王瀟然, 李笑語, 孫慧, 于海東, 石永春
(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,鄭州 450002)
硼元素是植物細(xì)胞壁中重要的微量元素之一,與植物碳、氮代謝及核酸合成等眾多生物學(xué)過程緊密相關(guān)[1]。硼含量的變化可能改變膜結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu),進(jìn)而將外界信號(hào)通過細(xì)胞壁-細(xì)質(zhì)膜-細(xì)胞骨架路徑傳遞到胞內(nèi);同時(shí),進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)的硼元素與相關(guān)蛋白結(jié)合影響部分轉(zhuǎn)錄因子活性,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)內(nèi)源基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控[2]。
Ali 等[3]發(fā)現(xiàn),高硼含量影響煙草對(duì)氮素的吸收,可能是由于硼改變了H+-ATPase 活性,影響跨膜質(zhì)子的運(yùn)輸,最終導(dǎo)致與質(zhì)子共轉(zhuǎn)運(yùn)的氮素吸收受到抑制。硼含量的改變導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)第二信使的Ca2+信號(hào)發(fā)生顯著變化,并通過調(diào)節(jié)活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平和NAD(P)H 氧化酶活性影響細(xì)胞代謝過程[4]。因此,土壤中適宜的硼含量是煙葉品質(zhì)和產(chǎn)量的重要保證。研究表明,最適于煙草生長的土壤有效硼含量為0.5~1.0 mg·kg-1[5]。在我國干旱或半干旱植煙地區(qū),土壤中硼含量多高于2.0 mg·kg-1,易造成嚴(yán)重的硼脅迫現(xiàn)象[6]。在西南煙區(qū),重慶長江沿岸和湘西地區(qū)土壤中有效硼含量均高于煙草正常需硼量[7-8]。由于煙草對(duì)硼元素的敏感性較高,即使在缺硼地區(qū),也容易因過量施用硼肥而導(dǎo)致短期的硼脅迫[9]。研究表明,硼脅迫會(huì)導(dǎo)致花椰菜蒸騰速率和光合速率下降[10];白樺葉片淀粉和己糖(葡萄糖和果糖)含量降低[11];向日葵[12]、小麥和大麥[13]根中總氮含量減少,硝酸還原酶活性下降;花生葉片中總氮和蛋白質(zhì)含量下降[14];抑制茶樹對(duì)磷的吸收[15]。
對(duì)煙苗進(jìn)行無土栽培時(shí),發(fā)現(xiàn)用200 mg·L-1的硼酸處理2 周即可導(dǎo)致硼脅迫現(xiàn)象,其株高僅為對(duì)照的70.00%,葉長為對(duì)照的80.93%,葉尖和葉緣出現(xiàn)變黃、干枯等現(xiàn)象[9]。但煙葉硼脅迫的臨界值和煙葉對(duì)長期硼脅迫的響應(yīng)機(jī)制都未見報(bào)道。煙葉是煙草的收獲器官,因此,為深入研究煙草對(duì)硼脅迫的響應(yīng)機(jī)理,本文通過高通量測(cè)序技術(shù),結(jié)合生理和分子檢測(cè)技術(shù),對(duì)煙草響應(yīng)硼脅迫的相關(guān)基因進(jìn)行初步篩選,為深入理解煙草對(duì)硼脅迫的響應(yīng)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
將栽培煙草‘K326’(Nicotiana tabccumcv.K326)種子鋪于濕潤的濾紙,萌發(fā)后轉(zhuǎn)移至滅菌的煙草專用基質(zhì)上,24 ℃、16 h 光/8 h 暗環(huán)境育苗至8葉期開始進(jìn)行硼脅迫處理。
將8 葉期煙草移入蛭石中,分別以含硼量為0、0.05、1.00、2.00、3.00 mmol·L-1的Hoagland 培養(yǎng)液澆灌,分別命名為T0、T0.05、T1、T2、T3。處理4 周,處理期間每隔3 d 澆100 mL 處理液,每次澆灌處理液之前用5 倍蛭石體積的去離子水沖淋,以確保處理水平的一致性。脅迫結(jié)束后,將第9 或第10 片葉去除葉緣和葉脈,液氮速凍后存于-80 ℃冰箱備用。
1.3.1形態(tài)學(xué)指標(biāo)測(cè)定 葉長、葉寬和根長用軟尺測(cè)量,根體積用排水法測(cè)定,根系面積用甲烯藍(lán)法[16]測(cè)定。
1.3.2生理指標(biāo)檢測(cè) 利用比色法[17]測(cè)定葉綠素含量。脯氨酸含量按照Chakrabarty 等[18]的方法進(jìn)行檢測(cè)??偺呛坎捎幂焱╗17]定量檢測(cè)。使用蔗糖/葡萄糖/果糖試劑盒(德國拜發(fā),E0139 041)分析果糖、葡萄糖和蔗糖含量。依據(jù)鄒琦[17]的方法測(cè)定淀粉含量。依據(jù)Van 等[19]的方法檢測(cè)纖維素含量。果膠含量按照比色法[20]進(jìn)行測(cè)定。蛋白質(zhì)含量按照Bradford 等[21]的方法測(cè)定,H2O2含量按照Liu 等[22]的方法進(jìn)行檢測(cè)。硼含量采用楊潔等[23]的方法用安捷倫ICP-OES 光譜儀測(cè)定。
1.3.3抗氧化酶活性測(cè)定 過氧化氫酶(catalase,CAT)活性采用紫外吸收法,過氧化物酶(peroxidase,POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)采用硝基四氮唑藍(lán)還原法測(cè)定[17];蔗糖合成酶(sucrose synthetase,SS)、蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthetase,SPS)活性的測(cè)定采用Pramanik等[24]的方法測(cè)定。
將T0.05和T2處理后凍存的煙草葉片送到壹基因公司測(cè)序,每個(gè)處理3 次重復(fù)。提取樣品總RNA 并使用DNase Ⅰ消化,然后用帶有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA;打斷后合成一鏈cDNA 和二鏈cDNA,回收加接頭,再進(jìn)行PCR 擴(kuò)增建庫;質(zhì)檢合格后用Illumina HiSeqTM4000 測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。將獲得的原始序列(raw reads)進(jìn)行質(zhì)控(quality control,QC)后過濾得到分析數(shù)據(jù)(clean reads),用SOAPaligner/SOAP2 與參考序列進(jìn)行比對(duì),而后利用R語言DESeq數(shù)據(jù)包篩選差異表達(dá)的基因(differentially expressed genes,DEGs),篩選標(biāo)準(zhǔn)為|log2Ratio|≥1 且FDR(false discovery rate)≤0.05。利用Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(https://www.genome.jp/kegg/)和The Gene Ontology Resource(http://geneontology.org/)數(shù)據(jù)庫對(duì)差異基因進(jìn)行注釋,利用R 語言完成GO 和KEGG pathway顯著性富集分析。
隨機(jī)選取部分差異表達(dá)基因?qū)ι鲜鰞龃娴臉悠愤M(jìn)行熒光定量PCR 檢測(cè),以actin為內(nèi)參,參照TB Green?Premix Ex Taq? Ⅱ (TliRNaseH Plus,TaKaRa 公司)試劑盒的說明書配制反應(yīng)體系。所用引物如表1所示。
表1 引物序列Table 1 Primer sequences
采用SPSS 21.0 和Excel 2010 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
為明確硼脅迫對(duì)煙葉生長的影響,以煙草栽培種‘K326’為試驗(yàn)材料,在8 葉期連續(xù)4 周進(jìn)行不同水平的硼處理,結(jié)果(圖1)表明,處理4周后,與T0相比,硼脅迫處理均導(dǎo)致煙株矮小,葉片變小,且對(duì)煙葉生長的抑制作用隨硼用量的增加而加重。其中,T0.05的葉片略小但生長狀態(tài)最好,T1處理出現(xiàn)葉緣輕微焦枯現(xiàn)象;T2處理葉緣出現(xiàn)明顯焦枯現(xiàn)象;T3處理則更嚴(yán)重。分析不同處理下煙葉的葉長和葉寬,結(jié)果(圖2)表明,處理組第10葉的葉長和葉寬均顯著低于對(duì)照,且表現(xiàn)為隨硼含量的增加而減少,其中T2和T3處理又極顯著低于T0.05和T1處理;而T0.05與T1處理、T2與T3處理間差異不顯著。因此,后續(xù)試驗(yàn)及分析均以2.00 mmol·L-1(T2處理)進(jìn)行硼脅迫處理。
圖1 不同硼處理下煙草的生長Fig. 1 Growth of tobacco in different treatments
圖2 不同處理下煙草的葉片形態(tài)Fig. 2 Morphological indexes of tobacco leaves in different treatments
為進(jìn)一步分析硼脅迫抑制煙葉生長的原因,對(duì)T0和T2處理煙草相同葉位葉片的硼含量及其生理指標(biāo)和酶活性進(jìn)行了對(duì)比分析(表2~4)。結(jié)果表明,硼脅迫4 周后,硼主要積累在煙葉中,T2處理葉片中的硼含量是T0的7.256 倍;莖和根中的硼含量分別為T0的1.353 和1.554 倍(表2)。硼脅迫處理葉片中的可溶性總糖含量極顯著降低,僅為T0的57.7%;葡萄糖和果糖含量變化較小,但蔗糖含量顯著降低,僅為T0的38.4%;淀粉含量顯著下降,為T0的48.7%;葉綠素及類胡蘿卜素含量與T0差異不顯著;作為細(xì)胞壁主要組成成分的纖維素和果膠,硼脅迫處理后分別降至T0的64.0%和65.9%;硼脅迫極顯著提高了煙葉中脯氨酸、蛋白質(zhì)和H2O2含量,分別為T0的1.582、1.421、5.198倍(表3)。酶活性檢測(cè)顯示(表4),T2處理葉片中SOD 活性極顯著低于T0;POD 活性極顯著高于T0;SPS 活性顯著高于T0;SS 活性與T0差異不顯著。
表2 不同處理下煙株各器官的硼含量Table 2 Boron contents in different tissues of tobacco under different treatments (mg·g-1 DW)
表3 不同處理下煙草葉片的生理指標(biāo)Table 3 Physiological indexes of tobacco leaves under different treatments (mg·g-1 FW)
表4 不同處理煙草葉片的酶活性Table 4 Enzyme activities in tobacco leaves of different treatments(U·g-1)
形態(tài)及生理指標(biāo)檢測(cè)證實(shí),高水平硼脅迫影響煙葉的物質(zhì)代謝及生長發(fā)育,但煙草的正常生長又需要硼,因此,為篩選響應(yīng)高濃度硼脅迫的基因及代謝通路,本研究以T0.05(常規(guī)Hoagland培養(yǎng)液)為對(duì)照,T2為處理對(duì)煙葉樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析,共獲得差異表達(dá)基因389 個(gè)。對(duì)上述基因進(jìn)行KEGG富集分析,獲得顯著富集的前20個(gè)途徑,硼脅迫主要影響煙草次生代謝物的合成、苯丙烷類合成、植物和病原菌互作、苯丙氨酸代謝,植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、淀粉和蔗糖代謝、芪類和姜醇代謝、黃酮類合成、氨基糖和核苷酸糖代謝、亞麻酸和甘油磷脂代謝等途徑(圖3)。
圖3 硼脅迫響應(yīng)基因KEGG富集分析Fig. 3 KEGG enrichment analysis of DEGs responding to boron toxicity
在淀粉和蔗糖代謝途徑中,硼脅迫處理后,煙葉中內(nèi)切葡聚糖酶11(LOC104086800)和18(LOC104216009)、β-淀粉酶3(LOC104239567)、果膠酯酶(LOC104118953)、α, α-海藻糖磷酸合酶11 同型X1(LOC104236587)、β-D-木糖苷酶2(LOC104210063)顯著上調(diào);內(nèi)切葡聚糖酶6 類(LOC104116779、 LOC104215840)、海藻糖酶(LOC107800135)、β-葡糖苷酶13 類同型X1(LOC104110715)、β-D-木糖苷酶5(LOC104228982)、蠶豆氰苷水解酶(LOC104218490)、半乳糖醛酸轉(zhuǎn)移酶類1(LOC104087120)、果膠酯酶抑制子51 同型X1(LOC104117285)顯著下調(diào)(表5)。其中,上調(diào)的磷酸海藻糖合酶催化合成海藻糖,下調(diào)的海藻糖酶降解海藻糖,這可能導(dǎo)致煙葉中海藻糖的積累。由于海藻糖參與植物的抗病信號(hào)途徑[25],這一現(xiàn)象可能暗示硼參與煙草抗病信號(hào)調(diào)控。另外,上調(diào)的內(nèi)切葡聚糖酶和果膠酯酶分別催化纖維素和果膠的分解;果膠酯酶抑制子51 同型X1的下調(diào)則進(jìn)一步促進(jìn)了果膠的水解。β-D-木糖苷酶參與木聚糖的分解,不同種類β-D-木糖苷酶的表達(dá)水平變化可能暗示木聚糖的分解在不同的組織中受到的影響不同。
表5 響應(yīng)硼脅迫的淀粉和蔗糖代謝途徑相關(guān)基因Table 5 Genes related to starch and sucrose metabolic pathways responding to boron toxicity
脂類是煙葉中重要的香氣來源和組成成分,KEGG 分析表明,硼脅迫導(dǎo)致脂類代謝途徑相關(guān)基因的表達(dá)豐度發(fā)生波動(dòng)(表6)。其中涉及脂肪酸合成的乙酰CoA 羧化酶1 類(LOC104089343)、3- 酮二氫鞘氨醇還原酶類同型 X2(LOC1042 45391)均顯著下調(diào),表明脂肪酸的合成受到抑制;參與脂肪酸降解的過氧化物酶體中的?;鵆oA 氧化酶2(LOC104119660)顯著上調(diào),表明硼脅迫可能促進(jìn)脂肪酸的降解;而參與脂肪酸延長的3-酮酯酰CoA 合酶6(LOC104214086、LOC104094697)、3- 酮酯酰CoA 合酶19 類(LOC104228778、 LOC104218838)、長鏈?;鵆oA合成酶2(LOC104110787)顯著下調(diào),暗示硼脅迫可能抑制長鏈脂肪酸的合成;但涉及不飽和脂肪酸合成的長鏈烯酰CoA 還原酶類(LOC104114213)顯著上調(diào),推測(cè)硼脅迫可能影響某些長鏈不飽和脂肪酸的含量。
表6 響應(yīng)硼脅迫的脂肪酸代謝途徑相關(guān)基因Table 6 Fatty acid metabolic related genes that responding to boron toxicity
硼脅迫導(dǎo)致煙葉中脯氨酸含量和酶活性發(fā)生變化,由此表明硼脅迫可能影響煙草的抗逆性。由表7 可知,硼脅迫后,除抗病蛋白R(shí)PP13(LOC104234903)基因顯著下調(diào)外,堿性發(fā)病相關(guān)蛋白PR1(LOC104235161)、抗病蛋白(LOC104116631)、抗病蛋白R(shí)PM1 類(LOC104233182)的表達(dá)顯著上調(diào);富含半胱氨酸的受體類蛋白激酶3(LOC104216132)、響應(yīng)脅迫的G 類植物凝集素S-受體類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激 酶 At4g27290 同 型 X1(LOC104217774、LOC104241125、 LOC104246103)的表達(dá)水平上調(diào),僅G 類植物凝集素S-受體類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶At5g24080 同型X1(LOC104096948)表達(dá)下調(diào);富含脯氨酸的受體類蛋白激酶PERK9(LOC104103311)表達(dá)水平上調(diào);響應(yīng)脅迫的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶激酶1 類(LOC104236563、LOC104091723)表達(dá)水平上調(diào);PTI1 類酪氨酸蛋白激酶At3g15890 類(LOC104223256)、ZmPK1 類受體類蛋白激酶(LOC104084644)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶同型X2(LOC104216857)的表達(dá)水平上調(diào);響應(yīng)脅迫的多聚半乳糖醛酸酶抑制劑類(LOC104112558) 、 轉(zhuǎn) 錄 因 子 PIF1 類(LOC104093573)、參與抗病途徑的TIFY8(LOC104239595)的表達(dá)水平上調(diào),呼吸爆發(fā)氧化酶蛋白E類(LOC104111058)的表達(dá)下調(diào)。
表7 響應(yīng)硼毒害的生物脅迫應(yīng)答基因Table 7 Genes responding to boron toxicity
激素是調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的重要信號(hào)之一。轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn),硼脅迫造成多個(gè)激素信號(hào)通路改變(表8)。響應(yīng)乙烯(ethylene)信號(hào)途徑的乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子ERF003(LOC104096661)和乙烯受體蛋白(LOC107784797)表達(dá)水平上調(diào),表明硼脅迫激活乙烯信號(hào)途徑。硼脅迫處理后,煙葉中的生長素(IAA)受體蛋白TIR1(LOC104085449)表達(dá)水平顯著下調(diào);而抑制生長素信號(hào)的生長素響應(yīng)蛋白IAA26(LOC104100899)和生長素響應(yīng)因子ARF9(LOC104243881)表達(dá)水平上調(diào),表明生長素信號(hào)途徑被顯著抑制,從而影響煙葉生長。響應(yīng)茉莉酸(jasmonic acid,JA)信號(hào)途徑的TIFY8蛋白(LOC104239595)和響應(yīng)水楊酸(salicylic acid,SA)信號(hào)途徑的轉(zhuǎn)錄因子 TGA2.1(LOC107782457)的表達(dá)水平均上調(diào),它們都能激活堿性PR1 蛋白(LOC104235161),從而增強(qiáng)煙葉抗病性。負(fù)調(diào)控脫落酸(abscisic acid,ABA)信號(hào)的蛋白磷酸酶PP2C 37(LOC104086506)表達(dá)水平下調(diào);響應(yīng)ABA 的轉(zhuǎn)錄因子PIF1(LOC104093573)表達(dá)水平上調(diào),推測(cè)硼脅迫促進(jìn)了ABA信號(hào)途徑。
表8 響應(yīng)硼脅迫的植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因Table 8 Genes related to hormone signal transduction in plants responding to boron toxicity
為驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性,隨機(jī)選取8個(gè)差異基因(表1)進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證,而后將驗(yàn)證基因T2/T0.05的相對(duì)表達(dá)倍數(shù)取Log2,與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比對(duì)線性關(guān)系,結(jié)果(圖4)顯示,二者間存在良好的線性關(guān)系(R2=0.872 6),表明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)真實(shí)可靠。
圖4 差異表達(dá)基因qRT-PCR驗(yàn)證Fig. 4 Validation of transcript abundance of differentially expressed genes based on qRT-PCR
硼脅迫影響植物生長發(fā)育已經(jīng)被廣泛報(bào)道,在棉花、小麥等作物中均有發(fā)現(xiàn)[26-27];在煙草中,硼脅迫影響煙株的農(nóng)藝性狀,并導(dǎo)致凈光合速率、POD 活性、干物質(zhì)量及經(jīng)濟(jì)效益均顯著降低[28]。本研究發(fā)現(xiàn),硼脅迫導(dǎo)致煙株矮小,煙葉變小變厚;且發(fā)現(xiàn)硼主要積累于煙葉中,硼毒害造成煙葉中可溶性總糖含量顯著降低,僅為對(duì)照的57.7%,其中蔗糖含量僅為對(duì)照的38.4%;淀粉、纖維素和果膠的含量也顯著降低。組學(xué)分析顯示,負(fù)責(zé)降解淀粉的β-淀粉酶3(LOC104239567)和纖維素的內(nèi)切葡聚糖酶11(LOC104086800)、18(LOC104216009)均上調(diào)表達(dá),與生理檢測(cè)結(jié)果趨勢(shì)一致。Massod 等[29]對(duì)小麥進(jìn)行高硼脅迫6 周后,也發(fā)現(xiàn)葉片中總糖和蔗糖含量顯著降低,認(rèn)為這是由于礦質(zhì)元素紊亂造成的碳代謝抑制。高硼處理鳳梨也導(dǎo)致葉片中礦質(zhì)元素紊亂,總糖和淀粉含量降低[30]。長期高硼脅迫導(dǎo)致煙草的總糖含量降低是否也與礦質(zhì)元素紊亂有關(guān),且影響了哪些礦質(zhì)元素,還有待進(jìn)一步的研究。
在大豆中發(fā)現(xiàn)硼脅迫導(dǎo)致脂肪酸總量降低,尤其是軟脂酸顯著降低[31]。本研究發(fā)現(xiàn),硼脅迫造成煙草脂肪酸從頭合成途徑的關(guān)鍵酶乙酰CoA羧化酶表達(dá)水平下調(diào),而脂肪酸β-氧化途徑的?;鵆oA 氧化酶表達(dá)水平上調(diào),參與脂肪酸延長途徑的3-酮酯酰CoA合酶和長鏈?;鵆oA合成酶表達(dá)水平下調(diào),表明硼脅迫可能在促進(jìn)脂肪酸降解的同時(shí),又抑制了脂肪酸、尤其是長鏈脂肪酸的合成,進(jìn)而導(dǎo)致煙葉中脂肪酸含量降低。脂肪酸是脂類物質(zhì)合成的原料,其含量降低將導(dǎo)致煙葉油分減少,品質(zhì)下降。同時(shí),脂肪酸是合成細(xì)胞膜的主要成分之一,其合成受阻可能干擾細(xì)胞的正常分裂。
氮素代謝直接關(guān)系煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)。番茄受硼脅迫后葉片中谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性升高,蛋白質(zhì)含量隨硼脅迫強(qiáng)度的升高而增加[32]。大豆[31]種子、擬南芥[33]和玉米[34]葉中的蛋白質(zhì)也隨著硼脅迫強(qiáng)度的增加而增加。本研究發(fā)現(xiàn),硼脅迫后煙葉中蛋白質(zhì)含量顯著增加。盡管組學(xué)分析未檢測(cè)到氮素代謝相關(guān)基因的表達(dá)變化,但其他作物在硼脅迫后蛋白含量增加,由此推斷硼脅迫可能在加速糖類分解代謝的同時(shí),促進(jìn)了糖類碳骨架向蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)換。
硼與植物的抗病性密切相關(guān)[35]。植物的抗病能力通常借助抗氧化酶活性的提高、啟動(dòng)超敏反應(yīng)、增強(qiáng)防御基因表達(dá)等體現(xiàn)[36]。Rezaee 等[37]發(fā)現(xiàn),0.1 mmol·L-1硼處理洋桔梗24 h 后,洋桔梗中的SOD、過氧化氫酶(catalase,CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)活性增強(qiáng),其中CAT 尤其顯著。Kayihan 等[33]將擬南芥在含有3.0 mmol·L-1硼的MS 培養(yǎng)基上培養(yǎng)14 d,其葉片中GR、DHAR和APX基因的表達(dá)水平顯著增加,表明激活了AsA-GSH 循環(huán),提高了擬南芥抗氧化能力和抗病性。本研究發(fā)現(xiàn),硼脅迫處理煙株4周,不僅顯著增強(qiáng)了煙葉POD 活性,還在植物抗病機(jī)制信號(hào)途徑中,上調(diào)了發(fā)病相關(guān)蛋白PR1、抗病蛋白R(shí)PM1 以及響應(yīng)脅迫的大量受體類蛋白激酶基因的表達(dá),如富含半胱氨酸的受體類蛋白激酶3、G類植物凝集素S-受體類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[38]、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶激酶[39]等關(guān)鍵生物脅迫應(yīng)答基因的表達(dá)水平,因此,硼元素可能具有提升植物耐受生物脅迫的能力。盡管如此,但高硼積累通常引發(fā)煙草代謝紊亂,使其產(chǎn)量及品質(zhì)下降。因此,探索科學(xué)合理的硼肥施用方案,可實(shí)現(xiàn)在穩(wěn)產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的同時(shí),提升煙株抗病性,在煙草乃至其他作物栽培過程中具有重要應(yīng)用價(jià)值。
植物生長受多種激素信號(hào)系統(tǒng)的綜合調(diào)控。Eggert 等[40]研究了油菜幼苗受短期(7 d)低硼處理(2.0 mg B·kg-1土)后葉片中的激素變化,發(fā)現(xiàn)隨硼水平的增加,葉片中IAA 和ABA 含量降低,GA含量增加,SA 含量無顯著變化。對(duì)玉米葉面噴施萘乙酸(naphthlcetic acid,NAA)和IAA,可有效降低硼脅迫對(duì)葉片造成的氧化脅迫[35]。由此推測(cè),激素信號(hào)途徑可能是硼脅迫抑制植物生長的主要途徑,尤其是IAA信號(hào)途徑。本研究發(fā)現(xiàn),硼脅迫處理4 周后,煙葉中多個(gè)激素信號(hào)途徑相關(guān)基因表達(dá)發(fā)生變化。其中IAA 受體TIR1的表達(dá)水平顯著下調(diào);SA 信號(hào)途徑中的TGA表達(dá)水平上調(diào);乙烯信號(hào)途徑中的乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子ERF 和乙烯受體蛋白的表達(dá)水平上調(diào),暗示硼脅迫還可能激活煙葉中SA 和乙烯信號(hào)途徑。硼脅迫導(dǎo)致負(fù)調(diào)控ABA 信號(hào)的蛋白磷酸酶基因PP2C-37的表達(dá)水平下調(diào),響應(yīng)ABA的轉(zhuǎn)錄因子基因PIF1的表達(dá)水平上調(diào)[41],推測(cè)硼脅迫促進(jìn)了ABA 信號(hào)途徑信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。由于SA 和ABA 信號(hào)途徑與植物的抗病和抗逆響應(yīng)機(jī)制密切相關(guān)[34],通過檢測(cè)SA 信號(hào)途徑中的TGA、ABA 信號(hào)途徑中的PP2C 和抗病蛋白PR1 的表達(dá)變化,可為硼在煙葉抗病或抗逆機(jī)制中的應(yīng)用提供參考。