健脾養(yǎng)正消癥湯干預(yù)己糖激酶2介導(dǎo)的糖代謝調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖和凋亡

商佳榮，鄭俠，錢軍

南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210004

胃癌是常見消化道惡性腫瘤，根據(jù)世界衛(wèi)生組織數(shù)據(jù)顯示，2020年我國因胃癌死亡人數(shù)為37.4萬，居我國癌癥死亡原因第3位[1]。由于胃癌早期癥狀不明顯，確診時多為晚期甚至發(fā)生轉(zhuǎn)移，五年生存率約35.1%[2]。近年來，內(nèi)鏡檢查、手術(shù)、放化療、免疫和靶向治療在胃癌中取得了突破，然而依然存在復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高、藥物耐受性等難題，嚴(yán)重影響患者的生存和生活質(zhì)量。因此，探索高效低毒的藥物和精準(zhǔn)靶點，提高胃癌治療的療效和安全性具有重要意義。

胃癌的發(fā)展與細(xì)胞能量代謝關(guān)系密切，胃癌細(xì)胞通過調(diào)節(jié)葡萄糖攝取、乳酸生成等代謝途徑，為其增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及逃逸等創(chuàng)造有利條件，有助于其在腫瘤進(jìn)展期間無限增殖和存活。胃癌細(xì)胞在惡性轉(zhuǎn)化的過程中，細(xì)胞的代謝模式從氧化磷酸化轉(zhuǎn)化為糖酵解以滿足更多的能量需求[3]。己糖激酶是糖酵解過程的第一個限速酶，可磷酸化己糖變?yōu)榧禾?6-磷酸。已知的己糖激酶有4種（HK1～HK4），其中己糖激酶2（HK2）在很多和有氧糖酵解增強有關(guān)的腫瘤中表達(dá)上調(diào)[4]。HK2可加速胃癌細(xì)胞對葡萄糖的攝取，促進(jìn)糖代謝，進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和腫瘤進(jìn)展[5]。因此，抑制胃癌糖代謝途徑相關(guān)基因、蛋白表達(dá)及通路激活，可能是抑制胃癌腫瘤細(xì)胞進(jìn)展的關(guān)鍵。

中醫(yī)藥治療胃癌等惡性腫瘤不僅能顯著改善臨床癥狀，直接發(fā)揮抗癌作用，還能聯(lián)合手術(shù)、放化療、靶向及免疫治療等發(fā)揮增效減毒作用。首屆全國名中醫(yī)劉沈林教授針對胃癌治療，在汲取前人經(jīng)驗基礎(chǔ)上，通過長期臨床實踐總結(jié)，提出“脾虛正衰是病機(jī)關(guān)鍵，癌毒是重要病理因素”，并由《何氏虛勞心傳》健脾資生丸及《沈氏尊生書》血癥丸化裁而成健脾養(yǎng)正消癥湯[6]。臨床試驗顯示，健脾養(yǎng)正消癥湯可顯著延長胃癌晚期患者生存期，提高其生活質(zhì)量[7]。然而，對于健脾養(yǎng)正消癥湯治療胃癌的具體分子生物學(xué)機(jī)制尚未完全闡明。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法及實驗驗證，探索健脾養(yǎng)正消癥湯通過影響糖代謝途徑治療胃癌的分子生物學(xué)作用機(jī)制，為健脾養(yǎng)正消癥湯的開發(fā)和臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

1.1.1 健脾養(yǎng)正消癥湯有效成分及靶點獲取

通過TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php）檢索健脾養(yǎng)正消癥湯11味組方藥物“黃芪”“黨參”“白術(shù)”“當(dāng)歸”“白芍”“陳皮”“三棱”“莪術(shù)”“石見穿”“白花蛇舌草”“甘草”的活性成分，以類藥性（DL）≥0.18且口服生物利用度（OB）≥30%的化合物作為健脾養(yǎng)正消癥湯有效活性成分，同時收集和整理活性成分對應(yīng)的靶點。將所得活性成分輸入PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），下載化學(xué)成分標(biāo)準(zhǔn)化格式的SMILES號，并將其輸入SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）平臺進(jìn)行靶點預(yù)測。根據(jù)UniProt（https://www.uniprot.org）數(shù)據(jù)庫對靶點信息進(jìn)行比對、校正，將SwissTargetPrediction和TCMSP靶點合并、去重，獲得活性成分靶點，構(gòu)建健脾養(yǎng)正消癥湯活性成分靶點數(shù)據(jù)庫。

1.1.2 胃癌糖代謝相關(guān)靶點檢索

以檢索表達(dá)式“glycometabolism” AND“gastric cancer”，在GeneCards（https://www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫檢索相關(guān)疾病靶點，以Relevance score＞1為標(biāo)準(zhǔn)選取疾病靶點，比對UniProt數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建疾病相關(guān)靶點數(shù)據(jù)庫。利用Venny（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）映射疾病靶點與健脾養(yǎng)正消癥湯活性成分靶點的交集。

1.1.3 中藥-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將交集靶點數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.9.1軟件（https://cytoscape.org/），構(gòu)建中藥-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，以直觀展現(xiàn)藥物活性成分與疾病間相互關(guān)系。利用CytoNCA插件對該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，計算?jié)點的度中心性（degree centrality，DC）、中介中心性（betweenness centrality，BC）和接近中心性（closeness centrality，CC）。網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點的值越大，相互作用關(guān)系就越多，越可能為該網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點。

1.1.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

基于STRING（https://string-db.org/）數(shù)據(jù)庫獲取潛在靶點蛋白相互作用（PPI）關(guān)系，設(shè)定物種為“Homo Sapiens”（人類），篩選并構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。借助Cytoscape對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行挖掘分析，基于CytoNCA插件計算PPI網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點的DC、BC、CC進(jìn)行拓?fù)浞治觯x取DC、BC、CC值均高于中位數(shù)的靶點作為核心靶點。

1.1.5 GO、KEGG及DO富集分析

運用RStudio軟件包ggplot2、clusterProfiler、enrichplot、org.Hs.eg.db、ggnewscale、pathview對健脾養(yǎng)正消癥湯干預(yù)胃癌糖代謝的潛在靶點進(jìn)行GO、KEGG和DO富集分析。以P＜0.05為條件進(jìn)行篩選，得到健脾養(yǎng)正消癥湯干預(yù)胃癌糖代謝的主要功能、通路及相關(guān)疾病，并對結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

1.1.6 分子對接

借助PubChem數(shù)據(jù)庫，查找健脾養(yǎng)正消癥湯主要活性成分的3D結(jié)構(gòu)，輸入OpenBabel3.1.1（http://openbabel.org/），保存為mol2格式。依據(jù)RCSB PDB（http://www.rcsb.org/）數(shù)據(jù)庫，查找核心靶點的蛋白晶體結(jié)構(gòu)，利用PyMOL（https://pymol.org/）軟件對其進(jìn)行去水、加氫，并輸出為pdb格式。最后使用Autodock Tools（https://autodock.scripps.edu/）軟件進(jìn)行分子對接分析。

1.2 細(xì)胞實驗驗證

1.2.1 動物、試藥與儀器

SPF級SD雄性大鼠16只，8～10周齡，體質(zhì)量（200±20）g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證號SCXK（京）2012-0001。于溫度（20±2）℃、濕度50%±10%、12 h/12 h光暗循環(huán)條件下，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后開始實驗。人胃癌細(xì)胞HGC-27、AGS，購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中心實驗室常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素溶液的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，取對數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實驗。動物實驗經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會審批（2020NL-107-1）。

健脾養(yǎng)正消癥湯（黨參30 g，黃芪60 g，麩炒白術(shù)10 g，炒白芍10 g，當(dāng)歸10 g，石見穿15 g，三棱30 g，莪術(shù)30 g，白花蛇舌草15 g，陳皮6 g，甘草5 g）飲片購于南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，加10倍量水常規(guī)煎煮，重復(fù)煎煮2次，所得藥液混合、過濾、滅菌、蒸發(fā)、濃縮，使其終濃度為1 g/mL，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

10%胎牛血清，浙江天杭生物科技有限公司，批號20010401；1%青-鏈霉素溶液的RPMI-1640培養(yǎng)基，賽默飛世爾科技（中國）有限公司，批號分別為2085154、2240832。葡萄糖測定試劑盒，上海榮盛生物藥業(yè)有限公司，批號20181209290；乳酸測定試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號20190603；HK2抗體，美國Proteintech公司，批號66287-1-lg；二抗，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號134293。

1300A2型生物安全柜（美國Thermo公司），IX51型倒置顯微鏡（日本Olympus公司），ELx800型全自動酶標(biāo)儀（美國BioTek公司），C6流式細(xì)胞儀（美國BD公司），PowerPacTMBasic型電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad公司），Tanon-5500型化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀（中國天能科技有限公司），HERAcell 1501型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）。

1.2.2 含藥血清制備

將16只大鼠隨機(jī)分為含藥血清組和對照血清組。依據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，根據(jù)體表面積計算給藥劑量，含藥血清組予23.02 g/kg健脾養(yǎng)正消癥湯灌胃，對照血清組予0.9%氯化鈉注射液4 mL灌胃，每日2次，連續(xù)3 d。第4日禁食不禁水12 h，一次性灌胃全天劑量后1 h，大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉，腹主動脈取血，37 ℃靜置4 h，2 000 r/min離心15 min，分離血清，混合同組血清后，0.22 μm醋酸纖維素膜過濾2次，56 ℃水浴30 min，-80 ℃冰箱保存。

1.2.3 細(xì)胞分組

將HGC-27、AGS細(xì)胞分別分為含藥血清組（79%RPMI-1640培養(yǎng)基+20%大鼠含藥血清+1%青-鏈霉素）和對照血清組（79%RPMI-1640培養(yǎng)基+20%大鼠對照血清+1%青-鏈霉素）。每組設(shè)置3個重復(fù)，將細(xì)胞置于無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 h后再進(jìn)行后續(xù)處理。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

取對數(shù)生長期HGC-27、AGS細(xì)胞接種至6孔板，根據(jù)不同分組采用相應(yīng)培養(yǎng)基作用48 h，收集HGC-27、AGS細(xì)胞，加70%乙醇4 ℃固定過夜；PBS沖洗2次，加入RNase，37 ℃水浴30 min；PBS再次洗滌2次后，加入碘化丙啶（PI），4 ℃避光染色30 min，400目濾網(wǎng)過濾1次，1 000 r/min離心5 min，棄去PBS，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.2.5 糖酵解水平檢測

HGC-27、AGS細(xì)胞根據(jù)不同分組采用相應(yīng)培養(yǎng)基作用48 h，收集HGC-27、AGS細(xì)胞，8 000 r/min離心10 min，收集上清液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，濾液-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。按葡萄糖檢測試劑盒（葡萄糖氧化酶法）、乳酸檢測試劑盒說明書檢測細(xì)胞葡萄糖攝取量、乳酸生成量。

1.2.6 Western blot檢測己糖激酶2蛋白表達(dá)水平

HGC-27、AGS細(xì)胞根據(jù)不同分組采用相應(yīng)培養(yǎng)基作用48 h，加RIPA，于冰上裂解20 min，13 000 r/min離心5 min，吸取上清液，采用蛋白質(zhì)定量試劑盒（BCA法）測定蛋白濃度。取適量蛋白制膠上樣，凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉的Tris緩沖液封閉。2 h后用PBS清洗3次，加入稀釋后的一抗（1∶1 000），4 ℃搖床孵育過夜。棄一抗液，PBS清洗膜后，加入二抗（1∶6 000），室溫下振蕩孵育1 h。清洗膜后，加入ECL液顯影，使用凝膠成像系統(tǒng)顯影拍照。以Actin為參照，采用Image J軟件分析灰度值，計算蛋白相對表達(dá)量。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料以表示，滿足正態(tài)分布時，2組間比較采用t檢驗或非參數(shù)檢驗，多組間比較采用方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果

2.1.1 健脾養(yǎng)正消癥湯活性成分及靶點

共收集健脾養(yǎng)正消癥湯的活性成分181種，其中黃芪20種、黨參24種、白術(shù)7種、當(dāng)歸2種、白芍13種、陳皮5種、三棱5種、莪術(shù)3種、石見穿3種、白花蛇舌草7種、甘草92種。共得到藥物活性成分靶點4 094個，其中黃芪615個、黨參511個、白術(shù)249個、當(dāng)歸96個、白芍316個、陳皮223個、三棱181個、莪術(shù)157個、石見穿290個、白花蛇舌草444個、甘草1 012個，剔除重復(fù)后獲得1 179個靶點。

2.1.2 胃癌糖代謝相關(guān)靶點

通過GenCards數(shù)據(jù)庫檢索與篩選，共獲得176個疾病相關(guān)靶點，對疾病與藥物靶點映射后，選取潛在作用靶點37個。經(jīng)靶點比對，獲得124個活性成分，建立中藥成分與靶點關(guān)系。

2.1.3 中藥-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

借助Cytoscape3.9.1構(gòu)建中藥-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，并應(yīng)用CytoNCA插件對該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，得到DC中位數(shù)為3，BC中位數(shù)為44.577 09，CC中位數(shù)為0.407 714，三者均大于中位數(shù)的節(jié)點被認(rèn)為是該網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點，前20個節(jié)點見表1。健脾養(yǎng)正消癥湯作用于胃癌糖代謝途徑主要活性成分見表2。對關(guān)鍵節(jié)點中的活性成分構(gòu)建中藥-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)由149個節(jié)點和402條邊組成，見圖1。

圖1 健脾養(yǎng)正消癥湯作用于胃癌糖代謝途徑中藥-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

表2 健脾養(yǎng)正消癥湯作用于胃癌糖代謝途徑活性成分

2.1.4 核心基因互作網(wǎng)絡(luò)

通過STRING對37個潛在基因構(gòu)建PPI關(guān)系，經(jīng)Cytoscape3.9.1處理，結(jié)果見圖2。利用Cytoscape軟件對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治觯渲蠦C、CC、DC均大于其中位數(shù)的基因共14個，見表3。其中GAPDH、HIF1A、HSP90AA1、ALB、EGFR、HSPA5、PPARG、SLC2A1、HK2等具有較多的互作關(guān)系，選取為核心基因進(jìn)一步研究靶點的功能。

圖2 健脾養(yǎng)正消癥湯作用于胃癌糖代謝途徑靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

表3 健脾養(yǎng)正消癥湯作用于胃癌糖代謝途徑核心靶點

2.1.5 富集分析結(jié)果

通過R語言對健脾養(yǎng)正消癥湯作用于胃癌糖代謝途徑的37個潛在靶點進(jìn)行GO、KEGG和DO富集分析。GO富集分析得到1 016條結(jié)果，其中生物過程（BP）900條、細(xì)胞組成（CC）63條、分子功能（MF）113條，主要包括前體代謝物和能量的產(chǎn)生、對營養(yǎng)水平的反應(yīng)、對細(xì)胞外刺激的反應(yīng)、NADP代謝過程等生物過程，囊泡腔、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、黑色素體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶復(fù)合體等細(xì)胞組成，NADP結(jié)合、泛素蛋白連接酶結(jié)合、ATP水解活性等分子功能。見圖3。KEGG通路富集分析得到46條通路，前20條通路見圖4，其中碳代謝、HIF-1信號通路、糖酵解/糖異生、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、癌癥中的中心碳代謝等通路與健脾養(yǎng)正消癥湯作用于胃癌糖代謝途徑密切相關(guān)。DO富集分析得到200個條目，包括胃癌在內(nèi)的多種癌癥，前20個條目見圖5。

圖3 健脾養(yǎng)正消癥湯作用于胃癌糖代謝途徑靶點GO富集分析

圖4 健脾養(yǎng)正消癥湯作用于胃癌糖代謝途徑靶點KEGG通路富集分析

圖5 健脾養(yǎng)正消癥湯作用于胃癌糖代謝途徑靶點DO富集分析

2.1.6 分子對接

選取3個主要活性成分槲皮素（MOL000098）、柚皮素（MOL004328）、光甘草定（MOL004908）與10個顯著表達(dá)的基因GAPDH、HIF1A、HSP90AA1、ALB、EGFR、HSPA5、PPARG、SLC2A1、HK2、PGK1進(jìn)行分子對接模擬，結(jié)果見圖6。通常認(rèn)為，結(jié)合能＜0 kcal/mol則小分子配體和受體蛋白能夠自發(fā)結(jié)合，結(jié)合能＜-5.0 kcal/mol表明結(jié)合活性良好[8]。對接結(jié)果顯示，健脾養(yǎng)正消癥湯主要活性成分與靶點均可以自發(fā)結(jié)合，平均最低結(jié)合能為-7.36 kcal/mol。其中HK2、EGFR與活性成分結(jié)合能最低，其對接模式見圖7。

圖6 健脾養(yǎng)正消癥湯主要活性成分與核心靶點對接結(jié)合能熱圖

圖7 健脾養(yǎng)正消癥方主要活性成分與靶點分子對接模式

2.2 細(xì)胞實驗結(jié)果

2.2.1 健脾養(yǎng)正消癥湯對HGC-27、AGS細(xì)胞凋亡的影響

與對照血清組比較，含藥血清組細(xì)胞凋亡率均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見圖8。

圖8 2組HGC-27、AGS細(xì)胞凋亡率比較（）

2.2.2 健脾養(yǎng)正消癥湯對HGC-27、AGS細(xì)胞己糖激酶2蛋白表達(dá)的影響

與對照血清組比較，含藥血清組HGC-27、AGS細(xì)胞HK2蛋白表達(dá)明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見圖9。

圖9 2組HGC-27、AGS細(xì)胞HK2蛋白表達(dá)比較（）

2.2.3 健脾養(yǎng)正消癥湯對HGC-27、AGS細(xì)胞有氧糖酵解水平的影響

與對照血清組比較，含藥血清組HGC-27、AGS細(xì)胞葡萄糖攝取量明顯減少（P＜0.05），乳酸生成量明顯減少（P＜0.01）。見圖10。

圖10 2組HGC-27、AGS細(xì)胞有氧糖酵解水平比較（）

3 討論

胃癌以本虛標(biāo)實、虛實夾雜為主要病機(jī)，“本虛”以脾胃虛弱，“標(biāo)實”以水濕、痰濁、瘀血與癌毒邪氣搏結(jié)而積聚成塊[9]。胃癌細(xì)胞的能量代謝與其生長、增殖、侵襲、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化等惡性生物學(xué)過程密切相關(guān)，腫瘤細(xì)胞在快速生長過程中過度消耗機(jī)體內(nèi)能量，加重機(jī)體氣血缺乏、正氣不足的病理狀態(tài)。機(jī)體局部氣血阻滯，血脈不暢，氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)匱乏，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞糖酵解的產(chǎn)生。健脾養(yǎng)正消癥湯正是依據(jù)脾氣虛損之“本虛”和癥瘕積聚之“標(biāo)實”病機(jī)立方，由黃芪、黨參、麩炒白術(shù)、莪術(shù)、三棱、石見穿等11味中藥組成，諸藥并用，可扶正健脾益氣以補中氣、養(yǎng)營血，兼顧行氣滯、利濕濁、消癥結(jié)、解癌毒功效。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果顯示，槲皮素、柚皮素、光甘草定、山柰酚等為健脾養(yǎng)正消癥湯作用于胃癌糖代謝途徑發(fā)揮作用的有效成分。槲皮素、柚皮素、光甘草定、山柰酚均為具有活性的黃酮類化合物，對腫瘤細(xì)胞能量代謝有一定調(diào)控作用。槲皮素可通過靶向葡萄糖代謝所需關(guān)鍵酶來減少糖酵解[10]，如槲皮素通過抑制己糖激酶表達(dá)，促使腫瘤細(xì)胞的糖酵解程序陷入紊亂，誘發(fā)凋亡信號通路，促進(jìn)腫瘤凋亡[11]。光甘草定作為黃酮類化合物，也可以減少葡萄糖攝取、抑制糖酵解、下調(diào)HK2和乳酸脫氫酶A表達(dá)[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，光甘草定能夠抑制糖酵解途徑而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的能量代謝，通過抑制葡萄糖轉(zhuǎn)運子1蛋白表達(dá)減少MDA-MB-231細(xì)胞對葡萄糖的攝入，降低細(xì)胞內(nèi)ATP水平、乳酸脫氫酶活性、乳酸濃度[13]。山柰酚抑制HK2和電壓依賴性陰離子通道蛋白1的線粒體結(jié)合而削弱有氧糖酵解，對抗腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移[14]，同時靶向相關(guān)基因和通路干預(yù)腫瘤細(xì)胞的糖酵解[15-16]，從而起到抗腫瘤作用。

KEGG富集分析所涉及的通路有碳代謝、HIF-1信號通路、糖酵解/糖異生、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、癌癥中的中心碳代謝通路。碳細(xì)胞在惡性轉(zhuǎn)化過程中需要特異性的新陳代謝途徑來維持成長和生存，包括糖酵解、失調(diào)的三羧酸循環(huán)和戊糖磷酸途徑等[17]。碳代謝信號通路和癌癥中的中心碳代謝通路可以影響腫瘤至關(guān)重要的代謝網(wǎng)絡(luò)，在腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移和對治療的抗性中起著關(guān)鍵作用[18]。糖酵解/糖原異生是腫瘤細(xì)胞能量代謝的主要途徑，腫瘤細(xì)胞優(yōu)先利用糖酵解產(chǎn)生能量，通過影響糖酵解途徑可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長[19]。HIF-1信號通路在控制腫瘤對缺氧的反應(yīng)中起著重要作用，通過HIF-1轉(zhuǎn)錄因子實現(xiàn)葡萄糖代謝的重新編程?？梢娊∑B(yǎng)正消癥湯可通過干預(yù)腫瘤代謝途徑起到治療胃癌的作用。

本研究得到健脾養(yǎng)正消癥湯作用于胃癌糖代謝途徑關(guān)鍵靶點有GAPDH、HIF1A、HSP90AA1、ALB、EGFR、HSPA5、PPARG、SLC2A1、HK2、PGK1。分子對接結(jié)果顯示，健脾養(yǎng)正消癥湯有效活性成分和靶點蛋白的結(jié)合性能良好，其中HK2與活性成分具有較強的結(jié)合活性。己糖激酶在糖酵解中起到至關(guān)重要的作用，其中同工酶HK2與腫瘤細(xì)胞的能量代謝緊密相關(guān)，對糖酵解過程起到調(diào)控作用，在多種癌細(xì)胞中呈現(xiàn)過表達(dá)，參與了腫瘤發(fā)生發(fā)展甚至轉(zhuǎn)移過程[20-22]。HK2作為糖酵解中的限速酶，其表達(dá)量及活性增加為腫瘤組織的生物學(xué)過程提供了足夠的能源[23-24]。胃癌腫瘤細(xì)胞中具有異?；钴S的能量代謝，通過異常的糖代謝過程來逃避正常的細(xì)胞凋亡程序，增強癌細(xì)胞增殖和遷移能力，其反應(yīng)過程受到HK2的影響。已有實驗表明，多種中藥成分可通過降低胃癌細(xì)胞HK2表達(dá)，減少細(xì)胞葡萄糖消耗和乳酸產(chǎn)生，抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[25]。本研究細(xì)胞實驗發(fā)現(xiàn)，健脾養(yǎng)正消癥湯干預(yù)胃癌細(xì)胞后，胃癌細(xì)胞凋亡率明顯升高，胃癌細(xì)胞葡萄糖消耗率及乳酸產(chǎn)量均明顯降低，同時，Western blot結(jié)果顯示，HK2蛋白表達(dá)受到抑制。因此，證明健脾養(yǎng)正消癥方能夠在體外抑制胃癌細(xì)胞的有氧糖酵解水平，促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，通過網(wǎng)絡(luò)藥理分析發(fā)現(xiàn)健脾養(yǎng)正消癥湯有效活性成分可作用于HK2靶點蛋白，干預(yù)胃癌細(xì)胞糖代謝過程，并通過細(xì)胞實驗進(jìn)行驗證。本研究中健脾養(yǎng)正消癥湯展現(xiàn)對胃癌細(xì)胞增殖的抑制效果，表明胃癌患者聯(lián)用中藥干預(yù)有助于減緩腫瘤的增長速率，從而使其臨床進(jìn)一步獲益。本實驗僅針對HK2靶點蛋白表達(dá)進(jìn)行了驗證，沒有進(jìn)一步研究健脾養(yǎng)正消癥湯干預(yù)HK2的具體通路及其他相關(guān)蛋白表達(dá)情況，存在一定局限性。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析得到健脾養(yǎng)正消癥湯干預(yù)胃癌糖代謝途徑的多個靶點及通路，后續(xù)將在本研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步拓展健脾養(yǎng)正消癥湯干預(yù)腫瘤糖代謝治療胃癌的機(jī)制研究。