半夏白術(shù)天麻湯下調(diào)ApoE-/-小鼠TMAO代謝的作用研究

李繼軍,榮雅琪,孟憲卿,姜月華

血管炎性反應(yīng)和脂質(zhì)過(guò)氧化沉積導(dǎo)致的血管狹窄是動(dòng)脈粥樣硬化的主要病理改變。動(dòng)脈粥樣硬化在中醫(yī)理論體系中無(wú)對(duì)應(yīng)病名,根據(jù)其主要病理變化,多以眩暈、胸痹、痰飲為主進(jìn)行辨證和對(duì)癥治療,總體屬于本虛標(biāo)實(shí),以肝腎虧虛為本,以痰瘀阻滯為標(biāo)。脾主運(yùn)化,若飲食不節(jié),勞逸失度,脾失健運(yùn),日久則脾虛濕盛,痰濕蘊(yùn)結(jié),阻于脈絡(luò),因此,治當(dāng)燥濕化痰、平肝息風(fēng)。

氧化三甲胺(TMAO),即三甲胺-N-氧化物(trimethylamineN-oxide),來(lái)源于腸道菌群對(duì)肉、蛋、奶等富含膽堿類食物的代謝,已證實(shí)血液循環(huán)TMAO水平與動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)[1]。TMAO通過(guò)誘導(dǎo)脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)體CD36表達(dá)上調(diào),引起膽固醇過(guò)量沉積和泡沫細(xì)胞形成[2],且TMAO可激活NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NLRP3)炎性小體,導(dǎo)致內(nèi)皮通透性增高和促炎性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-18(IL-18)等的釋放,加重血管炎癥反應(yīng)[3],因此,TMAO近年來(lái)被視為是動(dòng)脈粥樣硬化的促進(jìn)劑[4]。半夏白術(shù)天麻湯(BBTD)是治療痰濕壅盛、風(fēng)痰上擾的經(jīng)典名方,功效化痰息風(fēng)、健脾祛濕,由半夏、天麻、茯苓、橘紅、白術(shù)、甘草組成,入選2018年國(guó)家中醫(yī)藥管理局《古代經(jīng)典名方目錄(第一批)》。半夏白術(shù)天麻湯臨床多用于肥胖性高血壓、頸源性眩暈、急性缺血性腦卒中、梅尼埃病等的治療。有研究報(bào)道半夏白術(shù)天麻湯通過(guò)降血脂、下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)表達(dá),改善載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠動(dòng)脈粥樣硬化[5]。本課題組既往研究證實(shí),半夏白術(shù)天麻湯以劑量依賴性方式減少血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、改善內(nèi)皮功能[6],改變了痰濕壅盛證小鼠的代謝模式,降低多種脂質(zhì)循環(huán)水平,減少主動(dòng)脈根部脂質(zhì)沉積和斑塊形成[7],且可下調(diào)肥胖性高血壓大鼠腎臟CD36的表達(dá)[8]。但半夏白術(shù)天麻湯參與動(dòng)脈粥樣硬化的治療及其機(jī)制仍有待研究,深入解讀半夏白術(shù)天麻湯的血管保護(hù)機(jī)制具有重要的研究?jī)r(jià)值和臨床意義。本研究通過(guò)檢測(cè)半夏白術(shù)天麻湯干預(yù)后ApoE-/-小鼠血漿TMAO及相關(guān)代謝物水平的變化,并同步觀察主動(dòng)脈CD36、NLRP3的表達(dá)及NLRP3下游IL-1β、IL-18表達(dá),探討半夏白術(shù)天麻湯改善動(dòng)脈硬化的藥理作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型誘導(dǎo)

無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)6周齡雄性ApoE-/-小鼠36只,體質(zhì)量(22±2)g,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,動(dòng)物許可證編號(hào):SCXK(京)2016-0006。動(dòng)物房設(shè)置12 h∶12 h明暗周期,小鼠自由攝食、飲水,環(huán)境溫度20～22 ℃,相對(duì)濕度60%。以標(biāo)準(zhǔn)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后,高脂高膽固醇飼料喂養(yǎng)12周誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化模型,然后分為半夏白術(shù)天麻湯組[17.8 g/(kg·d)]、瑞舒伐他汀鈣組[0.08 mg/(kg·d)]和ApoE-/-模型組,每組12只,并以相應(yīng)藥物灌胃8周,灌胃期間仍繼續(xù)高脂高膽固醇飲食。另以同周齡標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)的12只C57BL/6J小鼠作為C57正常對(duì)照組。高脂高膽固醇飼料配方:83.75%基礎(chǔ)飼料,21%脂肪,0.15%膽固醇[3],標(biāo)準(zhǔn)飼料和高脂高膽固醇飼料均購(gòu)自北京科澳協(xié)力飼料有限公司。

1.2 藥物

半夏白術(shù)天麻湯組方:半夏 9 g,天麻6 g,白術(shù)18 g,橘紅6 g,茯苓6 g,甘草3 g,生姜5 g,大棗兩枚。購(gòu)自山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房,水煎2次,2次水煎液混合后濃縮至生藥1 g。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

質(zhì)譜系統(tǒng)為美國(guó)AB Sciex公司的4000Qtrap質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng),配有電噴霧(ESI)離子源和Analyst 1.6.2工作站;超高效液相色譜儀為Waters UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)液相色譜柱,Waters公司;Analyst軟件(版本號(hào):1.6.2),美國(guó)AB Sciex公司;酶標(biāo)儀Labsystems Multiskan MS 352,芬蘭賽默飛公司;洗 板 機(jī)Labsystems AC8,芬蘭熱電公司;TYXH-I漩渦振蕩器,上海汗諾儀器有限公司;TGL-16MS臺(tái)式高速冷凍離心機(jī),上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司。兔抗小鼠 CD36 多克隆抗體(18836-1-AP)、兔抗小鼠NLRP3多克隆抗體(19771-1-AP),武漢三鷹公司;山羊抗兔多克隆抗體(ZB-2301),北京中衫金橋公司;鏈霉親和素-生物素(SABC)免疫組化試劑盒(SP-0023),北京博奧森公司;3,3′二氨基苯胺(DAB)顯色試劑盒(ZLI-9031),北京中衫公司;小鼠IL-1β酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒(210304KE10)、IL-18 ELISA試劑盒(210304KE14),江蘇晶美生物科技有限公司。水合氯醛,北京索萊寶科技有限公司。甲醇、甲酸、水、乙腈均購(gòu)自CNW公司,L-2-氯苯丙氨酸購(gòu)自上海恒創(chuàng)生物科技有限公司,LysoPC17.0購(gòu)自美國(guó)Avanti公司。所有化學(xué)藥品和溶劑均為分析純或色譜級(jí)。

1.4 樣本采集

每天觀察記錄小鼠一般情況。喂養(yǎng)20周后,10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠,下腔靜脈取血,EDTA抗凝,3 500 r/min離心10 min分離血漿,ELISA檢測(cè)IL-1β、IL-18含量;并超高效液相色譜-電噴霧離子化串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-ESI-MS/MS)靶向檢測(cè)血漿左旋肉堿(L-CA)、甜菜堿(Bet)、膽堿(CHO)、肌酐(Cre)、三甲胺(TMA)、TMAO的水平。冰上分離胸主動(dòng)脈,10%中性甲醛固定,石蠟包埋,切片厚度4 μm,蘇木素-伊紅(HE)染色觀察組織學(xué)改變,馬松染色(Masson)觀察細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原沉積從而評(píng)價(jià)組織纖維化程度;并免疫組化觀察CD36、NLRP3的分布。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)液的配制與血漿樣品前處理

超純水分別溶解左旋肉堿、甜菜堿、膽堿、肌酐、三甲胺、TMAO等各標(biāo)準(zhǔn)品至1 mg/mL作為儲(chǔ)備液,依次稀釋至1、2、5、10、20、50、100、200、500 ng/mL。80 μL血漿加入240 μL甲醇-乙腈=2∶1(V/V)[含0.01 mol/L 2,6-二叔丁基對(duì)甲酚(BHT)]渦旋混勻,超聲振蕩5 min,-20 ℃靜置30 min,10 000 r/min離心15 min,取上清240 μL,揮干,加入200 μL甲醇-水=2∶98(V/V)渦旋混勻,超聲1 min,加入200 μL氯仿4 ℃靜置10 min,10 000 r/min離心5 min,取上清160 μL進(jìn)樣。

1.6 UPLC-ESI-MS/MS靶向檢測(cè)TMAO系列代謝物的條件與數(shù)據(jù)分析

采用電噴霧離子源,正離子掃描,多反應(yīng)檢測(cè)(MRM)模式進(jìn)行分析,優(yōu)化正離子模式優(yōu)化去簇電壓(DP)、碰撞電壓(CE)、碰撞室射出電壓(CXP)等質(zhì)譜參數(shù)(見(jiàn)表1),質(zhì)譜分析條件:氣簾氣35;離子噴霧電壓5 500 V;溫度 550 ℃;離子源Gas 1∶35;Gas 2∶30。色譜流動(dòng)相A(0.1%甲酸-水溶液),流動(dòng)相B(乙腈),流速0.3 mL/min;梯度洗脫程序見(jiàn)表2。利用Analyst軟件,采用默認(rèn)參數(shù)對(duì)各MRM transition進(jìn)行自動(dòng)識(shí)別和積分,以質(zhì)譜峰面積為縱坐標(biāo)、物質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)繪制線性回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線。將樣品分析物的質(zhì)譜峰面積代入線性方程中,計(jì)算濃度。

表1 質(zhì)譜參數(shù)

表2 梯度洗脫程序

1.7 免疫組化觀察主動(dòng)脈CD36、NLRP3的表達(dá)與分布

小鼠胸主動(dòng)脈切片脫蠟至水,枸櫞酸鹽緩沖液微波爐高火加熱進(jìn)行抗原修復(fù)。然后滴加 3% H2O2室溫孵育10 min,山羊血清室溫封閉 30 min,分別滴加兔抗小鼠 CD36、NLRP3一抗(1∶200 稀釋)4 ℃孵育過(guò)夜,磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對(duì)照,次日依次滴加羊抗兔IgG二抗、SABC,DAB顯色,蘇木素復(fù)染3 min,顯微鏡下觀察棕黃色顆粒沉積作為陽(yáng)性。隨機(jī)選取5個(gè)視野,以Image J軟件進(jìn)行半定量分析。

1.8 ELISA檢測(cè)血漿IL-1β、IL-18含量

依據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,檢測(cè)血漿IL-1β、IL-18含量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 主動(dòng)脈形態(tài)

各組小鼠胸主動(dòng)脈HE染色顯示,C57正常對(duì)照組主動(dòng)脈細(xì)胞排列有序,管壁光滑,內(nèi)-中膜厚度適中;ApoE-/-模型組主動(dòng)脈平滑肌層細(xì)胞排列紊亂,細(xì)胞核濃染,內(nèi)-中膜間可見(jiàn)脂質(zhì)沉積導(dǎo)致的空泡和組織異常,細(xì)胞外基質(zhì)中可見(jiàn)大量膠原沉積;應(yīng)用半夏白術(shù)天麻湯和瑞舒伐他汀鈣后,脂質(zhì)空泡顯著減少,膠原沉積減輕,血管結(jié)構(gòu)、形態(tài)有明顯的改善。詳見(jiàn)圖1。

圖1 小鼠胸主動(dòng)脈HE及Masson染色切片圖

2.2 血漿TMAO及相關(guān)代謝物水平的靶向UPLC-ESI-MS/MS檢測(cè)

ApoE-/-模型組血漿左旋肉堿、甜菜堿、肌酐、三甲胺、TMAO水平高于C57正常對(duì)照組(P<0.05或P<0.01);半夏白術(shù)天麻湯和瑞舒伐他汀鈣干預(yù)后,均能降低左旋肉堿、甜菜堿、肌酐、三甲胺、TMAO水平,與ApoE-/-模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01);但半夏白術(shù)天麻湯組血漿膽堿水平高于ApoE-/-模型組及瑞舒伐他汀鈣組(P<0.01)。詳見(jiàn)圖2、表3。

圖2 各組UPLC-ESI-MS/MS血漿TMAO及相關(guān)代謝物水平比較

表3 各組血漿TMAO及相關(guān)代謝物水平比較(±s) 單位:ng/mL

2.3 主動(dòng)脈CD36、NLRP3的分布

ApoE-/-模型組主動(dòng)脈的CD36、NLRP3分布多于C57正常對(duì)照組主動(dòng)脈(P<0.01);與ApoE模型組比較,半夏白術(shù)天麻湯組和瑞舒伐他汀鈣組主動(dòng)脈的CD36、NLRP3分布降低(P<0.01),半夏白術(shù)天麻湯組和瑞舒伐他汀鈣組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)圖3、圖4。

圖3 免疫組化觀察小鼠主動(dòng)脈CD36、NLRP3的切片圖

圖4 免疫組化觀察小鼠主動(dòng)脈CD36、NLRP3分布柱狀圖

2.4 血漿IL-1β、IL-18含量

ApoE-/-模型組血漿IL-1β、IL-18高于C57正常對(duì)照組(P<0.01);與ApoE-/-模型組比較,半夏白術(shù)天麻湯組和瑞舒伐他汀鈣組血漿IL-1β、IL-18濃度降低(P<0.01),半夏白術(shù)天麻湯組和瑞舒伐他汀鈣組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)表4。

表4 各組血漿IL-1β、IL-18含量比較(±s) 單位:ng/L

3 討 論

半夏白術(shù)天麻湯是專于化痰濕、息內(nèi)風(fēng)的經(jīng)典方藥[9],源于李東垣的《脾胃論》,經(jīng)清代名醫(yī)程國(guó)彭加減形成現(xiàn)在的組方形式。據(jù)納入112 458例眩暈病人、隨訪15年的真實(shí)世界研究發(fā)現(xiàn),半夏白術(shù)天麻湯不僅緩解了眩暈的臨床癥狀,還有效降低了眩暈病人的卒中風(fēng)險(xiǎn),其藥效優(yōu)于苓桂術(shù)甘湯和天麻鉤藤飲[10]。據(jù)納入1 424例高血壓病人的Meta分析證實(shí),半夏白術(shù)天麻湯可有效降低收縮壓,半夏白術(shù)天麻湯聯(lián)合西藥的降壓藥效明顯優(yōu)于單獨(dú)西藥治療,使病人得到更大獲益[11]。另?yè)?jù)納入2 796例椎-基底動(dòng)脈供血不足病人的Meta分析,半夏白術(shù)天麻湯提高了左椎動(dòng)脈、右椎動(dòng)脈、基底動(dòng)脈的血流速度,減少了短暫性腦缺血(TIA)發(fā)作次數(shù)[12]。雖以上研究均未對(duì)其藥理機(jī)制進(jìn)行闡釋,但通過(guò)分析半夏白術(shù)天麻湯的臨床適應(yīng)證,提示半夏白術(shù)天麻湯可改善動(dòng)脈粥樣硬化這一共同致病因素,從而實(shí)現(xiàn)其治療高血壓、眩暈、TIA,降低腦卒中風(fēng)險(xiǎn)的藥效,因此,對(duì)半夏白術(shù)天麻湯藥理機(jī)制的探索具有重要的臨床意義。本課題組既往研究證實(shí),半夏白術(shù)天麻湯可有效改善氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮功能紊亂[6],降低多種循環(huán)脂質(zhì)水平,并減少脂質(zhì)沉積于大動(dòng)脈[7]。半夏白術(shù)天麻湯健脾祛濕,尤擅治療代謝相關(guān)的心腦血管疾病,但其調(diào)節(jié)代謝的機(jī)制和靶標(biāo)仍亟待深入研究。

TMAO是獨(dú)立于傳統(tǒng)心血管危險(xiǎn)因素及心腎功能的新型代謝小分子指標(biāo),TMAO水平不僅與動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān),而且與腦鈉肽水平也具有相關(guān)性,高TMAO水平提示心因性死亡風(fēng)險(xiǎn)增加[13]。因肉堿、甜菜堿、膽堿均是TMAO的前體物質(zhì),在腸道菌群作用下轉(zhuǎn)化為三甲胺,繼而在肝臟黃素單加氧酶(FMOs)的作用下可轉(zhuǎn)化為T(mén)MAO,血漿中的膽堿、甜菜堿、左旋肉堿升高預(yù)示著不良心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)增加[14]。本研究中,半夏白術(shù)天麻湯降低了ApoE-/-小鼠血漿左旋肉堿、甜菜堿、肌酐、三甲胺、TMAO水平,顯示出強(qiáng)大的改善動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)代謝物的作用。令人意外的結(jié)果是,半夏白術(shù)天麻湯組血漿膽堿水平高于其他3組,膽堿作為磷脂的組分,是生物膜的重要組成成分,也是迷走神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的前體分子[15],提示半夏白術(shù)天麻湯以更為復(fù)雜的方式調(diào)節(jié)膽堿水平,參與心血管疾病過(guò)程。

TMAO是CD36和NLRP3的內(nèi)源性配體[16]。巨噬細(xì)胞通過(guò)CD36介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑,促進(jìn)可溶性ox-LDL的攝取,導(dǎo)致溶酶體破裂和NLRP3炎癥小體的活化[17]。NLRP3炎癥小體廣泛存在于單核-巨噬細(xì)胞中,TMAO激活NLRP3炎癥小體后,導(dǎo)致單核-巨噬細(xì)胞集聚活化,促進(jìn)IL-1β、IL-18的成熟和釋放,在非感染情況下引發(fā)和維持慢性炎癥反應(yīng),參與心血管炎癥過(guò)程及動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展,增加心腦血管事件風(fēng)險(xiǎn)。在本研究中,應(yīng)用半夏白術(shù)天麻湯后,ApoE-/-小鼠在主動(dòng)脈CD36、NLRP3分布減少的同時(shí),IL-1β、IL-18水平也隨之降低,提示機(jī)體炎癥水平的下調(diào)。

本研究證實(shí),半夏白術(shù)天麻湯調(diào)節(jié)TMAO代謝途徑,減少膽固醇蓄積、泡沫細(xì)胞形成和血管炎癥,從而改善ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化。已知腸道菌群是肉堿、甜菜堿、膽堿轉(zhuǎn)化為T(mén)MAO的關(guān)鍵因素,提示半夏白術(shù)天麻湯與腸道菌群的關(guān)系也是今后的研究方向。