葛根素干預(yù)軟骨氧化應(yīng)激和Nrf2/HO-1通路改善PTOA大鼠軟骨退變的機(jī)制

陳 鴻,阮紅日,馬天文,李亞楠,苗 雪,楊雯越,高 利,魏成威

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,黑龍江省動物疾病致病機(jī)制與比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實驗室,哈爾濱 150030)

骨關(guān)節(jié)炎是獸醫(yī)臨床中常見的退行性骨關(guān)節(jié)病,該病的主要特征是軟骨退變導(dǎo)致的關(guān)節(jié)穩(wěn)態(tài)失衡[1],臨床表現(xiàn)為疼痛、關(guān)節(jié)畸形和活動受限等癥狀[2]。正常的衰老、性別、遺傳的生理現(xiàn)象以及肥胖、代謝障礙、飼養(yǎng)管理不規(guī)范和外傷等多因素可驅(qū)使其發(fā)生,有時單因素存在,但常見的骨關(guān)節(jié)炎是由多種因素聯(lián)合導(dǎo)致的結(jié)果[3]。目前,獸醫(yī)臨床上骨關(guān)節(jié)炎常使用非甾體類抗炎藥治療,但僅能減輕疼痛并不能逆轉(zhuǎn)疾病,并且副作用多[4]。因此,篩選有效、安全高效的骨關(guān)節(jié)炎防治藥物尤為重要。

機(jī)體氧化應(yīng)激是骨關(guān)節(jié)炎軟骨中活性氧(reactive oxygen species,ROS)過量積累的結(jié)果,能夠?qū)е萝浌羌?xì)胞穩(wěn)態(tài)失衡,誘導(dǎo)炎癥和軟骨細(xì)胞凋亡的發(fā)生[5]。將軟骨細(xì)胞暴露于過氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2)、甲萘醌和3-嗎啉基苯胺等促氧化劑可上調(diào)其炎癥因子和趨化因子水平[6],這表明氧化應(yīng)激能夠誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2(nuclear transcription factor E2 related factor 2,Nrf2)是一種負(fù)責(zé)調(diào)控細(xì)胞氧化還原平衡的核轉(zhuǎn)錄因子。正常狀態(tài)下,Nrf2保持低轉(zhuǎn)錄水平,而在氧化應(yīng)激條件下,活化的Nrf2會與抗氧化元件結(jié)合,調(diào)控抗氧化酶血紅素氧合酶1(heme oxygenase 1,HO-1)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)表達(dá)及多種抗氧化酶的活性,發(fā)揮抗氧化作用,從而提高機(jī)體抗氧化應(yīng)激的防御能力[7]。研究發(fā)現(xiàn),使用曲古抑菌素A靶向激活Nrf2/HO-1信號通路能夠有效抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)代謝標(biāo)志物基質(zhì)金屬蛋白酶3(matrix metalloproteinase 3,MMP3)、基質(zhì)金屬蛋白酶13(matrix metalloproteinase 13,MMP13)和血小板反應(yīng)蛋白解整合素金屬肽酶4(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin 4,ADAMTS4)的表達(dá)[8]。促炎細(xì)胞因子在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制中起核心作用,可以誘導(dǎo)軟骨ECM降解并增加II型膠原酶的表達(dá),促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡[9]。近期研究發(fā)現(xiàn),激活Nrf2能夠靶向抑制NF-κB通路防止LPS誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞中IL-1β和IL-6的上調(diào)[10]。因此,基于Nrf2/HO-1通路對于解析骨關(guān)節(jié)炎致病機(jī)制及開發(fā)臨床骨關(guān)節(jié)炎靶點(diǎn)藥物具有潛在價值。

葛根素是從葛根的根部分離的一種異黃酮,其藥用價值得益于其廣泛的藥理學(xué)特性,包括抗炎、抗氧化、抗腫瘤、緩解疼痛和免疫調(diào)節(jié)等[11]。目前發(fā)現(xiàn)葛根素對骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變具有改善作用,但具體機(jī)制尚不明確。研究認(rèn)為葛根素能夠激活A(yù)MPK通路,通過促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨細(xì)胞的線粒體生物發(fā)生減輕線粒體功能障礙[12]。在碘乙酸誘導(dǎo)的小鼠骨關(guān)節(jié)炎模型中,使用葛根素干預(yù)可抑制受累關(guān)節(jié)單核細(xì)胞聚集并降低C-C趨化因子配體2的表達(dá)[13]。然而,葛根素對創(chuàng)傷后骨關(guān)節(jié)炎(post-traumatic osteoarthritis,PTOA)大鼠的軟骨氧化損傷作用和具體分子機(jī)制尚未可知。因此,本試驗通過前十字韌帶切斷(anterior cruciate ligament transection,ACLT)方法建立大鼠PTOA模型,以Nrf2/HO-1通路為切入點(diǎn),擬探究葛根素改善PTOA大鼠骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變的作用機(jī)制,為葛根素治療骨關(guān)節(jié)炎的機(jī)制提供新思路,為藥物研發(fā)和臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

葛根素(純度≥99%)購自美國Sigma公司;塞來昔布購自美國輝瑞制藥有限公司;異氟烷購自北京友誠盛達(dá)生物科技有限公司;MDA、SOD、GSH-Px和CAT測定試劑盒均購自武漢亞科因生物技術(shù)有限公司;大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α、CTX-Ⅱ和COMP的ELISA試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。BCA試劑盒、RIPA裂解液和高敏型ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。GAPDH和ADAMTS4抗體購自武漢愛博泰克生物科技有限公司,Nrf2和HO-1抗體購自英國Abcam公司,MMP3和MMP13抗體購自江蘇親科生物研究中心有限公司?？俁NA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.2 主要儀器

倒置光學(xué)顯微鏡(Leica,德國);Epoch多功能酶標(biāo)儀(BioTek,美國);超微量分光光度計(Thermo,美國);電泳儀(Bio-Rad,美國);全自動化學(xué)發(fā)光/熒光圖像分析系統(tǒng)(Tannon,中國);羅氏480實時熒光定量PCR儀(Roche,德國)。

1.3 實驗動物及分組

雄性Sprague-Dawley大鼠40只(體重200～220 g),購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院動物實驗中心。所有動物均飼養(yǎng)在溫度適宜,通風(fēng)良好的環(huán)境中。本研究所用實驗動物和試驗設(shè)計均遵循東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物實驗倫理審查相關(guān)規(guī)定。

將40只Sprague-Dawley大鼠隨機(jī)分為4組:對照組(n=8)、模型組(n=8)、塞來昔布組(n=8)和葛根素組(n=16)。葛根素組隨機(jī)分為低劑量組(n=8)和高劑量組(n=8)。

1.4 大鼠PTOA模型建立和藥物干預(yù)

適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后,采用ACLT方法建立大鼠PTOA模型。使用異氟烷吸入麻醉。大鼠右后肢剃毛,碘伏消毒,75%酒精脫碘。于大鼠右膝內(nèi)側(cè)做2 cm切口,分離皮下組織,剪開關(guān)節(jié)囊后髕骨移位,屈曲膝關(guān)節(jié),使用手術(shù)刀切斷前十字韌帶。進(jìn)行抽屜試驗確保前十字韌帶完全切斷,生理鹽水沖洗關(guān)節(jié)腔,可吸收縫線閉合關(guān)節(jié)囊和皮膚,碘伏消毒后放回籠中不限制其活動。建立模型12 h后所有大鼠正常進(jìn)食和飲水。對照組只切開關(guān)節(jié)囊后縫合進(jìn)行假手術(shù)。

手術(shù)建模后,葛根素組的大鼠每日灌胃葛根素(低劑量組按50 mg·kg-1、高劑量組按100 mg·kg-1),葛根素的干預(yù)劑量參考先前的研究[14],每天同一時間灌胃,連續(xù)干預(yù)5周。對照組和模型組大鼠給予等量生理鹽水,塞來昔布組大鼠灌服2.86 mg·kg-1塞來昔布[15]。給藥結(jié)束后,所有大鼠實施安樂死。

1.5 大鼠關(guān)節(jié)腫脹和疼痛行為學(xué)檢測

在手術(shù)建模之前,各組大鼠進(jìn)行右膝關(guān)節(jié)腫脹程度和疼痛行為學(xué)檢測,記錄為第0周。然后在建模后的第1、2、3、4和5周各檢測一次,共計6次。

1.5.1 關(guān)節(jié)腫脹程度檢測 根據(jù)Abo-Zalam等[16]的方法,使用電子游標(biāo)卡尺測量每組大鼠的膝關(guān)節(jié)寬度(單位:cm),計算與第0周的差值代表大鼠膝關(guān)節(jié)的腫脹程度。

1.5.2 冷敏感反應(yīng)檢測 根據(jù)Katri等[17]的方法,將大鼠放在金屬網(wǎng)地板安靜15 min后,從金屬網(wǎng)下方將丙酮涂抹在大鼠右后爪中部,觀察各組大鼠20 s內(nèi)的行為變化并評分。評分標(biāo)準(zhǔn):0=無反應(yīng);1=快速回縮右后爪或迅速拍打,反應(yīng)時間<1 s;2=長時間回縮或重復(fù)拍打,反應(yīng)時間1～3 s;3=重復(fù)回縮或舔右后爪,反應(yīng)時間3～10 s;4=長時間舔右后爪,反應(yīng)時間>10 s。每只大鼠重復(fù)操作3次,每次間隔10 min,記錄3次評分總和。

1.5.3 膝關(guān)節(jié)伸膝發(fā)聲檢測 根據(jù)前人的方法[18]。同一助手固定大鼠右側(cè)大腿,使膝關(guān)節(jié)處于靜息狀態(tài)(自然微屈),握住踝關(guān)節(jié),使膝關(guān)節(jié)伸展(在膝關(guān)節(jié)運(yùn)動的生理范圍內(nèi)進(jìn)行),關(guān)節(jié)伸展引起大鼠“吱吱聲”反應(yīng)行為記1分,無反應(yīng)記0分。連續(xù)5次,記錄伸展期間大鼠的發(fā)聲總分。

1.6 大鼠膝關(guān)節(jié)病理改變及Mankin評分

將各組大鼠脛骨和股骨樣本固定于4%多聚甲醛固定液中,對樣本進(jìn)行脫鈣、包埋、制作石蠟切片,進(jìn)行HE染色。HE染色結(jié)束后,通過顯微鏡捕獲圖像,并通過改良的Mankin分級系統(tǒng)[19]進(jìn)行病理組織學(xué)評估。

1.7 微板法檢測大鼠氧化應(yīng)激標(biāo)志物

取大鼠右膝關(guān)節(jié)軟骨組織,加入RIPA后用超聲破碎儀進(jìn)行裂解,4 ℃下13 000g離心10 min,過濾并取上清。嚴(yán)格按照試劑盒說明書,對軟骨組織中MDA含量進(jìn)行檢測。采集大鼠血液,室溫1 000g離心20 min,取上清液。按照試劑盒說明書,對血清中氧化應(yīng)激指標(biāo)超氧化物岐化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)和過氧化氫酶(catalase,CAT)活性進(jìn)行檢測,使用多功能酶標(biāo)儀測定吸光值。

1.8 ELISA法檢測大鼠血清中軟骨代謝標(biāo)志物和炎癥標(biāo)志物

嚴(yán)格按照試劑盒說明書,使用ELISA法對軟骨代謝標(biāo)志物II型膠原羧基末端肽(C-terminal type II collagen telopeptide,CTX-II)和軟骨寡聚基質(zhì)蛋白(Cartilage oligomeric matrix protein,COMP)以及炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α含量進(jìn)行檢測,使用多功能酶標(biāo)儀測定吸光值。

1.9 qRT-PCR檢測軟骨中Nrf2和HO-1 mRNA變化

使用Trizol試劑提取軟骨組織總RNA。使用Nanodrop 2000型超微量紫外分光光度計檢測各組RNA濃度及純度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書獲取樣品cDNA模板,以ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑進(jìn)行熒光定量PCR,檢測軟骨組織Nrf2和HO-1 mRNA的表達(dá)。引物序列如表1,其中,GAPDH為內(nèi)參基因。20 μL反應(yīng)體系:2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL,上、下游引物各0.4 μL,cDNA 2 μL,補(bǔ)充無RNA酶水至20 μL。PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性95 ℃ 30 s;循環(huán)反應(yīng)95 ℃ 10 s和60 ℃ 30 s,共40個循環(huán)。使用2-ΔΔCt法計算各基因相對表達(dá)水平。

表1 qRT-PCR檢測的引物序列Table 1 The primer sequences used in qPCR assay

1.10 Western blot檢測軟骨中Nrf2/HO-1通路及ECM代謝標(biāo)志物的表達(dá)

取大鼠右膝關(guān)節(jié)軟骨組織,加入1 mL PBS勻漿化。使用RIPA裂解液從軟骨組織中提取總蛋白。使用BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度后,使用8%～12% SDS-PAGE凝膠分離相同數(shù)量的蛋白質(zhì)。將蛋白質(zhì)條帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉1.5 h后,4 ℃下與一抗孵育過夜,比例如下:Nrf2(1∶1 500)、HO-1(1∶1 000)、MMP3(1∶1 000)、MMP13(1∶1 000)、ADAMTS4(1∶1 000)和GAPDH(1∶2 000)。二抗室溫孵育1 h后,使用高敏型ECL化學(xué)發(fā)光試劑在Tannon自動凝膠圖像分析系統(tǒng)獲得蛋白印跡條帶。使用ImageJ軟件分析蛋白質(zhì)灰度值。

1.11 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 葛根素對PTOA大鼠關(guān)節(jié)腫脹和疼痛的影響

2.1.1 葛根素緩解PTOA大鼠關(guān)節(jié)腫脹 葛根素干預(yù)后,大鼠膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)腫脹程度檢測結(jié)果如表2所示,術(shù)后的5周內(nèi),模型組大鼠關(guān)節(jié)寬度差逐漸增加,與對照組相比變化極顯著(P<0.01),關(guān)節(jié)腫脹嚴(yán)重。塞來昔布組和葛根素高劑量給藥組從給藥第3周至給藥結(jié)束,關(guān)節(jié)寬度差與模型組相比呈顯著下降趨勢(P<0.05);葛根素低劑量組給藥第5周關(guān)節(jié)寬度差與模型組相比出現(xiàn)極顯著減少(P<0.01)。

表2 葛根素干預(yù)后PTOA大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度檢測結(jié)果Table 2 Detection results of joint swelling degree of PTOA rats after puerarin intervention cm

2.1.2 葛根素緩解PTOA大鼠疼痛癥狀 葛根素干預(yù)后,大鼠冷敏感反應(yīng)結(jié)果如表3所示,術(shù)后的5周內(nèi),與對照組相比,模型組大鼠冷敏感反應(yīng)評分極顯著增加(P<0.01)。塞來昔布組和葛根素高劑量給藥組從給藥第2周至給藥結(jié)束,冷敏感反應(yīng)評分與模型組相比呈極顯著下降趨勢(P<0.01)。

表3 葛根素干預(yù)后PTOA大鼠冷敏感反應(yīng)評分檢測結(jié)果Table 3 Detection results of cold sensitivity score of PTOA rats after puerarin intervention

葛根素干預(yù)對大鼠膝關(guān)節(jié)伸膝發(fā)聲檢測結(jié)果如表4結(jié)果所示,與對照組比較,術(shù)后的5周內(nèi),模型組發(fā)聲次數(shù)極顯著增加(P<0.01)。與模型組相比,塞來昔布組和葛根素高劑量給藥組從給藥第2周至給藥結(jié)束,發(fā)聲次數(shù)極顯著減少(P<0.01);葛根素低劑量組從給藥第3周至給藥結(jié)束,發(fā)聲次數(shù)極顯著減少(P<0.01)。以上結(jié)果說明,葛根素能夠有效減少ACLT誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)腫脹,改善冷敏感和伸膝發(fā)聲行為,對緩解PTOA大鼠關(guān)節(jié)腫脹和疼痛癥狀具有積極作用。

表4 葛根素干預(yù)后PTOA大鼠伸膝發(fā)聲(次數(shù))檢測結(jié)果Table 4 Detection results of knee extension sound (number) in PTOA rats after puerarin intervention

2.2 葛根素對PTOA大鼠關(guān)節(jié)軟骨病理損傷的影響

各組大鼠脛骨和股骨的HE染色代表圖像如圖1所示。A1～E1為脛骨圖像,A2～E2為股骨圖像。對照組(圖1A1、A2)關(guān)節(jié)軟骨表面光滑,結(jié)構(gòu)完整,層次清晰,軟骨細(xì)胞排列規(guī)則。模型組(圖1B1、B2)軟骨損傷嚴(yán)重,表面凹凸不平,軟骨細(xì)胞排列紊亂且丟失嚴(yán)重。塞來昔布組(圖1C1、C2)軟骨表面不光滑,表層軟骨細(xì)胞排列較規(guī)則。葛根素低劑量組(圖1D1、D2)軟骨表面較粗糙,炎性細(xì)胞浸潤較多,軟骨細(xì)胞空泡化較模型組少。葛根素高劑量組(圖1E1、E2)軟骨表面輕微粗糙,表層軟骨細(xì)胞排列較規(guī)則,軟骨細(xì)胞無肥大和丟失情況。如圖2所示,與對照組相比,模型組和葛根素低劑量組Mankin評分極顯著升高(P<0.01),葛根素高劑量組評分與對照組相比無差異顯著。以上結(jié)果說明,葛根素干預(yù)有效地減少了PTOA造模導(dǎo)致的大鼠軟骨細(xì)胞丟失,改善軟骨損傷,且高劑量葛根素組的效果更好。

A1、A2.對照組; B1、B2.模型組; C1、C2.塞來昔布組; D1、D2.葛根素低劑量組; E1、E2.葛根素高劑量組A1, A2. Control group; B1, B2. Model group; C1, C2. Celecoxib group; D1, D2. Puerarin low-dose group; E1,E2. Puerarin high-dose group圖1 PTOA大鼠膝關(guān)節(jié)病理組織學(xué)觀察Fig.1 Histopathological observation of PTOA rats knee joint

與對照組比較,*. P<0.05,**. P<0.01Compared with the control group, *.P<0.05,**.P<0.01圖2 PTOA大鼠膝關(guān)節(jié)Mankin評分Fig.2 Mankin score of PTOA rats knee joint

2.3 葛根素對PTOA大鼠軟骨中ECM代謝標(biāo)志物的影響

如圖3所示,與對照組相比,模型組軟骨中MMP3、MMP13和ADAMTS4含量極顯著升高(P<0.01)。與模型組相比,塞來昔布組軟骨中MMP3和MMP13含量極顯著下降(P<0.01);葛根素低劑量組MMP3和ADAMTS4含量顯著下降(P<0.05);葛根素高劑量組軟骨中MMP3和ADAMTS4含量極顯著下降(P<0.01),MMP13含量顯著下降(P<0.05)。以上結(jié)果說明,葛根素干預(yù)能有效地降低軟骨ECM代謝標(biāo)志物的含量,發(fā)揮抗PTOA軟骨基質(zhì)降解的作用。

與對照組比較,*. P<0.05,**. P<0.01;與模型組比較,#. P<0.05,##. P<0.01;下圖同Compared with the control group, *. P<0.05,**. P<0.01. Compared with the moderl group, #. P<0.05,##. P<0.01. The same as below圖3 葛根素對PTOA大鼠軟骨中ECM代謝標(biāo)志物含量的影響Fig.3 Effect of puerarin on the content of ECM metabolic markers in the cartilage of PTOA rats

2.4 葛根素對PTOA大鼠軟骨中MDA含量的影響

如圖4所示,與對照組相比,模型組軟骨中MDA含量極顯著升高(P<0.01)。與模型組相比,葛根素高劑量組和塞來昔布組軟骨中MDA含量極顯著下降(P<0.01),葛根素低劑量組顯著下降(P<0.05)。

圖4 葛根素對PTOA大鼠軟骨中MDA含量的影響Fig.4 Effect of puerarin on the content of MDA in cartilage tissue of PTOA rats

2.5 葛根素對PTOA大鼠血清中抗氧化酶活力的影響

如圖5所示,與對照組相比,模型組SOD和GSH-Px活力極顯著下降(P<0.01),CAT活力顯著下降(P<0.05)。與模型組相比,葛根素高劑量組和塞來昔布組血清中SOD、GSH-Px和CAT活力極顯著升高(P<0.05)。以上結(jié)果說明,葛根素干預(yù)能有效地增強(qiáng)大鼠抗氧化酶活力,增強(qiáng)機(jī)體抗氧化應(yīng)激的能力。

圖5 葛根素對PTOA大鼠血清中SOD、GAH-Px和CAT活力的影響Fig.5 Effect of puerarin on the activity of SOD, GAH-Px and CAT in serum of PTOA rats

2.6 葛根素通過Nrf2/HO-1通路改善PTOA大鼠軟骨氧化損傷

如圖6所示,與對照組比較,模型組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨中Nrf2和HO-1 mRNA水平無顯著性變化,塞來昔布組和葛根素高劑量組中Nrf2和HO-1 mRNA水平顯著極升高(P<0.01)。與模型組比較,塞來昔布組Nrf2 mRNA水平顯著極升高(P<0.01),HO-1 mRNA水平顯著升高(P<0.05),葛根素高劑量組中Nrf2和HO-1 mRNA水平極顯著升高(P<0.01)。如圖7所示,與對照組比較,模型組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨中Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)無顯著性變化,塞來昔布組和葛根素高劑量組中Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)極顯著升高(P<0.01)。與模型組比較,葛根素高劑量組中Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)水平極顯著(P<0.01)升高。綜上所述,葛根素能夠激活大鼠軟骨的Nrf2/HO-1通路,通過調(diào)控Nrf2/HO-1通路改善骨關(guān)節(jié)炎大鼠氧化損傷。

圖6 葛根素對PTOA大鼠軟骨Nrf2/HO-1通路mRNA表達(dá)的影響Fig.6 Effect of puerarin on mRNA expression of Nrf2/HO-1 pathway in cartilage tissue of PTOA rats

圖7 葛根素對PTOA大鼠軟骨Nrf2/HO-1通路蛋白質(zhì)表達(dá)的影響Fig.7 Effect of puerarin on protein expression of Nrf2/HO-1 pathway in cartilage tissue of PTOA rats

2.7 葛根素對PTOA大鼠血清中炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的影響

由圖8所示,與對照組相比,模型組和葛根素低劑量組血清中的IL-1β、IL-6和TNF-α濃度極顯著升高(P<0.01),塞來昔布組血清IL-1β和IL-6濃度顯著升高(P<0.05)。葛根素高劑量組和塞來昔布組血清中的IL-1β、IL-6和TNF-α濃度與模型組相比顯著下降(P<0.01),葛根素高劑量組IL-1β、IL-6和TNF-α與對照組相比較無顯著差異。以上結(jié)果說明,葛根素干預(yù)能降低機(jī)體炎癥因子的水平。

圖8 葛根素對PTOA大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的影響Fig.8 Effects of puerarin on IL-1β, IL-6 and TNF-α in serum of PTOA rats

2.8 葛根素對PTOA大鼠血清中軟骨代謝標(biāo)志物CTX-Ⅱ和COMP的影響

如圖9所示,與對照組相比,模型組和葛根素低劑量組血清中CTX-Ⅱ和COMP濃度極顯著升高(P<0.01),塞來昔布組血清中CTX-Ⅱ和COMP濃度與對照組相比有顯著差異(P<0.05)。與模型組相比,葛根素高劑量組血清中CTX-Ⅱ濃度極顯著下降(P<0.01),COMP濃度顯著下降(P<0.05),塞來昔布組CTX-Ⅱ和COMP濃度顯著下降(P<0.05);與對照組相比,葛根素高劑量組COMP濃度無顯著變化。以上結(jié)果說明,葛根素干預(yù)能有效地降低血清中軟骨代謝標(biāo)志物CTX-Ⅱ和COMP的水平。

圖9 葛根素對PTOA大鼠血清中CTX-II和COMP的影響Fig.9 Effects of puerarin on CTX-II and COMP in serum of PTOA rats

3 討 論

骨關(guān)節(jié)炎是一種漸進(jìn)性關(guān)節(jié)疾病,如不能及時發(fā)現(xiàn)和治療,將對動物骨關(guān)節(jié)造成不可逆性損傷,導(dǎo)致動物運(yùn)動障礙,嚴(yán)重影響動物的健康和生活質(zhì)量,同時也造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。臨床常用的非甾體類抗炎藥副作用大,且治療效果欠佳,臨床獸醫(yī)師對許多頑固性骨關(guān)節(jié)炎依然束手無策。葛根素具有抗炎、抗氧化和緩解疼痛等藥理作用[11]。本研究通過檢測各組大鼠的膝關(guān)節(jié)腫脹和疼痛反應(yīng),并在給藥結(jié)束后關(guān)節(jié)軟骨病理切片進(jìn)行觀察與評分,對血清中軟骨代謝標(biāo)志物(CTX-II和COMP)、抗氧化酶(SOD、GSH-Px和CAT)活性、炎癥因子(IL-1β、TNF-α和IL-6)以及軟骨中MDA含量、ECM代謝標(biāo)志物(MMP3、MMP13和ADAMTS4)含量和Nrf2/HO-1通路的蛋白和基因進(jìn)行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn),葛根素能夠改善PTOA大鼠關(guān)節(jié)腫脹和疼痛程度,并通過調(diào)控Nrf2/HO-1通路改善軟骨氧化損傷和炎癥反應(yīng),抑制大鼠骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展,為獸醫(yī)臨床防治骨關(guān)節(jié)炎提供更多的選擇。

在骨關(guān)節(jié)炎病理狀態(tài)下,軟骨細(xì)胞的線粒體功能障礙導(dǎo)致ROS過度產(chǎn)生[20]。機(jī)體內(nèi)存在的天然ROS清除系統(tǒng),主要包括SOD、CAT和GSH-Px。SOD常與MDA共同反映機(jī)體清除ROS的能力以及機(jī)體受ROS損傷的嚴(yán)重程度,CAT和GSH-Px反映清除過氧化氫和脂質(zhì)過氧化物的水平,反映機(jī)體抗氧化損傷的能力?？寡趸傅幕钚允艿揭种茣?dǎo)致機(jī)體對ROS的清除率降低,引起氧化和抗氧化失衡,積累的ROS能夠通過調(diào)節(jié)NF-κB[21]、MAPK和Nrf2[22]等途徑誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡和壞死,同時下調(diào)軟骨ECM的合成代謝標(biāo)志物(Ⅱ型膠原和蛋白聚糖)的表達(dá),上調(diào)分解代謝標(biāo)志物(MMP3、MMP13和ADAMTS4)的表達(dá),破壞ECM的代謝平衡,從而導(dǎo)致軟骨退變。氧化應(yīng)激除直接導(dǎo)致軟骨損傷,還參與骨關(guān)節(jié)炎炎癥的發(fā)生。LPS刺激軟骨細(xì)胞產(chǎn)生的ROS能夠?qū)е翹LRP3炎癥小體的激活,而抑制Nrf2抗氧化途徑能夠?qū)е翹LRP3介導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎炎癥反應(yīng)上調(diào)[23]。IL-1β是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展的主要促炎因子,通過增強(qiáng)ECM代謝標(biāo)志物MMP3、MMP13和ADAMTS4的表達(dá)促進(jìn)軟骨ECM降解,同時刺激線粒體產(chǎn)生ROS導(dǎo)致軟骨細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡和壞死,引起關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)和功能的損傷[24]。TNF-α和IL-6除了與IL-1β相似的作用,還能促進(jìn)軟骨細(xì)胞分泌纖維蛋白溶酶,直接或間接誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)[25]。此外,IL-1β、TNF-α和IL-6可以誘導(dǎo)前列腺素的產(chǎn)生,并抑制蛋白聚糖和II型膠原蛋白的合成[26]。II型膠原降解后CTX-II會釋放到血液循環(huán)系統(tǒng)中后隨尿液排出,COMP是軟骨中的非膠原蛋白成分,能夠反映軟骨退變程度。骨關(guān)節(jié)炎會引起血清中CTX-II和COMP水平升高,并隨著骨關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度的增加,CTX-II和COMP水平也會相應(yīng)增加[27],可以潛在地預(yù)測早期關(guān)節(jié)軟骨的破壞。在本研究中,ACLT方法誘導(dǎo)大鼠PTOA模型5周后,模型組軟骨中MDA以及ECM代謝標(biāo)志物MMP3、MMP13和ADAMTS4的含量升高,血清中抗氧化酶SOD、GSH-Px和CAT活力顯著降低,炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)量顯著升高,軟骨代謝標(biāo)志物CTX-II和COMP含量顯著升高。而使用高劑量葛根素干預(yù)后,與模型組相比,軟骨中MDA以及ECM代謝標(biāo)志物MMP3、MMP13和ADAMTS4的含量顯著下降,血清中抗氧化酶SOD、GSH-Px和CAT活力顯著升高,炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)量顯著下降,軟骨代謝標(biāo)志物CTX-II和COMP含量顯著下降。這說明葛根素干預(yù)能夠有效改善PTOA大鼠的氧化應(yīng)激和炎癥水平,提高機(jī)體的抗氧化能力,降低軟骨ECM代謝標(biāo)志物的表達(dá),抑制炎癥因子導(dǎo)致的軟骨ECM降解。

ROS升高能夠使細(xì)胞質(zhì)中的Keap1失活,導(dǎo)致軟骨細(xì)胞的Nrf2的清除受阻,積累的Nrf2易位到細(xì)胞核中,促進(jìn)HO-1的產(chǎn)生,誘導(dǎo)細(xì)胞自噬,發(fā)揮抗氧化作用[7],并通過增加抗氧化蛋白的表達(dá),減少炎癥和氧化應(yīng)激[28]。有研究發(fā)現(xiàn),敲除Nrf2可加速骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展[29]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多天然產(chǎn)物可以通過Nrf2/HO-1通路平衡軟骨細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)[30-32]。葛根素作為一種異黃酮,具有良好的抗氧化能力[33]。在本研究中,ACLT方法誘導(dǎo)大鼠PTOA模型5周后,模型組軟骨中Nrf2和HO-1的基因和蛋白與對照組無顯著性差異。而使用高劑量葛根素干預(yù)后,Nrf2和HO-1的基因和蛋白水平均上調(diào),說明Nrf2/HO-1通路被激活。這表明,葛根素能夠激活PTOA大鼠中的Nrf2/HO-1通路并提高抗氧化能力。各組PTOA大鼠在葛根素干預(yù)后的關(guān)節(jié)腫脹和疼痛行為學(xué)檢測結(jié)果以及關(guān)節(jié)軟骨病理切片的評分的變化表明,葛根素能夠有效緩解PTOA引起的關(guān)節(jié)腫脹和疼痛癥狀,改善軟骨退變,抑制骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展。

綜上所述,本試驗發(fā)現(xiàn)葛根素能夠激活PTOA大鼠軟骨中的Nrf2/HO-1通路,發(fā)揮抗氧化和抗炎作用,抑制大鼠軟骨退變。此外,發(fā)現(xiàn)葛根素能夠減輕PTOA疼痛程度,但具體作用機(jī)制需要進(jìn)一步研究。本試驗為今后葛根素在獸醫(yī)臨床上的應(yīng)用提供資料和研究基礎(chǔ),為相關(guān)靶點(diǎn)藥物的研究提供理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

葛根素能夠抑制創(chuàng)傷后骨關(guān)節(jié)炎大鼠的關(guān)節(jié)腫脹和疼痛反應(yīng),并通過激活Nrf2/HO-1通路發(fā)揮抗炎和抗氧化作用,從而改善大鼠軟骨退變。