甘肅省辣椒炭疽病菌的分離鑒定及生物學特性

張翠文,魏立娟,楊成德

(甘肅農(nóng)業(yè)大學 植物保護學院,甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實驗室,蘭州 730070)

辣椒(Capsicumannuum),為木蘭綱茄科辣椒屬植物,起源于中南美洲熱帶地區(qū)[1],不僅含有豐富的維生素C、辣椒紅素、辣椒堿、蛋白質(zhì)和類胡蘿卜素等營養(yǎng)物質(zhì)[2],而且含有芳香族化合物[3],是天然新型抗氧化劑,具有降低膽固醇以及體內(nèi)氧化應激的特性[4-5],有“藥食同源性植物”的稱號,在全球范圍內(nèi)廣泛栽培。目前,中國辣椒產(chǎn)量約占世界總產(chǎn)量的1/3[6],然而隨著日光溫室栽培面積的不斷擴大以及氣候條件的影響,辣椒炭疽病的發(fā)生和危害程度日趨嚴重,在辣椒采前采后均可造成為害,其病果率可達10%左右,每年因炭疽病造成的損失可達30%～40 %[7],因此炭疽病已成為辣椒生產(chǎn)中的重要病害之一。

辣椒炭疽病是由無性型真菌炭疽菌屬(Colletotrichum)引起[8],在印度最早報道[9]。目前,危害中國辣椒的病原菌主要有膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)、球炭疽菌(C.coccodes)、尖孢炭疽菌(C.acutatum)、平頭炭疽菌(C.truncatum,即C.capsici)和黑色炭疽菌(C.nigrum)[10-11]。Than等[12]于2008年從泰國辣椒中分離到C.scovillei,但當時鑒定為C.acutatum,2012年Damm等[13]修正為C.scovillei,并認為C.scovillei是C.acutatum復合體D3分支中的物種之一,2014年Kanto等[14]從日本甜椒中分離出了C.scovillei,2016年Liu等[15]在中國四川辣椒上分離到C.scovillei,并證實C.scovillei比其他5種炭疽菌致病力強。自發(fā)現(xiàn)C.scovillei為害辣椒以來,研究多集中于病原鑒定和致病性測定等[16-18],生物學特性方面的研究較少。近年來,甘肅省辣椒病害主要有辣椒疫病、根腐、青枯病、炭疽病、白粉病、病毒病等,2020年在天水市辣椒種植區(qū)觀察到有炭疽病的發(fā)生,一般田塊病葉率在10%左右,重病田達25%。因此,本試驗通過柯赫氏法則、形態(tài)學鑒定和多基因聯(lián)合分析,鑒定引起甘肅省天水市辣椒炭疽病的致病菌種類,測定其生物學特性,以期為病害診斷和防治策略的制定提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株:于甘肅省天水市辣椒種植區(qū)采集具有典型炭疽病的辣椒病葉。

供試培養(yǎng)基:PDA培養(yǎng)基、查氏(Czapek)培養(yǎng)基、蛋白胨液體培養(yǎng)基,配制方法參閱方中達[19]《植病研究方法》配制。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌的分離純化 通過組織分離法[19]從發(fā)病辣椒葉片中分離病原物。選取具典型癥狀的辣椒病葉,用滅菌刀在病健交界處取0.5 cm×0.5 cm的組織塊,將其放入75%酒精中消毒 1 min,后用無菌水沖洗3次,無菌濾紙吸干多余水分后,將組織塊轉(zhuǎn)移至PDA平板上,每皿均勻放置5塊,25 ℃恒溫黑暗培養(yǎng),待組織塊周圍長出菌絲后,挑取菌絲轉(zhuǎn)接到新的PDA平板上,經(jīng)單孢分離獲得純種菌株,將其編號并在4 ℃冰箱保存以備用。

1.2.2 致病性測定 孢子懸浮液的制備:在經(jīng)活化的菌落邊緣用5 mm打孔器取10個菌餅,放入盛有5%蛋白胨液體培養(yǎng)基的三角瓶中,封口后置于恒溫搖床(25 ℃,180 rmin-1)振蕩培養(yǎng)6 h,以獲得孢子懸浮液。

噴霧接種:取健康的辣椒植株和離體果實。果實經(jīng)75%乙醇消毒1 min,再用無菌蒸餾水沖洗5次,后放入墊有濾紙的無菌托盤中備用。用無菌針頭輕輕劃傷葉片和果實造成微傷口,然后用分離物孢子懸浮液進行噴霧接種[20],以噴霧無菌水為空白對照,重復3次。保濕48 h后將離體果實置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱,活體植株置于溫室。待葉片和果實發(fā)病后,觀察發(fā)病癥狀,并對發(fā)病部位再次分離純化。

1.2.3 病原菌的鑒定 形態(tài)學鑒定:將病原菌在25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)7 d,連續(xù)記錄形態(tài)特征和培養(yǎng)性狀,顯微觀察病原菌的載孢體結構和分生孢子形態(tài),隨機測量50個分生孢子和20個載孢體的大小,根據(jù)形態(tài)學特征對病原菌做初步鑒定[21]。

基因序列分析鑒定:DNA提取:根據(jù)OMEGA BIO-TEX DNA試劑盒從菌絲中提取病原真菌DNA。

PCR擴增:以提取的DNA為模板,采用引物ITS1/ITS4[22]、CHSI-79F/CHSI-354R[23]、ACT-512F/ACT-783R[24]、T1/βt2b和GDF1/GDR1[25]分別擴增核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) (ITS)序列、幾丁質(zhì)合成酶(CHS-I)序列、肌動蛋白(ACT)序列、β-微管蛋白(TUB2)序列和3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)序列(表1)。PCR擴增體系為20 μL,其中2×PCR Mix 10 μL,上下游引物各0.5 μL,模板DNA 1 μL,ddH2O補充至20 μL。擴增程序為:95 ℃預變性5 min,95 ℃變性30 s,退火30 s,72 ℃延伸1 min,30個循環(huán), 72 ℃延伸7 min,擴增后用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物,具特異性條帶的PCR產(chǎn)物送至擎科生物科技有限公司(陜西,西安)測序,所得拼接序列在Gen Bank數(shù)據(jù)庫中進行Blast比對,下載同源序列,用MEGA v.7中的鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹,確定其分類地位。

表1 擴增引物Table 1 Amplification primer

1.2.4 生物學特性測定 溫度對菌落生長、產(chǎn)孢數(shù)量和孢子萌發(fā)的影響:參考馬生彪等[26]的研究方法,將5 mm菌餅菌絲面向下接于PDA培養(yǎng)基中央,置于8個溫度梯度(5 ℃、10 ℃、15 ℃、 20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃)的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7 d,采用十字交叉法測量菌落直徑,重復3次。顯微觀察產(chǎn)孢后,用移液槍吸取10 mL無菌水洗脫病原孢子,制成孢子懸浮液,用血球計數(shù)板計算孢子濃度,重復3次。孢子萌發(fā)率通過懸滴法測定,用血球計數(shù)板將孢子液的濃度調(diào)至 2.0×107cfumL-1,在蓋玻片上滴孢子懸浮液,翻轉(zhuǎn)平放在凹玻片的凹槽上,然后培養(yǎng)在不同溫度梯度的培養(yǎng)箱中,每2 h鏡檢孢子萌發(fā)情況,重復3次。

pH對菌落生長、產(chǎn)孢數(shù)量和孢子萌發(fā)的影響:將5 mm菌餅接于不同pH(4.0、4.5、5.0、 5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5和 10.0)的PDA培養(yǎng)基中央,置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng),重復3次。其他同上。

光照對菌落生長、產(chǎn)孢數(shù)量和孢子萌發(fā)的影響:將5 mm菌餅接于PDA培養(yǎng)基中央,置于3種光照條件(24 h黑暗、24 h光照和12 h光暗交替)的25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),重復3次。其他同上。

碳、氮源對菌落生長、產(chǎn)孢數(shù)量和孢子萌發(fā)的影響:以 Czapek培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基,分別用等量的果糖、葡萄糖、麥芽糖、淀粉、6-脫氧-L-甘露糖、五碳醛糖、L-阿戊糖、甘露醇和蜜三糖等碳源替換其中的蔗糖,或以等量的蛋白胨、酵母浸膏、甘氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、氯化銨、硫酸銨、組氨酸和酪氨酸等氮源替換其中的硝酸鈉。配制含不同碳、氮源的培養(yǎng)基,并取直徑5 mm的菌餅接于上述培養(yǎng)基中央,25 ℃恒溫培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng),重復3次。其他同上。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2016和SPSS 19.0統(tǒng)計和處理試驗數(shù)據(jù)。

2 結果與分析

2.1 田間癥狀

辣椒炭疽病主要危害葉片和果實。葉片發(fā)病,初期在葉片表面形成點狀淡綠色病斑,后擴大呈圓形或不規(guī)則形,邊緣深褐色,中央灰白,不規(guī)則形,干燥時易碎裂,發(fā)病后期有輪生的小黑點;果實發(fā)病,初期受侵染部位出現(xiàn)濕潤狀、褐色、長圓形或不規(guī)則形病斑,后期患病部分變黑褐色,稍有凹陷,有不規(guī)則同心輪紋,周圍組織皺縮,后期亦產(chǎn)生輪狀排列的小黑點(分生孢子盤),潮濕時病斑表面有淺橙色分生孢子團溢出(圖1)。

圖1 辣椒炭疽病田間癥狀Fig.1 Symptoms of pepper anthracnose in field

2.2 病原菌的分離和致病性

根據(jù)分離物培養(yǎng)性狀及形態(tài)特征,共分離得到10株分離物,分別編號為LC1～LC10。對10株分離物進行致病性測定,其中分離物LC8在接種7 d后表現(xiàn)出典型的炭疽病癥狀 (圖2-A～2-C)。對照組均不發(fā)病(圖2-D～2-F)。對接種發(fā)病部位進行再次分離純化,得到與LC8形態(tài)一致的分離物,說明 LC8為甘肅省天水市辣椒炭疽病的致病菌。

A.接種后葉片癥狀;B、C.接種后果實癥狀;D、E、F.對照

2.3 病原菌的鑒定

2.3.1 形態(tài)學鑒定 菌株LC8菌落呈圓形,邊緣整齊,初期呈乳白色絨毛狀,4～5 d后菌落中央變?yōu)槟G色,有白色稀疏的氣生菌絲,菌落背面灰白色,中央淺黃褐色(圖3-A);分生孢子盤墊狀,平均大小為11.28 μm×13.10 μm(圖3-B),其上生有短的分生孢子梗,分生孢子梗無色,具分隔,有分支(圖3-C),在分枝的頂端膨大處產(chǎn)生分生孢子,分生孢子單孢,無色,梭形,壁光滑,內(nèi)含油滴,大小為(12.624～18.645) μm×(3.928～4.995) μm(圖3-D)。

A.菌落;B.分生孢子盤;C.分生孢子梗;D.分生孢子

2.3.2 基因序列分析 通過引物ITS、ACT、TUB2、CHSI和GAPDH進行PCR擴增,得到長度分別為566 bp、259 bp、743 bp、298 bp和261 bp的DNA片段(GenBank登錄號:MH893689、MW373829、MW373827、MW373828、MW373 830)。從NCBI中選擇參考序列(表2),并通過MEGA 7.0 中的N-J法構建多基因系統(tǒng)發(fā)育樹,結果表明分離物LC8與C.scovillei聚在系統(tǒng)發(fā)育樹上的同一分枝,且支持率為 100%(圖4)。結合形態(tài)特征及基因序列分析結果,將病原物LC8鑒定為斯高威爾炭疽菌(C.scovillei)。

圖4 基于ITS、ACT、TUB2、CHSI和GAPDH序列構建的炭疽菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenic tree of Colletotrichum based on sequences of ITS, ACT, TUB2, CHSI and GAPDH

表2 用于多位點系統(tǒng)發(fā)育分析的菌株及其GenBank登錄號Table 2 Strains used in multilocus phylogenetic analysis and their GenBank accession numbers

2.4 生物學特性表現(xiàn)

2.4.1 溫度對菌絲生長、產(chǎn)孢數(shù)量和孢子萌發(fā)的影響 菌株LC8在15～40 ℃內(nèi)均可生長并產(chǎn)孢,在15～25 ℃內(nèi),菌絲生長逐漸加快,25 ℃時菌落直徑達到最大,為6.02 cm,當溫度低于 15 ℃或高于40 ℃時, 菌絲生長明顯受到抑制, 低于10 ℃則停止生長;在15～35 ℃內(nèi),產(chǎn)孢量呈現(xiàn)遞增趨勢,35 ℃時孢子濃度達到最大,為 2.57×107cfu·mL-1,顯著高于其他溫度 (P<0.05);分生孢子在15～40 ℃范圍內(nèi)均可萌發(fā), 在30 ℃和35 ℃時培養(yǎng)8 h萌發(fā)率高于90%,二者差異不顯著,但均顯著高于其他溫度下的處理(P< 0.05),當培養(yǎng)溫度高于35 ℃或低于20 ℃時分生孢子萌發(fā)活力迅速減弱,說明 25 ℃為菌株LC8生長的最適溫度,35 ℃為產(chǎn)孢最適溫度,而30～35 ℃為孢子萌發(fā)最適溫度(圖5)。

誤差線上不同字母表示在0.05水平差異顯著。下同

2.4.2 pH對菌絲生長、產(chǎn)孢數(shù)量和孢子萌發(fā)的影響 菌株LC8在pH 4.5～10范圍內(nèi)均能生長并產(chǎn)孢,其中pH 5.0～7.5范圍內(nèi)菌絲生長較好,pH 7.5～8.5范圍內(nèi)產(chǎn)孢較好,顯著高于其他pH條件(P<0.05)。pH為6.0時,菌絲生長最快,菌落直徑達6.92 cm;pH為8.0時,產(chǎn)孢量最大,達4.62×106cfu·mL-1;pH為6.0時,培養(yǎng)12 h孢子萌發(fā)率達92%,其他pH條件下孢子萌發(fā)率受到明顯抑制。該結果說明菌絲生長和孢子萌發(fā)的最適pH為6.0,產(chǎn)孢的最適pH為8.0,同時還說明LC8具有較好的pH適應性,在弱酸至中性再至弱堿環(huán)境中均可正常生長并產(chǎn)孢(圖6)。

圖6 不同pH下菌絲生長、產(chǎn)孢數(shù)量和孢子萌發(fā)率Fig.6 Effect of pH on mycelial growth, spore production and spore germination

2.4.3 光照對菌絲生長、產(chǎn)孢數(shù)量和孢子萌發(fā)的影響 菌株LC8在3種供試條件下均可生長并產(chǎn)孢。在全黑暗條件下菌絲生長最快且孢子萌發(fā)率最高,菌落直徑達7.13 cm,培養(yǎng)10 h萌發(fā)率達95%,在全光照條件下菌絲生長最差, 孢子萌發(fā)率最低,菌落直徑小于6.00 cm,孢子萌發(fā)率僅為61%。在12 h光暗交替下,產(chǎn)孢量最大,顯著高于其他光照條件(P<0.05),全黑暗和全光照對該菌產(chǎn)孢有明顯的抑制作用。該結果說明全黑暗更有利于菌絲生長和孢子萌發(fā),而12 h光暗交替更有利于產(chǎn)孢(圖7)。

Ⅰ.24 h黑暗;Ⅱ.12 h光照/12 h黑暗;Ⅲ.24 h光照

2.4.4 碳源對菌絲生長、產(chǎn)孢數(shù)量和孢子萌發(fā)的影響 結果表明,LC8能利用多種碳源,其中以甘露醇、淀粉、葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基上生長較好,但以甘露醇最佳,菌落直徑達4.32 cm,而以果糖為碳源時菌絲生長最差,但產(chǎn)孢量顯著高于其他處理(P<0.05),達1.9×106cfu·mL-1。在供試碳源中,6-脫氧-L-甘露糖有利于分生孢子萌發(fā), 懸滴培養(yǎng)12 h孢子萌發(fā)率達93%,且與其他處理差異顯著(P<0.05),而以五碳醛糖為氮源時,孢子萌發(fā)率最低。該結果表明甘露醇、淀粉、葡萄糖有利于該病原菌的生長,但以甘露醇最佳;果糖最有利于產(chǎn)孢;6-脫氧-L-甘露糖則最有利于孢子萌發(fā)(圖8)。

1.蔗糖;2.果糖;3.葡萄糖;4.麥芽糖;5.淀粉;6.6-脫氧-L-甘露糖;7.五碳醛糖;8.L-阿戊糖;9.甘露醇;10.蜜三糖

2.4.5 氮源對菌絲生長、產(chǎn)孢數(shù)量和孢子萌發(fā)的影響 結果表明,菌株LC8 在10種氮源的培養(yǎng)基上均可生長并產(chǎn)孢,但表現(xiàn)出明顯的生長差異。在以蛋白胨為氮源時,該菌生長最快、產(chǎn)孢量最大、孢子萌發(fā)率最高,分別為4.65 cm、9.87×106cfu·mL-1和92%(培養(yǎng)8 h),均顯著高于其他處理(P<0.05)。以氯化銨、硫酸銨為氮源時,菌絲生長最慢且產(chǎn)孢量最小,以苯丙氨酸為氮源時,最不利于孢子萌發(fā),萌發(fā)率僅為3.67%。該結果表明菌株LC8生長、產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)的最適氮源均為蛋白胨(圖9)。

1.硝酸鈉;2.蛋白胨;3.酵母浸膏;4.甘氨酸;5.脯氨酸;6.苯丙氨酸;7.氯化銨;8.硫酸銨;9.組氨酸;10.酪氨酸

3 討論與結論

炭疽菌屬寄主范圍廣且致病力強,被列為全球第八大致病真菌[27],該屬傳統(tǒng)分類是基于純培養(yǎng)條件下分生孢子、分生孢子梗和分生孢子盤的形態(tài)及有無剛毛等培養(yǎng)特征進行[28]。炭疽菌主要危害辣椒葉片和果實,引起典型的炭疽癥狀,但不同種溢出物的顏色有所差異,根據(jù)病原形態(tài)特征和發(fā)病癥狀的差異可對分離菌株做初步鑒定[29]。本研究中的斯高威爾炭疽菌(C.scovillei)引起的辣椒病斑上著生黑色小點,潮濕時病斑表面溢出淺橙色分生孢子團,分生孢子盤墊狀,無剛毛,分生孢子梭形,內(nèi)含油滴,與Liu等[15]對C.scovillei的描述一致。楊佳文等[30]報道的平頭炭疽菌(C.truncatum)引起的辣椒病斑上著生小黑點,后期有乳白色黏狀溢出物,分生孢子盤密生褐色剛毛,分生孢子鐮刀狀,兩端較彎;夏花等[31]報道的尖孢炭疽菌(C.acutatum)引起的辣椒病斑上有橙黃色溢出物,干燥后呈黃褐色粉末,并可見呈環(huán)狀排列的黑色顆粒,在PDA上分生孢子盤稀少,無剛毛,分生孢子長橢圓形,一端尖,兩端均有油球;賀字典等[11]報道的膠孢炭疽菌(C.glocosporioides)引起的辣椒病斑上密生紅色顆粒,后期整個病斑表面溢出紅色膠狀物,分生孢子盤無剛毛,分生孢子柱狀,但有研究報道,C.gloeosporioides在某些條件下也會產(chǎn)生剛毛[32]。這些特征易隨培養(yǎng)條件和環(huán)境的變化而變化,因此要結合分子生物學方法進行準確鑒定。本研究從辣椒病葉上分離得到10株分離物,經(jīng)致病性測定,分離物LC8使辣椒表現(xiàn)出典型的炭疽癥狀,通過形態(tài)特征和多基因序列分析,將分離物LC8鑒定為斯高威爾炭疽菌(C.scovillei)。

菌株LC8在15～40 ℃范圍內(nèi)均可生長、產(chǎn)孢并萌發(fā),35 ℃時產(chǎn)孢量最大且孢子萌發(fā)率最高,與辣椒炭疽病在6～8月高溫天氣下發(fā)病較嚴重相符,當溫度低于10 ℃時菌株停止生長,說明該菌屬喜溫性病菌,當夏季高溫天氣時,菌量迅速擴大,侵染能力增強,在短期內(nèi)可造成病害大發(fā)生,因此生產(chǎn)上應以農(nóng)業(yè)防治為主,輔以其他防治措施的綜合防治,以獲得最佳效益。該菌在pH 4.5～10范圍內(nèi)均能生長并產(chǎn)孢,pH 5～7.5范圍內(nèi)菌絲生長較好,pH 7.5～8.5范圍內(nèi)產(chǎn)孢較好,與楊佳文等[30]報道的尖孢炭疽菌(C.acutatum)、程勛東等[33]報道的膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)研究結果基本一致,但孢子萌發(fā)的最適pH與上述報道存在差異,可能是因為不同種生長所需環(huán)境以及分離地的土壤酸堿度不同,但總體來看C.scovillei在弱酸至中性再至弱堿環(huán)境中均可正常生長并產(chǎn)孢。在本研究中,C.scovillei在全黑暗條件下生長最好,且產(chǎn)孢的適宜光照條件為12 h光暗交替,與謝丙炎[34-35]報道的膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)、黑點炭疽菌(C.capsici)在完全黑暗下有利于菌絲生長,12 h光暗交替有利于產(chǎn)孢的結果一致。該菌能利用多種碳、氮源,最適菌絲生長的碳源是甘露醇,其次為淀粉和葡萄糖,最適產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)的碳源分別是果糖和6-脫氧-L-甘露糖,最適氮源均為蛋白胨,說明該菌對碳、氮源的利用有一定的差異性,不同的碳、氮源在菌絲生長和產(chǎn)孢過程中起著不同的作用。

本研究僅對甘肅省天水市的辣椒炭疽病病原進行了鑒定和生物學特性測定,為該病害的診斷和綜合防治策略提供了依據(jù),但甘肅其他地區(qū)辣椒炭疽病菌的病原種類還有待進一步研究。