青稞酸性磷酸酶基因 HvnACP2克隆和亞細(xì)胞定位研究

安立昆,任晴雯,姚曉華,姚有華,吳昆侖

(1.青海大學(xué) 農(nóng)林科學(xué)院,西寧 810016;2.青海省青稞遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西寧 810016;3.國家麥類改良中心青海青稞分中心,西寧 810016)

青稞(HordeumvulgareL. var.nudumHook. f.)是大麥的變種,由于其穎殼與籽粒分離,也稱為裸大麥。青稞籽粒富含纖維素、蛋白質(zhì)、維生素、β-葡聚糖,是重要的糧食、飼料和食品加工原料,青稞是最具有青藏高原地區(qū)特色的作物之一[1-4]。青藏高原地區(qū)氣候極為惡劣,尤其是土壤極為貧瘠,長期的進(jìn)化和篩選使得青稞對貧瘠的土壤具有較強(qiáng)的適應(yīng)性[5-6]。隨著青稞新品種的不斷推廣,種植面積逐年增大,已成為青海省農(nóng)業(yè)獨(dú)具地方特色的作物,在青海省農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)中占有重要地位[7-9]。

磷是植物三大營養(yǎng)素之一,其重要性僅次于氮元素,磷元素的缺乏對作物的產(chǎn)量和品質(zhì)有著嚴(yán)重的影響。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的磷肥主要源于磷礦開采,作為不可再生資源全球磷礦儲量都在不斷下降,尤其在中國由于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中磷肥的利用效率不高,施入土壤中的磷不能得到有效利用,流失后反而對生態(tài)環(huán)境造成影響[10]。在土壤中大部分有效磷會被土壤吸附和固定,極難溶解和轉(zhuǎn)移,即使磷含量較高的土壤中也只有少量磷元素可被植物吸收和利用,在土壤中植物對磷的利用效率遠(yuǎn)低于其他元素[11-13]。青藏高原地區(qū)是青稞的主產(chǎn)區(qū),土壤極為貧瘠,生態(tài)極為脆弱,過量施用磷肥會導(dǎo)致更嚴(yán)重的生態(tài)災(zāi)難,不利于青藏高原地區(qū)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。所以研究青稞磷吸收和利用相關(guān)基因,提高其對土壤中的磷利用率對于減少青稞生產(chǎn)中的磷肥施用,促進(jìn)青稞生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

酸性磷酸酶(Acid Phospoatase,ACP)是植物體中廣泛存在的一種水解酶,可以水解磷酸酯并釋放出磷酸,在低磷條件下植物體內(nèi)尤其是根系會分泌大量酸性磷酸酶促進(jìn)有機(jī)磷的水解,在植物磷吸收和利用方面有著重要作用[13-14]。酸性磷酸酶基因?qū)儆谝活惛叨缺Ｊ氐幕蚣易?不同家族成員通過不同的表達(dá)模式調(diào)控在植物體中發(fā)揮作用,維持植物體中磷元素的吸收和利用[15]。Zhang等[16]采用全基因組關(guān)聯(lián)GWAS鑒定到了一個(gè)大豆磷高效利用基因GmACP1,在大豆中過表達(dá)GmACP1基因可以明顯提高大豆對磷的利用效率,并認(rèn)為GmACP1P基因?yàn)橥ㄟ^分子育種手段準(zhǔn)確培育磷高效利用大豆品種提供了基礎(chǔ)。李靖怡[17]對水稻OsACP1進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)OsACP1在水稻中只受低磷的誘導(dǎo)表達(dá),在水稻中過表達(dá)OsACP1會使正常生長條件下的水稻出現(xiàn)磷中毒癥狀,在缺磷培養(yǎng)條件下恢復(fù)正常,OsACP1定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體膜上,認(rèn)為OsACP1的功能可能是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體膜中代謝磷酸乙醇胺和磷酸膽堿等有機(jī)磷,維持缺磷條件下細(xì)胞中的磷穩(wěn)態(tài)。

目前關(guān)于酸性磷酸酶的研究主要集中在水稻、玉米、小麥、大豆等主要作物中,關(guān)于青稞中酸性磷酸酶基因尚未見研究報(bào)道。本試驗(yàn)從青稞‘肚里黃’中克隆得到酸性磷酸酶基因HvnACP1對其基因和蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析,并對其亞細(xì)胞定位進(jìn)行研究。為青稞磷高效利用相關(guān)基因研究和利用分子育種手段進(jìn)行磷高效利用品種培育提供一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

青稞品種‘肚里黃’和本氏煙草(Nicotianabenthamiana)由青海省青稞遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存,青稞和煙草于2021年4月種植于青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院實(shí)驗(yàn)溫室中。摘取生長10 d后青稞的第3葉片進(jìn)行DNA和RNA提取。采用生長1月后的煙草第3或第4葉片進(jìn)行試驗(yàn)。

PCR及其產(chǎn)物連接、cDNA合成、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞分別采用北京全式金有限公司的TransTaq○RDNA Polymerase High Fidelity(AP131-01)試劑盒,pEASY○R-Blunt Cloning Kit(CB101-01)試劑盒,TransScript○RFirst-Strand cDNA Synthesis SuperMix(AT301-02)試劑盒以及Trans1-T1大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。BP和LR反應(yīng)試劑盒購自Invitrogen公司。引物合成和測序由北京擎科生物科技有限公司完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 青稞DNA、RNA提取和cDNA合成 采用尿素法[18-19]提取青稞葉片DNA,TRIzol法提取RNA。cDNA合成參照TransScript○RFirst-Strand cDNA Synthesis SuperMix(AT301-02)試劑盒說明完成,所有樣品置于-20 ℃保存。

1.2.2HvnACP2基因和啟動子區(qū)域序列克隆 將已報(bào)道的谷子酸性磷酸酶基因SiACP序列輸入NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中進(jìn)行搜索獲得大麥的HvACP基因序列和結(jié)構(gòu)信息[14]。根據(jù)大麥HvACP2基因序列及起始密碼子ATG前2 000 bp左右序列設(shè)計(jì)引物?；蚩寺≌蛞?F:5′-ATGGAGGTGCTCGCGG-3′,反向引物:R:5′-CTAGTTGGTGTGGGTT-3′。啟動子區(qū)域序列克隆正向引物:F:5′-ATGTAATGTTGTAGTTTATTGC-3′反向引物:R:5′-GGCGTGCGCCGCTAGGAG-3′。采用PCR以cDNA為模板克隆HvnACP2cDNA序列,以基因組DNA為模板克隆HvnACP2啟動子區(qū)域序列。按以下程序進(jìn)行擴(kuò)增:94 ℃ 2 min;98 ℃ 10 s, 58 ℃ 30 s,68 ℃ 1 min(擴(kuò)增啟動子區(qū)域序列為2 min),35個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完畢后對PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,確定PCR產(chǎn)物片段大小無誤后,參照pEASY-Blunt Cloning試劑盒說明書,將PCR產(chǎn)物進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌,篩選陽性克隆并送測序。獲得cDNA序列后采用DNAMAN7對cDNA序列中的ORF區(qū)域進(jìn)行翻譯獲得HvnACP蛋白 序列。

1.2.3 青稞HvnACP2生物信息學(xué)分析 采用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對啟動子區(qū)域元件進(jìn)行預(yù)測;采用Protparam(https://web.expasy.org/protparam/)對蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測分析;采用TMHMM Server v. 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對蛋白跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析;采用kinasephos2(http://kinasephos2.mbc.nctu.edu.tw/)對蛋白磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測分析;采用SignalP(http://www. Cbs. Dtu. Dk /services /SignalP/)對蛋白信號肽進(jìn)行預(yù)測分析;采用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)對蛋白二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析;采用蛋白同源建模軟件Swiss-Model(http://swissmodel.expasy.org/)進(jìn)行蛋白三級結(jié)構(gòu)同源建模。

在植物基因組數(shù)據(jù)庫Gramene(http://www.gramene.org/)和NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中進(jìn)一步搜索得到其他植物的同源蛋白序列:象草(Cenchruspurpureus)CpACP2、狗尾草(Setariaviridis)SvACP2、黍(Setariaviridisvar.hallii)PhACP2、糜子(Panicummiliaceum)PmACP2、福尼奧小米(Digitariaexilis)DeACP2、南荻(Miscanthus lutarioriparius)MlACP2、玉米(ZeamaysL.)ZmACP2、康藏嵩草(Carexlittledalei)ClACP2、番茄(Solanumlycopersicum)SlACP2、藍(lán)星睡蓮(Nymphaeacolorata)NcACP2、油菜(Brassicanapus)BnACP2、煙草(Nicotianaattenuata)MaACP2、粳稻(OryzasativaL.subsp. Japonica)OsACP2、秈稻(OryzasativaL.subsp. Indica)OsACP2、二型花(Dichantheliumoligosanthes)DoACP2、小米(Setariaitalica)SiACP2、彎葉畫眉草(Eragrostiscurvula)EcACP2、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)BdACP2、小麥(Triticumaestivum)TaACP2、野甘藍(lán)(Brassicaoleraceavar.oleracea)BoACP2、蘿卜(Raphanussativus)RsACP2、鹽芥(Eutremasalsugineum)、EsACP2、小菥蓂(Microthlaspierraticum)MeACP2、筷子芥(Arabisnemorensis)AnACP2、薺藍(lán)(Camelinasativa)CsACP2、薺菜(Capsellarubella)CrACP2。采用DNAMAN 7.0將青稞HvnACP2蛋白序列與大麥、水稻、二穗短柄草、煙草、番茄的同源蛋白進(jìn)行序列比對,并根據(jù)NCBI中提供的相應(yīng)蛋白信息分析結(jié)構(gòu)域和關(guān)鍵位點(diǎn)。采用MEGA7對所有植物的同源蛋白序列以最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 亞細(xì)胞定位表達(dá)載體構(gòu)建 采用載體pSATN1-mkate利用gatway技術(shù)構(gòu)建亞細(xì)胞定位載體。設(shè)計(jì)帶有attB位點(diǎn)的引物對HvnACP2CDS序列進(jìn)行PCR克隆,回收PCR產(chǎn)物后,按照BP和LR反應(yīng)試劑盒說明書完成載體構(gòu)建,并對載體進(jìn)行測序驗(yàn)證。將構(gòu)建好的載體通過凍融法轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌EHA105中。制備好農(nóng)桿菌重懸液后將菌液注射入煙草葉片下表皮,放入完全黑暗環(huán)境,溫度22 ℃,培養(yǎng)3 d后將葉片切成1 cm2大小,放置于Nikon C2-ER激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 青稞 HvnACP2基因生物信息分析

2.1.1 基因結(jié)構(gòu)和啟動子功能元件預(yù)測分析 測序結(jié)果表明青稞HvnACP2和大麥HvnACP2基因和啟動子區(qū)域DNA序列完全一致。根據(jù)植物基因組數(shù)據(jù)庫Gramene中獲得的大麥HvACP2基因結(jié)構(gòu)信息分析,青稞HvnACP2含有2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子(圖1)。

圖1 青稞 HvnACP2基因結(jié)構(gòu)Fig.1 Gene structure of HvnACP2

將克隆得到的HvACP2基因啟動子區(qū)域序列輸入啟動子元件分析網(wǎng)站PlantCARE中進(jìn)行分析(表1)。發(fā)現(xiàn)HvnACP2啟動子區(qū)域具有大量的TATA-box和CAAT-box啟動子核心元件,3個(gè)脫落酸響應(yīng)元件2個(gè)茉莉酸響應(yīng)元件,此外還有1個(gè)分生組織表達(dá)順式作用元件,8個(gè)光響應(yīng)元件,1個(gè)厭氧響應(yīng)元件,2個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。

2.1.2 青稞HvnACP2蛋白理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)分析 通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測分析發(fā)現(xiàn) HvnACP2由454個(gè)氨基酸組成,為親水性穩(wěn)定蛋白(表2)。HvnACP不具有跨膜結(jié)構(gòu)(圖2),有絲氨酸(Ser)5個(gè),蘇氨酸(Thr)2個(gè),酪氨酸(Tyr)5個(gè)共12個(gè)磷酸化位點(diǎn)(圖3)。具有信號肽序列:MEVLAVLFLLAAHAASA,切割位點(diǎn)在第17至18位氨基酸之間(圖4)。HvnACP2二級結(jié)構(gòu)蛋白結(jié)構(gòu)α螺旋共85個(gè)、無規(guī)則卷曲共245個(gè)、延長鏈共107個(gè),β轉(zhuǎn)角共17個(gè)分別占氨基酸總數(shù)的18.72%、53.96%、23.57%、3.74%,其三級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析結(jié)果基本一致(圖5和圖6)。

表2 青稞HvnACP蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析Table 2 Physical and chemical properties of HvACP2 protein

圖2 青稞HvnACP2蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測分析Fig.2 Transmembrane structure prediction of HvnACP2 protein

圖3 青稞HvnACP2蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測Fig.3 Prediction of HvnACP2 phosphorylation sites

圖4 青稞HvnACP2蛋白信號肽預(yù)測Fig.4 Prediction of HvnACP2 signal peptide

藍(lán)色.α螺旋;紅色.延伸鏈;橙色.無規(guī)則卷曲;綠色.β轉(zhuǎn)角

圖6 青稞 HvnACP2三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析Fig.6 Tertiary structure prediction of HvnACP2

2.1.3 HvnACP2蛋白氨基酸序列對比和同源進(jìn)化分析 蛋白序列分析發(fā)現(xiàn)大麥 HvACP2和HvnACP2蛋白序列完全一致,進(jìn)一步與水稻、二穗短柄草、煙草、番茄的同源蛋白序列分析發(fā)現(xiàn)其都具有信號肽結(jié)構(gòu)、紫色酸性磷酸酶結(jié)構(gòu)域、金屬磷酸酶結(jié)構(gòu)域和相同的金屬離子結(jié)合位點(diǎn)(圖7)。將青稞HvnACP2與28種植物的ACP2蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,發(fā)現(xiàn)大麥HvACP2和青稞HvnACP2與小麥TaACP2親緣關(guān)系最近(圖8)。

圖7 HvnACP2蛋白氨基酸序列對比分析Fig.7 Amino acid sequence alignment of HvnACP2 with homologous genes of other species

圖8 青稞HvnACP2與其他植物同源蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.8 Phylogenetic tree of HvnACP2 with other species

2.2 HvnACP2亞細(xì)胞定位研究

將帶有載體pSATN1- HvnACP2::mkate的農(nóng)桿菌EHA105注射入煙草葉片中,對HvnACP2進(jìn)行亞細(xì)胞定位研究發(fā)現(xiàn)紅色熒光信號分布于細(xì)胞膜上,說明HvnACP2定位于細(xì)胞膜上(圖9)。

a～d.分別為35::mkate空載體熒光場、葉綠體自發(fā)熒光場、明場和疊加場;e～h.分別為35:HvnACP2-mkate熒光場、葉綠體自發(fā)熒光場、明場和疊加場

3 結(jié)論與討論

酸性磷酸酶家族是植物利用磷元素重要的基因家族之一。酸性磷酸酶按功能可分為細(xì)胞內(nèi)和分泌型的兩類。細(xì)胞內(nèi)的酸性磷酸酶可以將衰老組織中的磷素進(jìn)行再利用,分泌型的酸性磷酸酶可分泌到細(xì)胞外活化被土壤吸附的磷,將土壤中的有機(jī)磷轉(zhuǎn)化為無機(jī)磷,然后供植物體的利用,酸性磷酸酶對植物在應(yīng)對低磷脅迫應(yīng)答中具有重要的作用[20]。有一些研究報(bào)道酸性磷酸酶在調(diào)控植物碳代謝、細(xì)胞壁合成和抗病等方面有重要的作用[21]。

本研究克隆了酸性磷酸酶HvnACP2基因和啟動子區(qū)域序列,對其基因和蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析,并對其亞細(xì)胞定位進(jìn)行研究。很多研究表明大部分植物酸性磷酸酶都具有信號肽結(jié)構(gòu),但不同的植物酸性磷酸酶亞細(xì)胞定位位置不同,有定位于細(xì)胞質(zhì)、質(zhì)膜、細(xì)胞壁甚至細(xì)胞外[22-26]。侯立江等[27]對西爾斯山羊草紫色酸性磷酸酶PAP1進(jìn)行分析也發(fā)現(xiàn)其具有信號肽結(jié)構(gòu),PAP1蛋白包含金屬離子結(jié)合中心,預(yù)測它屬于金屬蛋白,亞細(xì)胞定位預(yù)測分析其定位于質(zhì)膜的概率最高。本研究發(fā)現(xiàn)青稞HvnACP2同樣具有信號肽、金屬磷酸酶結(jié)構(gòu)域和金屬離子結(jié)合位點(diǎn),并且定位于細(xì)胞質(zhì)膜上。通過與其他物種的同源蛋白序列進(jìn)行對比并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)其系統(tǒng)進(jìn)化樹并沒有分為典型的單雙子葉兩支,與大麥和青稞親緣關(guān)系最近的是小麥TaACP2。趙雄偉等[14]對谷子酸性磷酸酶ACP家族基因進(jìn)行鑒定并對其中的SiACP1耐低磷單倍型進(jìn)行分析共發(fā)現(xiàn)了谷子中的13個(gè)ACP家族基因,生物信息學(xué)研究表明其蛋白都具有高度保守的磷酸酶結(jié)構(gòu)域,谷子ACP家族基因與其他植物構(gòu)建進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn),單雙子葉植物ACP基因呈現(xiàn)明顯的分化,通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)ACP基因家族中不同成員的表達(dá)模式各有差異,通過基因關(guān)聯(lián)和單倍型分析發(fā)現(xiàn)SiACP1啟動子上的一個(gè)SNP與耐低磷相關(guān)性狀顯著相關(guān)。李睿等[15]對蘋果紫色酸性磷酸酶相關(guān)基因MdPAP10進(jìn)行克隆和研究發(fā)現(xiàn)MdPAP10基因包含5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子,其蛋白具有信號肽并包含一個(gè)磷酸酶結(jié)構(gòu)域,MdPAP10在蘋果根中表達(dá)量最高,葉片次之,果實(shí)中表達(dá)量最低,低磷培養(yǎng)條件下根中的MdPAP10受誘導(dǎo)表達(dá)明顯,葉片中的表達(dá)量沒有明顯變化,在蘋果愈傷組織中過表達(dá)MdPAP10可以提高其對低磷脅迫的耐受性,并且可以促進(jìn)其他磷吸收利用基因MdPHT1.1、MdPT2和MdPHO1等相關(guān)基因表達(dá)。

青稞作為青藏高原地區(qū)的特有作物,減少青稞生產(chǎn)中的化肥施用是保障青藏高原地區(qū)農(nóng)業(yè)生態(tài)和青稞產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵之一。目前關(guān)于青稞中磷高效利用的基因研究報(bào)道極少。本研究克隆了青稞酸性磷酸酶HvnACP2基因,并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和亞細(xì)胞定位研究,為青稞磷高效利用基因研究和分子育種提供了一定基礎(chǔ)。