劉 華,殷冬冬,邵 穎,宋祥軍,王振宇,潘孝成,涂 健,何長生,朱良強*,祁克宗*
(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué),合肥 230036;2.安徽省動物疫病預(yù)防與控制中心,合肥 230091;3.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,合肥 230031)
豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea, PED)是由豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的接觸性傳染病[1]。PED于1971年首次在英國報道,隨后在整個歐洲流行[2]。2010年前,PED在我國區(qū)域性流行,但在2010年10月以后,PED在我國南方開始大規(guī)模流行,并很快在全國各地流行,嚴重損害了我國的養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展[3-4]。
PEDV屬于冠狀病毒屬成員,為單鏈正義RNA,基因組全長約為28 kb,包含5′、3′端非編碼區(qū)、ORF1a、ORF1b、ORF2、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6等非結(jié)構(gòu)蛋白及 S、M、E和N等結(jié)構(gòu)蛋白[5]。其中,N基因在不同的PEDV毒株之間高度保守,可以作為PEDV感染診斷的靶標[4]。
目前,通常采用病毒分離、定量實時PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增和ELISA等方法來檢測豬是否感染PEDV[6-7],但這些方法操作相對復(fù)雜,工作量較大。因此,需要一種新的技術(shù)方案來解決上述問題。研究發(fā)現(xiàn),CRISPR/Cas13a在特異性crRNA的引導(dǎo)下切割目標RNA后,其“附屬切割”活性被激活,可高效切割體系中非特異單鏈RNA[8-9]?;谶@一原理,通過設(shè)計兩端標記熒光基團的RNA探針,可使CRISPR/Cas13對RNA模板的檢測和信號放大,實現(xiàn)對目標分子的特異性檢測。重組酶輔助擴增 (recombinase aided amplification, RAA) 技術(shù)是一種恒溫快速擴增核酸的技術(shù)。該技術(shù)在37~42 ℃ 等溫條件下可短時間內(nèi)對模板進行指數(shù)級擴增,但常規(guī)RAA需要瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果判讀復(fù)雜[10]。基于CRISPR/cas13a技術(shù)的檢測方法已被應(yīng)用于檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)、禽流感病毒(avian influenza virus, AIV)、埃博拉病毒(Ebola virus, EBOV)及登革熱病毒(dengu evirus, DENV)等病毒[11-13]。因此,本研究將 CRISPR/Cas13a與RAA 技術(shù)相結(jié)合,針對 PEDVN基因設(shè)計特異性引物和探針,建立操作簡單,特異性強,靈敏度高的PEDV檢測方法,以期為PED的防控提供技術(shù)支持。
豬圓環(huán)病毒1型(porcine circovirus type 1, PCV1)、豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus type 2, PCV2)、豬圓環(huán)病毒3型(porcine circovirus type 3, PCV3)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)、豬瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)及偽狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)等陽性病料均由作者所在實驗室保存。40 份腹瀉哺乳仔豬腸道和肛門拭子樣品由第三方檢測機構(gòu)收集并提供。
病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司;LwCas13a和RAA檢測試劑盒購自安徽微分基因科技有限公司;HiScribe T7 Quick High Yield RNA合成試劑盒、T7 RNA聚合酶及RNase酶抑制劑購自NEB公司;NucawayTM離心柱購自Invitrogen公司;RNAXP 磁珠購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。
N基因長度為1 326 bp,其在不同的PEDV毒株之間高度保守,根據(jù)GenBank公布的PEDV毒株N基因序列(登錄號:KU646831、JN173276、MK584552、KM089829、MZ364314、JX647847、ON571549、MN759311、ON649885、MH726391),參照RAA引物設(shè)計原則,設(shè)計N基因特異性RAA引物見表1(單下劃線為T7啟動子序列)。此外,根據(jù)Cas13a蛋白crRNA識別靶序列的特性,在PEDV的N基因序列上設(shè)計3對特異性的crRNA探針(PEDV-crRNA1-3),引物序列如表1所示(雙下劃線為莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
表1 PEDV crRNA引物序列Table 1 PEDV crRNA primer sequences
根據(jù)GenBank公布的PEDV AH2012/12株(登錄號:KU646831),由生工生物工程(上海)股份有限公司將N基因合成,并連接至載體pUC57,重組質(zhì)粒分別命名為pUC-N,測序正確的重組質(zhì)粒即為質(zhì)粒標準品。將“1.3”中合成的兩條PEDV-crRNA1-3的上、下游引物退火形成雙鏈(終濃度為10 μmol·L-1),隨后利用HiScribe T7 Quick High Yield RNA 合成試劑盒進行體外轉(zhuǎn)錄,轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物利用RNAXP 磁珠進行純化,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
參照RAA核酸檢測試劑盒說明書配制反應(yīng)體系(50 μL):25 μL預(yù)混液,3 μL MgOAc,RAA上、下游引物(10 μmol·L-1)各2 μL,1 μL待檢樣本cDNA或DNA,用RNase free H2O補至50 μL,將反應(yīng)體系震蕩離心,37 ℃孵育30 min,制備RAA產(chǎn)物。
利用LwCas13a核酸酶(45 nmol·L-1),crRNA探針(22.5 nmol·L-1),FT-RNA報告分子(125 nmol·L-1),RNase inhibitor(0.25 μL),dNTPs(1 mmol·L-1)和T7聚合酶(0.4 μL),檢測緩沖液補充至9 μL,RAA擴增產(chǎn)物1 μL,在QuantStudioTM 6 Flex實時熒光定量PCR 37 ℃反應(yīng) 40 min,每間隔5 min收集熒光信號。
以pUC-N為模板,采用“1.5”和“1.6”中的檢測方法,分別對3組crRNA進行篩選,通過擴增曲線的熒光值及起峰時間,選擇最佳檢測PEDV 的crRNA探針。
將pUC-N標準質(zhì)粒稀釋為1.0×108~ 1.0×100copies·μL-1等 9個濃度。用已建立的RAA-Cas13a檢測方法,以稀釋后的各濃度陽性質(zhì)粒為模板,通過擴增曲線確定該方法的靈敏度,同時設(shè)置RNase free H2O作為陰性對照,每組進行3次重復(fù)。
選取PCV1、PCV2、PCV3、PRRSV、CSFV和PRV等病毒作為特異性檢測對象,參照病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒說明書對上述病毒進行核酸提取。用已建立的RAA-Cas13a方法進行檢測,同時設(shè)置陰性對照,分析該檢測方法的特異性。
對40份臨床腹瀉哺乳仔豬腸道和肛門拭子樣本進行檢測,采用本研究建立的RAA-Cas13a檢測方法和RT-qPCR檢測方法[14]進行PEDV檢測,并使用SPSS軟件進行Kappa一致性檢驗,以評估該方法的臨床實用性。
將合成的N基因進行PCR驗證,結(jié)果顯示,在目標大小處有特異性條帶,經(jīng)測序證實為PEDV N基因(圖1)。此外,由圖2A可知,RAA引物擴增產(chǎn)物檢測峰圖在222 bp處有單峰,表明引物特異性良好。通過建立的RAA-Cas13a方法比較和篩選已制備的3組PEDV-crRNA,結(jié)果如圖2B所示crRNA-2與其他2組相比,熒光值最高且起峰時間最短。因此,選擇PEDV-crRNA-2用于后續(xù)試驗。
圖1 pUC-N質(zhì)粒PCR擴增結(jié)果Fig.1 The results of PCR amplification of pUC-N plasmid
A. RAA引物擴增產(chǎn)物檢測峰圖;B. crRNA篩選結(jié)果A. RAA primer amplification product detection peak; B. The screening result of crRNA圖2 RAA引物驗證及crRNA篩選Fig.2 The results of validation of RAA primers and crRNA screening
以9個梯度稀釋(1.0×108~ 1.0×100copies·μL-1)的標準質(zhì)粒及RNase free H2O作為模板進行RAA-Cas13a方法的靈敏度評價。結(jié)果如圖3所示,在反應(yīng)5 min時即可檢測到1.0×101copies·μL-1的信號,表明本研究建立的RAA-Cas13a 檢測方法的檢測限為101copies·μL-1。
圖3 RAA-Cas13a 靈敏度試驗結(jié)果Fig.3 Sensitivity detection results of RAA-Cas13a
RAA-Cas13a 的分析特異性試驗檢測結(jié)果如圖4所示,僅PEDV出現(xiàn)擴增曲線,PCV1、PCV2、PCV3、PRRSV、CSFV、PRV及陰性對照均無檢測信號,表明本研究建立的方法能特異性擴增檢測出PEDV,而不與其他病毒核酸發(fā)生交叉反應(yīng),說明本檢測方法特異性強。
RAA-Cas13a分別應(yīng)用本試驗建立的RAA-Cas13a方法和RT-qPCR方法,對臨床上采集的40份樣品進行檢測。結(jié)果顯示,RAA-Cas13a的陽性率為72.5%(29/40),RT-qPCR方法的陽性率為67.5%(27/40),陽性符合率為100%,陰性符合率為84.6%(表2),總一致性為95%,Kappa=0.881(Kappa≥0.75,表示可重復(fù)性極好)。
表2 RAA-Cas13a 和 RT-qPCR 方法對臨床樣本中的 PEDV檢測結(jié)果Table 2 Detection results of clinical samples in RAA-Cas13a and RT-qPCR assays
PED是一種高度傳染性的傳染病,可引起哺乳仔豬的腹瀉、嘔吐和脫水等臨床癥狀,有高致死率,給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴重的經(jīng)濟損失[3,15-16]。目前,PEDV的疫苗保護效果較差,甚至注射過疫苗都能感染。因此,建立高效、靈敏且特異性強的PEDV檢測方法,對PEDV的流行病學(xué)調(diào)查和早期診斷具有重要意義。PEDV的實驗室檢測方法很多,但大多數(shù)檢測方法需要專業(yè)操作或特殊設(shè)備,需要在專業(yè)實驗室進行。CRISPR/Cas13a系統(tǒng)可以特異性切割目標RNA,且具有非特異性附帶切割活性,基于該原理可在反應(yīng)體系中加入非特異RNA報告探針,實現(xiàn)對靶基因的特異檢測,這為CRISPR/Cas13a系統(tǒng)在核酸檢測領(lǐng)域的應(yīng)用提供了新思路[8,17]。此外,RAA技術(shù)引物設(shè)計簡單,擴增效率高,因此,本研究將RAA技術(shù)與CRISPR/Cas13a系統(tǒng)結(jié)合,實現(xiàn)了兩種技術(shù)優(yōu)勢互補,提高檢測系統(tǒng)性,增強特異性。
本研究建立的RAA-Cas13a檢測方法的檢測限達到101copies·μL-1。Wang等[18]建立的實時熒光定量PCR方法僅能檢測出300 copies·μL-1的標準質(zhì)粒;Liu等[6]開發(fā)的基于ORF3基因建立的TaqMan探針的熒光定量PCR的檢測限為37 copies·μL-1;翟剛等[19]基于M基因建立的TaqMan檢測方法最低檢測下限為1.09×101copies·μL-1;冉偉等[20]建立SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR方法,最低可檢測102copies·μL-1的質(zhì)粒。本研究建立的RAA-Cas13a檢測法比上述方法的靈敏度更高。同時,該方法與其他6種豬源病原核酸沒有交叉反應(yīng),表明建立的方法對 PEDV 具有強特異性。為了評估該技術(shù)在臨床應(yīng)用中的可靠性,計算了RAA-Cas13a檢測與RT-qPCR的符合率,結(jié)果顯示,40份疑似樣品中,用RAA-Cas13a方法檢測出29份陽性,RT-qPCR法檢測出27份陽性,這27份陽性樣品在RAA-Cas13a中的檢測結(jié)果均為陽性,說明建立的RAA-Cas13a檢測方法比RT-qPCR靈敏度更高。此外,RAA反應(yīng)和CRSIRR/Cas13a檢測均在37 ℃下進行,全部反應(yīng)都可在一臺便攜的恒溫熒光檢測儀中完成,對硬件要求不高。
綜上所述,本研究建立的PEDV RAA-Cas13a檢測方法具有特異性強、靈敏度高、對實驗室設(shè)備要求不高等優(yōu)勢,本研究結(jié)果可為PEDV檢測提供一種新方法,為今后PED的診斷及流行病學(xué)調(diào)查提供技術(shù)支持。
本研究將RAA技術(shù)與CRISPR/Cas13a系統(tǒng)結(jié)合,建立了PEDV RAA-Cas13a檢測方法,該方法特異性強、靈敏度高、對實驗室設(shè)備要求不高、操作簡單,可為PED的診斷及流行病學(xué)調(diào)查提供技術(shù)支持。