脈弦滑。

劉祎等[25]采用高脂飲食20 g/d復制大鼠痰證模型，并配以附子湯20 mL/kg灌胃復制大鼠肝陽上亢證模型，于第31日采用線栓法建立IS風痰入絡(luò)證病證組合模型。模型大鼠體偏肥胖，毛發(fā)干枯，精神差，行動緩慢，進食量減少，煩躁易怒，符合風痰入絡(luò)證候特征。研究結(jié)果顯示，息風化痰通絡(luò)之古方真方白丸子對該模型功能缺損評分及血液流變學、血脂四項、去甲腎上腺素、皮質(zhì)醇、血栓素B2（TXB2）、三碘甲狀腺原氨酸等微觀指標均有明顯改善。表明高脂飲食及附子湯灌胃聯(lián)合線栓法可建立IS風痰入絡(luò)證病證結(jié)合動物模型，可為IS風痰入絡(luò)證的基礎(chǔ)研究及建模方法提供參考。

2.3 火毒證

火毒證雖未被明確提出，但根據(jù)其證候特征可歸屬于中臟腑閉證（陽閉）范疇?；鸲疽驯粡V泛認為是腦卒中進展和加重的重要原因和發(fā)病機制，尤其是IS急性期。常見昏迷、不語、呼吸急促及一系列發(fā)熱癥狀，面色晦黯、舌紅、苔黃，脈搏疾數(shù)，甚至高熱[26]。

梁曉等[27]通過腹腔注射角叉菜膠復合線栓建立急性腦梗死火毒證模型，具體方法為：大鼠腹腔注射4%角叉菜膠，每日1次，連續(xù)3 d，然后進行線栓法造模。模型大鼠出現(xiàn)黑尾現(xiàn)象，伴耳廓邊緣發(fā)紅，舌底脈絡(luò)青紫粗長、細絡(luò)瘀血，肛溫升高等一系列火毒證候。該研究表明，清熱活血聯(lián)合應用可通過抑制炎癥反應核因子-κB（NF-κB）信號通路中的關(guān)鍵κB抑制因子激酶β、NF-κB p65基因和蛋白的表達，對急性腦梗死的治療發(fā)揮協(xié)同增效作用。該團隊同樣采用腹腔注射角叉菜膠復合線栓法成功構(gòu)建大鼠IS火毒證模型，探討模型大鼠腦缺血半暗帶皮層組織能量代謝相關(guān)蛋白與IS的關(guān)系[28]。

2.4 痰瘀互結(jié)證

瘀血和痰濁在中風病發(fā)病中占有重要地位，并貫穿中風病始終，在疾病急性期多見。痰瘀同治法是基于中醫(yī)絡(luò)病理論提出的一種治療方法[29]。證候特征常表現(xiàn)為頭暈目眩、頭重如蒙、神疲乏力、肢體麻木、納呆、舌黯紅、苔白膩、脈弦滑等。

張令霖等[30]予大鼠高脂飼料（基礎(chǔ)飼料52.2%、蔗糖20%、豬油15%、酪蛋白10%、膽固醇1.2%、膽酸鈉0.2%、磷酸氫鈣0.6%、石粉0.4%、預混料0.4%）喂養(yǎng)，自由進食飲水，每只大鼠日飼料消耗量約為20～30 g，飲水20～30 mL，不限制其活動，4周后行大腦中動脈栓塞法建立IS痰瘀互結(jié)證動物模型。結(jié)果顯示模型大鼠出現(xiàn)明顯肢體癱瘓癥狀，血脂水平升高，凝血功能降低，腦系數(shù)及腦組織出現(xiàn)異常改變，中醫(yī)證候特征表現(xiàn)為精神萎靡、活動減少、身體蜷縮、舌質(zhì)紫黯。

李述捷等[31]利用高脂飲食復合線栓法模擬痰瘀互結(jié)IS模型，研究丹蔞片對痰瘀互結(jié)型IS大鼠核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（NLRP3）/消皮素D（GSDMD）細胞焦亡通路的影響，發(fā)現(xiàn)丹蔞片可改善痰瘀互結(jié)型IS后大鼠相關(guān)癥狀，降低細胞焦亡相關(guān)蛋白表達。

董娜娜等[32]通過高脂飼料飼養(yǎng)結(jié)合線栓法復制痰瘀互結(jié)IS模型，探討豬牙皂皂苷對痰瘀互結(jié)型IS模型大鼠的保護作用及機制，發(fā)現(xiàn)豬牙皂皂苷能降低模型大鼠的全血黏度、紅細胞聚集指數(shù)及血清三酰甘油、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇水平，升高血清高密度脂蛋白膽固醇水平，具有改善模型大鼠血液流變學、調(diào)節(jié)血脂代謝的作用。

2.5 瘀毒互結(jié)證

瘀毒互結(jié)證多見于IS急性期，多因臟腑功能虛弱而致瘀血內(nèi)生，瘀久化熱，熱從毒化，導致瘀毒互結(jié)，壅堵腦絡(luò)，發(fā)為中風。瘀毒壅塞腦絡(luò)為標，其本在正氣虛損[33-34]。主要證候表現(xiàn)為精神萎靡，舌質(zhì)紫黯，甚至出現(xiàn)瘀點、瘀斑，脈澀等。

蔣成婷等[35]將大鼠適應性喂養(yǎng)7 d后腹腔注射角叉菜膠50 mg/kg，每日1次，連續(xù)3 d，第4日大鼠背部皮下注射0.1%干酵母懸液10 mL/kg，連續(xù)14 d后采用線栓法制備IS瘀毒互結(jié)模型。結(jié)果顯示，模型大鼠神經(jīng)功能評分、腦組織病理形態(tài)學等改變較腎上腺素/內(nèi)毒素、角叉菜膠組大鼠更為顯著。同時，大鼠尾部遠心端、四肢末梢出現(xiàn)皮膚發(fā)黑，局部發(fā)黑處皮膚溫度降低，符合瘀毒互結(jié)證病情急重、膚色晦黯的特征。提示通過角叉菜膠/干酵母菌干預，復合線栓法能較好地復制IS瘀毒互結(jié)證動物模型。

彭珣等[36]在采用上述方法成功復制IS瘀毒互結(jié)模型后，通過體內(nèi)實驗對化瘀解毒方改善IS的作用機制進行初步探索，得出化瘀解毒方能保護IS瘀毒互結(jié)證大鼠血腦屏障功能，減輕腦組織損傷和神經(jīng)功能缺損的程度。

2.6 不同模型比較

IS病證結(jié)合不同模型構(gòu)建方法見表1。

表1 IS病證結(jié)合模型構(gòu)建方法

IS氣虛血瘀證模型主要采用多因素復合法聯(lián)合常規(guī)IS造模方法進行復制，是IS病證結(jié)合模型研究較多的方向之一。模型的表觀指征符合氣虛血瘀證的特點。評價標準較為統(tǒng)一，應用廣泛，模型可靠，是一種穩(wěn)定的病證結(jié)合模型。

IS風痰入絡(luò)證模型主要通過高脂飲食及中醫(yī)溫陽藥水煎劑灌胃，聯(lián)合經(jīng)典線栓法誘導造模。但該病證結(jié)合模型目前少有報道，需進行大量研究驗證其可重復性，不斷完善評價標準，形成穩(wěn)定、可靠的造模方法。

IS火毒證模型采用腹腔注射角叉菜膠的方式，在此基礎(chǔ)上進行IS的復合造模，得到IS火毒證模型。造模方法較為簡便，可行性高，模型的證型表現(xiàn)明顯，是比較穩(wěn)定、可靠的病證結(jié)合模型。

IS痰瘀互結(jié)證模型的報道較多，造模方法類似，普遍采用高脂飼養(yǎng)聯(lián)合常規(guī)IS造模方法進行制備。模型的表觀指征表現(xiàn)明顯，符合痰瘀互結(jié)證的特點，檢測內(nèi)容多樣，是一種穩(wěn)定的造模方法。

IS瘀毒互結(jié)證模型大多采用腹腔注射角叉菜膠的方式進行造模，在此基礎(chǔ)上進行IS的復合造模。模型的表觀指征符合瘀毒互結(jié)證特點，檢測指標可重復性好，是一種穩(wěn)定的造模方法。

3 問題及展望

近年來IS病證結(jié)合動物模型研究取得一定進展，但仍存在一些爭議，反映出部分亟待解決和應重視的問題。

第一，造模思路。目前制備IS病證結(jié)合模型的方法多采用西醫(yī)病理和中醫(yī)證候相結(jié)合的模式，將二者同步或先后復制在同一動物模型上。表觀上同時出現(xiàn)疾病及證候的特征，然而這并不能完全等同于IS自然發(fā)生的病證關(guān)系，與臨床實際病證結(jié)合的理念尚存在偏差[37]?！安　迸c“證”的先后復制順序，哪種方法更符合臨床，鮮有學者對其進行對比研究。在中醫(yī)學領(lǐng)域中，“證”是疾病在自然發(fā)生發(fā)展過程中某一階段病位、病因、病性、病勢的有機聯(lián)系，表現(xiàn)為臨床可被觀察到的癥狀。因此有學者提出“三維病證結(jié)合動物模型”[21]構(gòu)建方法，即通過對疾病動物進行持續(xù)、動態(tài)、全面的觀察，動態(tài)評價疾病不同階段動物表現(xiàn)出的證候特征。該造模方法干預因素單一，符合疾病生理病理自然發(fā)生過程和有機聯(lián)系，貼近臨床實際情況，是值得參考的研究方向。

第二，模型評價。目前IS病證結(jié)合動物模型評價標準尚缺乏統(tǒng)一性。在西醫(yī)病理特征評價方面多采用神經(jīng)功能評分、腦組織病理形態(tài)學檢測及血液流變學檢測，各研究之間無統(tǒng)一規(guī)范化的檢測標準；在中醫(yī)證候評價方面多采用動物外觀、行為觀察等描述性評價，缺乏具有中醫(yī)特色的標準評價體系和觀察指標，缺乏證型的現(xiàn)代化依據(jù)。這導致國內(nèi)外對IS病證結(jié)合模型的認可度不高。因此，應對上述指標進行統(tǒng)一、規(guī)范、標準化，為今后研究提供指南性參考，并積極探索各類IS中醫(yī)證型的微觀表達，將其應用于IS病證結(jié)合模型的構(gòu)建評價中，為模型的科學性提供更有說服力的循證依據(jù)。另外，諸多研究探討方藥方劑對IS模型的療效評價，從“以方測證”[38]的思路對模型的可行性提供證據(jù)，是值得采取的方法。

第三，造模證型。辨證論治是中醫(yī)臨床醫(yī)學的靈魂和基本原則之一，證候是辨證論治的核心和精髓。由于臨床實踐的靈活性，證候識別必然具有一定的主觀性和不確定性，難以準確揭示其真實內(nèi)涵，一定程度限制了中醫(yī)診療特色的發(fā)揮。IS的預防、治療和康復是國內(nèi)外學者關(guān)注的話題，為尋找安全有效的治療藥物進行了大量臨床試驗。但傳統(tǒng)的辨證方法已經(jīng)很難適應這些研究的要求，一些學者認為今后網(wǎng)絡(luò)生物學技術(shù)特別是組學技術(shù)應用于證候研究具有重要價值，能為中風綜合征的研究提供新思路[39]。

綜上所述，病證結(jié)合動物模型是以中醫(yī)基礎(chǔ)理論和病證結(jié)合理論為指導，結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學理論與實驗動物科學知識，構(gòu)建出既符合西醫(yī)疾病特征又具備中醫(yī)證候特點的動物模型。IS病證結(jié)合動物模型的制備仍處于探索階段。隨著中醫(yī)學和現(xiàn)代醫(yī)學對IS的研究逐步深入，科學、客觀、準確、可復制的病證結(jié)合模型在闡明IS的發(fā)病機制和中醫(yī)藥防治原理中尤為關(guān)鍵。研究人員可通過運用代謝組學、基因組學及先進的分子生物學檢測技術(shù)，在現(xiàn)有研究基礎(chǔ)上多學科交叉助力，進一步探索中醫(yī)宏觀證候表現(xiàn)與西醫(yī)微觀病理之間的聯(lián)系，構(gòu)建標準、穩(wěn)定、統(tǒng)一、切合臨床實際的病證結(jié)合動物模型體系，為中醫(yī)藥治療IS的基礎(chǔ)研究發(fā)展提供良好的模型支持。