小鼠黑色素細(xì)胞沉默及過(guò)表達(dá)色素上皮衍生因子對(duì)黑色素合成的影響

梁 睿,范小瑞,張晉強(qiáng),龐全海*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,太谷 030801;2.中華人民共和國(guó)晉陽(yáng)海關(guān),太原 030027)

在哺乳動(dòng)物皮膚組織中,黑色素的數(shù)量及類(lèi)型對(duì)毛色起重要作用[1]。同時(shí),黑色素是動(dòng)物皮膚組織的“遮陽(yáng)傘”,保護(hù)動(dòng)物機(jī)體皮膚免受太陽(yáng)紫外線(xiàn)輻射引起的DNA損傷和突變[2]。胚胎時(shí)期的神經(jīng)嵴細(xì)胞(neural crest cells, NCC)是黑色素前體細(xì)胞的起源,前體細(xì)胞經(jīng)逐步分化、發(fā)育形成黑色素細(xì)胞,黑色素由黑色素細(xì)胞中的細(xì)胞器黑色素小體產(chǎn)生[3]。黑色素的合成及動(dòng)物皮膚組織色素沉著受到多種遺傳基因和發(fā)育途徑的調(diào)控[4]。Wnt信號(hào)通路在神經(jīng)嵴黑色素細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程中具有重要作用,研究證實(shí),增強(qiáng)Wnt1信號(hào)能夠使具有內(nèi)皮素3(endothelin 3,EDN3)依賴(lài)性的神經(jīng)嵴黑色素細(xì)胞數(shù)量增加,增強(qiáng)神經(jīng)嵴黑色素細(xì)胞的色素沉著[5]。Wnt3α通過(guò)經(jīng)典通路在黑色素細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程中起重要的調(diào)控作用,可以促進(jìn)神經(jīng)嵴細(xì)胞分化為黑色素細(xì)胞[6],可顯著增強(qiáng)酪氨酸蛋白激酶活性和黑色素的合成[7],缺乏Wnt1和Wnt3α的突變小鼠幾乎完全缺失神經(jīng)嵴細(xì)胞起源的黑色素細(xì)胞[8]。小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(microphthalmia-associated transcription factor, MITF)是黑色素細(xì)胞發(fā)育、生存和發(fā)揮功能的重要調(diào)節(jié)因子,MITF基因缺失的小鼠表現(xiàn)出神經(jīng)嵴來(lái)源的黑色素細(xì)胞丟失[9-10]。這些因子之間存在相互作用,Wnt3α通過(guò)作用于黑色素母細(xì)胞維持MITF的表達(dá),從而促進(jìn)黑色素母細(xì)胞分化形成黑色素細(xì)胞[11],也可通過(guò)上調(diào)MITF的表達(dá),增加酪氨酸酶活性,促進(jìn)黑色素合成[6]。經(jīng)典Wnt通路通過(guò)β-catenin的積累實(shí)現(xiàn),因此也稱(chēng)作Wnt/β-catenin通路[12],β-catenin與MITF的近端啟動(dòng)子存在相關(guān)性[13],提示β-catenin在黑色素生成中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor, PEDF)是一種50 ku的分泌型糖蛋白,屬于非抑制性絲氨酸家族[14]。研究證實(shí),在人黑色素細(xì)胞中,存在PEDF的表達(dá),且PEDF蛋白在健康皮膚組織的表達(dá)量最高,其次是色素痣,在黑色素瘤的表達(dá)量最低[15];PEDF對(duì)黑色素細(xì)胞的過(guò)度增殖有抑制作用[16]。

雖然PEDF對(duì)黑色素細(xì)胞的生物學(xué)活性和黑色素的合成具有調(diào)控作用,但具體的調(diào)控機(jī)制尚不清楚,調(diào)控黑色素合成的關(guān)鍵因子與PEDF之間是否存在互作關(guān)系也尚不明確。因此,本研究選取小鼠黑色素細(xì)胞,探索PEDF與黑色素合成相關(guān)因子之間是否存在互作關(guān)系,以期探索PEDF對(duì)哺乳動(dòng)物皮膚組織黑色素合成的調(diào)控作用。為進(jìn)一步研究動(dòng)物毛色形成提供基礎(chǔ),同時(shí)也為動(dòng)物經(jīng)濟(jì)性狀育種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

選取出生1 d以?xún)?nèi)的野生型C57BL/6小鼠,雄性和雌性各3只,取下整塊背部皮膚(經(jīng)山西農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批),用于黑色素細(xì)胞的分離培養(yǎng)。

1.2 主要試劑

RNA提取試劑盒(上海生工生物技術(shù)股份有限公司),反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司),RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑PMSF(上海碧云天生物技術(shù)有限公司),BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、ECL顯色液、DAPI試劑(中杉金橋生物技術(shù)有限公司),siRNA(通用生物股份有限公司);脂質(zhì)體2000(Invitrogen公司);腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC316-mCMV-EGFP(Stratagene)、腺病毒輔助質(zhì)粒pBHGlox(delta)E1,3Cre(Microbix)、DH5α感受態(tài)細(xì)胞(Thermo公司)。

多克隆兔抗PEDF抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司),Wnt1和Wnt3α兔抗多克隆抗體、MITF、β-catenin和GAPDH兔抗單克隆抗體(Abcam)、HRP-驢抗兔IgG(北京索萊寶科技有限公司),驢抗兔Alexa FluorTMPlus 594熒光二抗(Thermo公司)。

1.3 小鼠黑色素細(xì)胞的分離培養(yǎng)

分別取小鼠整塊背部皮膚,置入含雙抗的PBS中,0.25%的Dispase Ⅱ酶4 ℃過(guò)夜消化。分離表皮與真皮,將表皮剪碎置于0.25%的胰蛋白酶中37 ℃水浴消化。加終止液終止消化,過(guò)濾并離心。棄上清,加入DMEM培養(yǎng)基,部分進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。剩余部分置入6孔培養(yǎng)板中37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)1 h,更換黑色素細(xì)胞專(zhuān)用培養(yǎng)基。培養(yǎng)至小鼠黑色素細(xì)胞的細(xì)胞密度達(dá)到90%左右時(shí),0.25%胰蛋白酶消化液37 ℃消化,終止。離心棄上清,加入RPMI-1640培養(yǎng)基重懸培養(yǎng)。

1.4 siRNA的合成與轉(zhuǎn)染黑色素細(xì)胞

根據(jù)GenBank中已登錄的小鼠PEDFmRNA序列(NM_011340.3),參考siRNA設(shè)計(jì)原則,設(shè)計(jì)合成3對(duì)siRNA及陰性對(duì)照。用于PEDF基因沉默的siRNA由通用生物技術(shù)有限公司通過(guò)常規(guī)化學(xué)合成,詳細(xì)的序列信息見(jiàn)表1。黑色素細(xì)胞生長(zhǎng)到占六孔板面積60%～80%,進(jìn)行轉(zhuǎn)染。設(shè)置陰性對(duì)照組(negative control, NC)、PEDF-siRNA組(包括PEDF-siRNA1、PEDF-siRNA2、PEDF-siRNA3)。首先,制備N(xiāo)C、siRNA稀釋液:用100 μL不含血清雙抗的培養(yǎng)基分別稀釋NC、PEDF-siRNA1、PEDF-siRNA2、PEDF-siRNA3,終濃度為100 nmol·L-1。其次,制備轉(zhuǎn)染試劑:用100 μL不含血清雙抗的培養(yǎng)基稀釋2 μL脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑,混勻,常溫靜置5 min。最后,將轉(zhuǎn)染試劑與NC、siRNA稀釋液混勻,室溫靜置20 min。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入6孔板中,200 μL·孔-1,前后輕搖細(xì)胞板混合均勻,細(xì)胞板置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,提取總蛋白和RNA進(jìn)行測(cè)定。

表1 PEDF-siRNA序列Table 1 PEDF-siRNA sequences

1.5 PEDF過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建與電轉(zhuǎn)染黑色素細(xì)胞

提取小鼠黑色素細(xì)胞RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,根據(jù)GenBank中已登錄的小鼠PEDFmRNA序列(NM_011340.3),設(shè)計(jì)合成一對(duì)PEDF特異性引物,引物序列為F:5′-ATGCAGGCCCTGGTGCTACT-3′;R:5′-TTAAGTACTACTGGGGTCCA-3′。以小鼠黑色素細(xì)胞cDNA為模板擴(kuò)增獲得PEDFcDNA片段,將該片段亞克隆于質(zhì)粒pDC316-EGFP-cmv中,獲得重組的腺病毒穿梭質(zhì)粒:pDC316-EGFP-cmv-PEDF。通過(guò)雙酶切的方式對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定,鑒定正確后共轉(zhuǎn)染:通過(guò)脂質(zhì)體2000,將重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC316-EGFP-cmv-PEDF與腺病毒輔助質(zhì)粒pBHGlox(delta)E1,3Cre,共轉(zhuǎn)染至DH5α感受態(tài)細(xì)胞。在DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,兩質(zhì)粒發(fā)生同源重組,即可獲得重組腺病毒rAd-PEDF。制備高滴度病毒液,TCID50法測(cè)定病毒滴度,將病毒滴度調(diào)整為1012copies·mL-1。取5×106個(gè)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期黑色素細(xì)胞懸液,1 000 r·min-1離心4 min。將細(xì)胞沉淀懸浮于210 μL DPBS,并轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中,分別加入空載病毒(overexpression control, OE-con)、PEDF基因過(guò)表達(dá)腺病毒(overexpressionPEDF, OE-PEDF),輕輕混勻。轉(zhuǎn)移至電擊杯中,確定電擊杯中溶液無(wú)氣泡,且液面凸起后,蓋上電擊杯蓋并置于電轉(zhuǎn)儀,設(shè)定好電轉(zhuǎn)條件后進(jìn)行電轉(zhuǎn)。待顯示峰圖正常后取出細(xì)胞液轉(zhuǎn)移至六孔板培養(yǎng)基中。細(xì)胞板置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,提取總蛋白和RNA進(jìn)行測(cè)定。

1.6 黑色素細(xì)胞活力和黑色素含量檢測(cè)

MTT法檢測(cè)每組黑色素細(xì)胞活力;每組黑色素細(xì)胞用0.25%胰酶消化后收集,PBS沖洗2～3次,細(xì)胞計(jì)數(shù)后,用0.2 mol·L-1NaOH溶解黑色素細(xì)胞,使用475 nm波長(zhǎng)的分光光度計(jì)檢測(cè)黑色素含量,每組重復(fù)3次。

1.7 RNA的提取和qRT-PCR檢測(cè)

參照NCBI小鼠PEDF、GAPDH、Wnt1、Wnt3α、MITF和β-catenin基因序列,利用primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物,送北京華大基因公司合成。引物序列見(jiàn)表2。參照RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取黑色素細(xì)胞的總RNA,測(cè)定濃度,參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系包括(20 μL):Total RNA 500 ng、Random Primer 1 μL,2×ES reaction Mix 10 μL,EasyScript ? RT/RI Enzyme Mix 1 μL,gDNA Remover 1 μL,加入無(wú)RNase-free Water至20 μL后,25 ℃孵育10 min, 42 ℃孵育15 min, 85 ℃孵育5 s。

表2 本試驗(yàn)中所用的引物Table 2 Primers used in the test

以沉默和過(guò)表達(dá)PEDF后小鼠黑色素細(xì)胞cDNA為模板,檢測(cè)PEDF、Wnt1、Wnt3α、MITF和β-cateninmRNA水平的表達(dá)情況。按照SYBR Premix Ex TapTMⅡ 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行qRT-PCR,通過(guò)2-ΔΔCt法計(jì)算目的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.8 蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

根據(jù)蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取黑色素細(xì)胞的總蛋白,使用BCA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。制備目的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,電泳結(jié)束,轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。PVDF膜經(jīng)5%脫脂奶粉室溫封閉2 h;加入PEDF、Wnt1、Wnt3α、MITF、β-catenin和內(nèi)參GAPDH(1∶3 000稀釋)一抗4 ℃過(guò)夜孵育;次日取出PVDF膜,用TBST清洗3×10 min,分別加入1∶3000稀釋的驢抗兔IgG-HRP,37 ℃孵育1 h,TBST反復(fù)清洗6×5 min,使用ECL試劑盒顯色,并使用ChemiDOC XRS+成像儀掃描膜。使用Image-Pro Plus軟件對(duì)目的蛋白和GAPDH免疫印跡結(jié)果進(jìn)行分析。蛋白含量=條帶面積×平均灰度;目的蛋白半定量值=目的蛋白含量/GAPDH蛋白含量。

1.9 細(xì)胞免疫熒光(IF)檢測(cè)

將各組小鼠黑色素細(xì)胞去除培養(yǎng)基,PBS漂洗3×5 min,4%的甲醛固定15 min。丟棄固定液,PBS漂洗3×5 min。封閉液封閉1 h,按照1∶200的比例稀釋一抗(PEDF、Wnt1、Wnt3α、MITF和β-catenin),4 ℃孵育過(guò)夜。PBS漂洗3×5 min。1∶500的比例稀釋驢抗兔Alexa FluorTMPlus 594熒光二抗,室溫避光孵育1 h,PBS漂洗3×10 min,滴加DAPI,激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

1.10 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié) 果

2.1 siRNA對(duì)PEDF表達(dá)的影響

與NC組相比,3組PEDF-siRNA組PEDF表達(dá)量均極顯著(P<0.001)下降,其中PEDF-siRNA 2的沉默效率最佳,因此選擇PEDF-siRNA 2進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)(圖1)。

CON.空白對(duì)照組;NC.陰性對(duì)照組;***. P<0.001CON. Blank control; NC. Negative control; ***. P<0.001圖1 PEDF mRNA的相對(duì)表達(dá)量Fig.1 The relative expression quantity of PEDF mRNA

2.2 黑色素細(xì)胞電轉(zhuǎn)染

電轉(zhuǎn)染結(jié)果表明,在540 V(30 ms,1pulse)條件下,PEDF過(guò)表達(dá)載體組熒光強(qiáng)度明顯高于空載組,故在后續(xù)PEDF過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染黑色素細(xì)胞試驗(yàn)中選擇540 V(30 ms,1pulse)條件下轉(zhuǎn)染(圖2)。

Control組為正常培養(yǎng)的黑色素細(xì)胞;OE-con組為轉(zhuǎn)染空載體的黑色素細(xì)胞;OE-PEDF為轉(zhuǎn)染PEDF過(guò)表達(dá)載體的黑色素細(xì)胞。標(biāo)尺=25 μmThe Control group. Normal melanocytes; OE-con. The melanocytes transfected with empty vector; OE-PEDF. The melanocytes transfected with PEDF overexpression vector. Bar=25 μm圖2 PEDF過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染黑色素細(xì)胞的效率Fig.2 The efficiency of transfected melanocytes with PEDF overexpression vector

2.3 沉默及過(guò)表達(dá)PEDF對(duì)小鼠黑色素細(xì)胞活力的影響

檢測(cè)沉默及過(guò)表達(dá)PEDF后小鼠黑色素細(xì)胞的細(xì)胞活力,結(jié)果顯示:PEDF-siRNA轉(zhuǎn)染小鼠黑色素細(xì)胞后,黑色素細(xì)胞活力極顯著(P<0.001)高于NC組;OE-PEDF組黑色素細(xì)胞活力極顯著(P<0.001)低于OE-con組,在PEDF高表達(dá)的情況下,黑色素細(xì)胞活力受到顯著抑制(圖3)。

NC.陰性對(duì)照組;OE-con.轉(zhuǎn)染空載體的黑色素細(xì)胞;***. P<0.001NC. Negative control; OE-con. The melanocytes transfected with empty vector. ***. P<0.001圖3 沉默和過(guò)表達(dá)PEDF對(duì)黑色素細(xì)胞活力的影響Fig.3 Effect of silencing and overexpression of PEDF on melanocyte activity

2.4 沉默及過(guò)表達(dá)PEDF對(duì)黑色素含量的影響

測(cè)定沉默及過(guò)表達(dá)PEDF后黑色素細(xì)胞中的黑色素含量,結(jié)果顯示:siRNA-PEDF組黑色素含量極顯著(P<0.001)高于NC組;OE-PEDF組黑色素含量極顯著(P<0.01)低于OE-con組。PEDF基因表達(dá)情況與黑色素含量的關(guān)系說(shuō)明:PEDF對(duì)黑色素合成存在抑制作用(圖4)。

NC.陰性對(duì)照組;OE-con.轉(zhuǎn)染空載體的黑色素細(xì)胞;***. P<0.001;**. P<0.01NC. Negative control; OE-con. The melanocytes transfected with empty vector. ***. P<0.001; **. P<0.01圖4 沉默及過(guò)表達(dá)PEDF對(duì)黑色素細(xì)胞黑色素合成的影響Fig.4 Effect of silencing and overexpression of PEDF on melanin synthesis in melanocytes

2.5 沉默及過(guò)表達(dá)PEDF后相關(guān)基因mRNA水平檢測(cè)

qRT-PCR檢測(cè)沉默及過(guò)表達(dá)PEDF后黑色素細(xì)胞中PEDF及相關(guān)基因Wnt1、Wnt3α、MITF和β-catenin的表達(dá)情況,結(jié)果顯示:沉默PEDF基因后,黑色素細(xì)胞中PEDFmRNA的表達(dá)量是NC組的47%,極顯著(P<0.001)低于NC組,進(jìn)一步說(shuō)明用于基因沉默的siRNA構(gòu)建成功(圖5A);Wnt1 mRNA表達(dá)量是NC組的2.29倍,極顯著(P<0.001)高于NC組(圖5B);Wnt3αmRNA表達(dá)量是NC組的1.11倍,極顯著(P<0.001)高于NC組(圖5C);MITFmRNA表達(dá)量是NC組的1.11倍,極顯著(P<0.001)高于NC組(圖5D);β-cateninmRNA表達(dá)量是NC組的1.79倍,極顯著(P<0.001)高于NC組(圖5E)。說(shuō)明在RNA水平上,PEDF負(fù)調(diào)控Wnt1、Wnt3α、MITF和β-catenin的表達(dá)。

NC.陰性對(duì)照組;OE-con.轉(zhuǎn)染空載體的黑色素細(xì)胞;A. PEDF基因表達(dá)量分析;B. Wnt1基因表達(dá)量分析;C. Wnt3α基因表達(dá)量分析 D. MITF基因表達(dá)量分析;E. β-catenin基因表達(dá)量分析。***. P<0.001NC. Negative control; OE-con. The melanocytes transfected with empty vector. A. PEDF gene expression analysis; B. Wnt1 gene expression analysis; C. Wnt3α gene expression analysis; D. MITF gene expression analysis; E. β-catenin gene expression analysis. ***. P<0.001圖5 相關(guān)基因的qRT-PCR 檢測(cè)Fig.5 qRT-PCR detection of related genes

PEDF基因過(guò)表達(dá)后,黑色素細(xì)胞中PEDFmRNA的表達(dá)量極顯著(P<0.001)高于OE-con組,是OE-con組的1.5倍(圖5A);Wnt1 mRNA表達(dá)量極顯著(P<0.001)低于OE-con組,是OE-con組的42%(圖5B);Wnt3αmRNA表達(dá)量極顯著(P<0.001)低于OE-con組,是OE-con組的79%(圖5C);MITFmRNA表達(dá)量極顯著(P<0.001)低于OE-con組,是OE-con組的78%(圖5D);β-cateninmRNA表達(dá)量極顯著(P<0.001)低于OE-con組,是OE-con組的57%(圖5E)。說(shuō)明在RNA水平上,PEDF負(fù)調(diào)控Wnt1、Wnt3α、MITF和β-catenin的表達(dá)。PEDF沉默和過(guò)表達(dá)后相關(guān)基因的表達(dá)情況相符,均說(shuō)明PEDF負(fù)調(diào)控Wnt1、Wnt3α、MITF和β-catenin的表達(dá)。

2.6 沉默及過(guò)表達(dá)PEDF后相關(guān)蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

試驗(yàn)結(jié)果顯示(圖6):沉默及過(guò)表達(dá)PEDF后PEDF、Wnt1、Wnt3α、MITF和β-catenin的蛋白表達(dá)變化趨勢(shì)與mRNA表達(dá)變化趨勢(shì)基本一致。

NC.陰性對(duì)照組;OE-con.轉(zhuǎn)染空載體的黑色素細(xì)胞NC. Negative control; OE-con. The melanocytes transfected with empty vector圖6 沉默及過(guò)表達(dá)PEDF后黑色素細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白表達(dá)水平檢測(cè)Fig.6 Detection of related protein expression levels in melanocytes after PEDF silencing and overexpression

對(duì)Western blotting結(jié)果進(jìn)行灰度值分析可知:沉默PEDF基因后,黑色素細(xì)胞中PEDF蛋白的表達(dá)量極顯著(P<0.001)低于NC組,是NC組的50%(圖7A);Wnt1蛋白表達(dá)量極顯著(P<0.001)高于NC組,是NC組的2.38倍(圖7B);Wnt3α蛋白表達(dá)量極顯著(P<0.001)高于NC組,是NC組的2.50倍(圖7C);MITF蛋白表達(dá)量極顯著(P<0.001)高于NC組,是NC組的4.67倍(圖7D);β-catenin蛋白表達(dá)量極顯著(P<0.001)高于NC組,是NC組的1.99倍(圖7E)。PEDF基因過(guò)表達(dá)后,黑色素細(xì)胞中PEDF蛋白的表達(dá)量極顯著(P<0.01)高于OE-con組,是OE-con組的1.30倍,與mRNA表達(dá)情況一致(圖7A);Wnt1蛋白表達(dá)量極顯著(P<0.001)低于OE-con組,是OE-con組的69%(圖7B);Wnt3α蛋白表達(dá)量極顯著(P<0.001)低于OE-con組,是OE-con組的24%(圖7C);MITF蛋白表達(dá)量極顯著(P<0.001)低于OE-con組,是OE-con組的56%(圖7D);β-catenin蛋白表達(dá)量顯著(P<0.05)低于OE-con組,是OE-con組的82%(圖7E)。PEDF沉默和過(guò)表達(dá)后相關(guān)蛋白的表達(dá)情況與mRNA表達(dá)情況相符,均說(shuō)明PEDF負(fù)調(diào)控Wnt1、Wnt3α、MITF和β-catenin的表達(dá)。

NC.陰性對(duì)照組;OE-con.轉(zhuǎn)染空載體的黑色素細(xì)胞;A. PEDF蛋白表達(dá)量分析;B. Wnt1蛋白表達(dá)量分析;C. Wnt3α蛋白表達(dá)量分析;D. MITF蛋白表達(dá)量分析;E. β-catenin蛋白表達(dá)量分析。***. P<0.001;**. P<0.01;*. P<0.05NC. Negative control; OE-con. The melanocytes transfected with empty vector; A. PEDF protein expression analysis; B. Wnt1 protein expression analysis; C. Wnt3α protein expression analysis; D. MITF protein expression analysis; E. β-catenin protein expression analysis. ***. P<0.001; ;**. P<0.01; *. P<0.05圖7 相關(guān)蛋白表達(dá)水平檢測(cè)Fig.7 The expression levels of related proteins

2.7 PEDF與相關(guān)蛋白在小鼠黑色素細(xì)胞中的定位

沉默及過(guò)表達(dá)PEDF后,細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)黑色素細(xì)胞內(nèi)PEDF、Wnt1、Wnt3α、MITF和β-catenin的表達(dá)及定位,結(jié)果顯示PEDF表達(dá)于黑色素細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)(圖8A);黑色素細(xì)胞沉默PEDF后,PEDF熒光強(qiáng)度極顯著(P<0.001)低于NC組(圖8B);過(guò)表達(dá)PEDF后,黑色素細(xì)胞內(nèi)PEDF熒光強(qiáng)度極顯著(P<0.001)高于OE-con組(圖8B)。Wnt1表達(dá)于黑色素細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)(圖9A);黑色素細(xì)胞沉默PEDF后,Wnt1熒光強(qiáng)度與NC組相比無(wú)顯著差異(圖9B);過(guò)表達(dá)PEDF后,Wnt1熒光強(qiáng)度極顯著(P<0.01)低于OE-con組(圖9B)。Wnt3α表達(dá)于黑色素細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜(圖10A);黑色素細(xì)胞沉默PEDF后,Wnt3α熒光強(qiáng)度極顯著(P<0.001)高于NC組(圖10B);過(guò)表達(dá)PEDF后,Wnt3α熒光強(qiáng)度極顯著(P<0.01)低于OE-con組(圖10B)。MITF表達(dá)于黑色素細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)(圖11A);黑色素細(xì)胞沉默PEDF后,MITF熒光強(qiáng)度極顯著(P<0.001)高于NC組(圖11B);過(guò)表達(dá)PEDF后,MITF熒光強(qiáng)度極顯著(P<0.001)低于OE-con組(圖11B)。β-catenin表達(dá)于黑色素細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)(圖12A);黑色素細(xì)胞沉默PEDF后,β-catenin熒光強(qiáng)度極顯著(P<0.001)高于NC組(圖12B);過(guò)表達(dá)PEDF后,β-catenin熒光強(qiáng)度極顯著(P<0.001)低于OE-con組(圖12B)。

NC.陰性對(duì)照組;OE-con.轉(zhuǎn)染空載體的黑色素細(xì)胞;A. 細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(cè)沉默及過(guò)表達(dá)PEDF后黑色素細(xì)胞中PEDF的表達(dá)與定位;B. 沉默及過(guò)表達(dá)PEDF后黑色素細(xì)胞中PEDF的光密度值分析。CP.細(xì)胞質(zhì);PEDF在黑色素細(xì)胞胞質(zhì)中表達(dá),圓圈代表陽(yáng)性表達(dá),圓圈個(gè)數(shù)越多,陽(yáng)性表達(dá)越強(qiáng);標(biāo)尺=25 μm。***. P<0.001NC. Negative control; OE-con. The melanocytes transfected with empty vector; A. The expression and localization of PEDF in melanocytes after PEDF silencing and overexpression were detected by cellular immunofluorescence; B. Optical density analysis of PEDF in melanocytes after silencing and overexpression of PEDF. CP. Cytoplasm; PEDF was expressed in the cytoplasm of melanocytes, circles represent positive expression, and the more circles, the stronger the positive expression; Scale =25 μm. ***. P<0.001圖8 沉默及過(guò)表達(dá)PEDF后黑色素細(xì)胞中PEDF的表達(dá)與定位Fig.8 Expression and localization of PEDF in melanocytes after silencing and overexpression of PEDF

NC.陰性對(duì)照組;OE-con.轉(zhuǎn)染空載體的黑色素細(xì)胞;A. 細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(cè)沉默及過(guò)表達(dá)PEDF后黑色素細(xì)胞中Wnt1的表達(dá)與定位;B. 沉默及過(guò)表達(dá)PEDF后黑色素細(xì)胞中Wnt1的光密度值分析。CP.細(xì)胞質(zhì);Wnt1在黑色素細(xì)胞胞質(zhì)中表達(dá),圓圈代表陽(yáng)性表達(dá),圓圈數(shù)越多,陽(yáng)性表達(dá)越強(qiáng);標(biāo)尺=25 μm。**. P<0.01NC. Negative control; OE-con. The melanocytes transfected with empty vector; A. The expression and localization of Wnt1 in melanocytes after PEDF silencing and overexpression were detected by cellular immunofluorescence; B. Optical density analysis of Wnt1 in melanocytes after silencing and overexpression of PEDF. CP. Cytoplasm; Wnt1 was expressed in the cytoplasm of melanocytes, circles represent positive expression, and the more circles, the stronger the positive expression; Scale =25 μm. **. P<0.01圖9 沉默及過(guò)表達(dá)PEDF后黑色素細(xì)胞中Wnt1的表達(dá)與定位Fig.9 Expression and localization of Wnt1 in melanocytes after silencing and overexpression of PEDF

NC.陰性對(duì)照組;OE-con.轉(zhuǎn)染空載體的黑色素細(xì)胞;A. 細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(cè)沉默及過(guò)表達(dá)PEDF后黑色素細(xì)胞中Wnt3α的表達(dá)與定位;B. 沉默及過(guò)表達(dá)PEDF后黑色素細(xì)胞中Wnt3α的光密度值分析。CP.細(xì)胞質(zhì);PM.細(xì)胞膜;Wnt3α在黑色素細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜表達(dá),圓圈代表陽(yáng)性表達(dá),圓圈數(shù)越多,陽(yáng)性表達(dá)越強(qiáng);標(biāo)尺=25 μm。***. P<0.001;**. P<0.01NC. Negative control; OE-con. The melanocytes transfected with empty vector; A. The expression and localization of Wnt3α in melanocytes after PEDF silencing and overexpression were detected by cellular immunofluorescence; B. Optical density analysis of Wnt3α in melanocytes after silencing and overexpression of PEDF. CP. Cytoplasm; PM. Cell membrane; Wnt3α was expressed in the cytoplasm and cell membrane of melanocytes, circles represent positive expression, and the more circles, the stronger the positive expression; Scale =25 μm. ***. P<0.001; **. P<0.01圖10 沉默及過(guò)表達(dá)PEDF后黑色素細(xì)胞中Wnt3α的表達(dá)與定位Fig.10 Expression and localization of Wnt3α in melanocytes after silencing and overexpression of PEDF

NC.陰性對(duì)照組;OE-con.轉(zhuǎn)染空載體的黑色素細(xì)胞;A. 細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(cè)沉默及過(guò)表達(dá)PEDF后黑色素細(xì)胞中MITF的表達(dá)與定位;B. 沉默及過(guò)表達(dá)PEDF后黑色素細(xì)胞中MITF的光密度值分析。CP.細(xì)胞質(zhì),MITF在黑色素細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)表達(dá),圓圈代表陽(yáng)性表達(dá),圓圈數(shù)越多,陽(yáng)性表達(dá)越強(qiáng)。標(biāo)尺=25 μm。***. P<0.001NC. Negative control; OE-con. The melanocytes transfected with empty vector; A. The expression and localization of MITF in melanocytes after PEDF silencing and overexpression were detected by cellular immunofluorescence; B. Optical density analysis of MITF in melanocytes after silencing and overexpression of PEDF. CP. Cytoplasm, MITF was expressed in the cytoplasm of melanocytes, circles represent positive expression, and the more circles, the stronger the positive expression. Scale =25 μm. ***. P<0.001圖11 沉默及過(guò)表達(dá)PEDF后黑色素細(xì)胞中MITF的表達(dá)與定位Fig.11 Expression and localization of MITF in melanocytes after silencing and overexpression of PEDF

NC.陰性對(duì)照組;OE-con.轉(zhuǎn)染空載體的黑色素細(xì)胞;A. 細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(cè)沉默及過(guò)表達(dá)PEDF后黑色素細(xì)胞中β-catenin的表達(dá)與定位;B. 沉默及過(guò)表達(dá)PEDF后黑色素細(xì)胞中β-catenin的光密度值分析。CP.細(xì)胞質(zhì);β-catenin在黑色素細(xì)胞胞質(zhì)中表達(dá),圓圈代表陽(yáng)性表達(dá),圓圈數(shù)越多,陽(yáng)性表達(dá)越強(qiáng);標(biāo)尺=25 μm。***. P<0.001NC. Negative control; OE-con. The melanocytes transfected with empty vector; A. The expression and localization of β-catenin in melanocytes after PEDF silencing and overexpression were detected by cellular immunofluorescence; B. Optical density analysis of β-catenin in melanocytes after silencing and overexpression of PEDF. CP. Cytoplasm; β-catenin was expressed in the cytoplasm of melanocytes, circles represent positive expression, and the more circles, the stronger the positive expression; Scale =25 μm. ***. P<0.001圖12 沉默及過(guò)表達(dá)PEDF后黑色素細(xì)胞中β-catenin的表達(dá)與定位Fig.12 Expression and localization of β-catenin in melanocytes after silencing and overexpression of PEDF

該結(jié)果與mRNA和蛋白水平結(jié)果趨勢(shì)相符,均證明在黑色素合成過(guò)程中,PEDF對(duì)促進(jìn)黑色素合成的相關(guān)基因Wnt1、Wnt3α、MITF和β-catenin具有負(fù)調(diào)控作用。

3 討 論

哺乳動(dòng)物毛色多樣性的遺傳與分子機(jī)制長(zhǎng)期受到關(guān)注。一種發(fā)現(xiàn)于黑色素瘤的黑色素生成調(diào)控因子PEDF如何調(diào)控色素形成,其機(jī)制尚不清楚。本研究成功分離培養(yǎng)小鼠黑色素細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)PEDF表達(dá)和定位于小鼠黑色素細(xì)胞;通過(guò)沉默小鼠黑色素細(xì)胞PEDF,發(fā)現(xiàn)黑色素細(xì)胞的活力和黑色素生成升高,黑色素生成正調(diào)控因子Wnt1、Wnt3α、MITF、β-catenin mRNA和蛋白表達(dá)水平上調(diào);小鼠黑色素細(xì)胞過(guò)表達(dá)PEDF致黑色素細(xì)胞的活力減弱,黑色素生成減少,色素生成正調(diào)控因子Wnt1、Wnt3α、MITF、β-catenin mRNA和蛋白表達(dá)水平下降。qRT-PCR結(jié)果與Western blotting、細(xì)胞免疫熒光結(jié)果趨勢(shì)一致。

黑色素細(xì)胞和胚胎視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞均來(lái)源于神經(jīng)嵴細(xì)胞[15,17],且胚胎色素上皮細(xì)胞可產(chǎn)生PEDF[17],推測(cè)黑色素細(xì)胞也可能產(chǎn)生PEDF。本研究顯示黑色素細(xì)胞中存在PEDF的表達(dá),且PEDF的表達(dá)與黑色素的合成存在關(guān)聯(lián)。研究報(bào)道,PEDF在黑色素瘤中表達(dá)缺失或下調(diào)[14],認(rèn)為PEDF對(duì)黑色素瘤細(xì)胞施加了抗增殖作用,誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞凋亡[18],本試驗(yàn)結(jié)果與之相符,在PEDF表達(dá)下降時(shí),黑色素細(xì)胞活力提高,PEDF高表達(dá)的情況下,黑色素細(xì)胞活力受到顯著抑制,提示PEDF對(duì)黑色素細(xì)胞活力有抑制作用,PEDF抑制黑色素細(xì)胞增殖或遷移。

先前研究發(fā)現(xiàn),PEDF在健康的皮膚中高度表達(dá),在色素痣中的表達(dá)水平低于在健康皮膚中,在黑色素瘤細(xì)胞中的表達(dá)量最低,PEDF的表達(dá)量與黑色素合成量成反比[15],結(jié)合本試驗(yàn)結(jié)果中PEDF表達(dá)情況與黑色素含量的關(guān)系,提示PEDF對(duì)黑色素合成存在抑制作用。

Wnt信號(hào)在黑色素細(xì)胞發(fā)育中起著關(guān)鍵作用,通過(guò)KEGG信號(hào)通路生物信息學(xué)分析提示,PEDF對(duì)Wnt信號(hào)通路具有調(diào)控作用,且與Wnt通路抑制劑Dickkopf等類(lèi)似,調(diào)控位點(diǎn)位于Wnt家族與Frizzled受體結(jié)合域之間,提示PEDF可能通過(guò)抑制Wnt與受體的結(jié)合來(lái)抑制Wnt信號(hào)通路功能的發(fā)揮。因此,檢測(cè)沉默和過(guò)表達(dá)PEDF后Wnt通路中黑色素合成相關(guān)基因的表達(dá)情況,可以明確PEDF與調(diào)控黑色素合成的候選基因之間的互作關(guān)系,推測(cè)PEDF在Wnt通路中的位置,以及對(duì)黑色素合成的調(diào)控機(jī)制。Wnt1和Wnt3α是激活Wnt經(jīng)典通路的重要成員[19];在Wnt1和Wnt3α表達(dá)缺失的胚胎中,黑色素母細(xì)胞明顯缺乏[8];Wnt1和Wnt3α促進(jìn)神經(jīng)嵴細(xì)胞向黑色素細(xì)胞的發(fā)育[11];Wnt1向成黑素細(xì)胞發(fā)出信號(hào)以增加黑色素細(xì)胞的數(shù)量。Wnt3α蛋白與受體的結(jié)合可以提高β-catenin的穩(wěn)定性,β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核后調(diào)節(jié)MITF的轉(zhuǎn)錄[20-21],上調(diào)MITF及其下游基因促進(jìn)黑色素合成[7],相反,抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路能夠強(qiáng)烈抑制黑色素合成[22-23];先前研究發(fā)現(xiàn),在肝中,PEDF對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)存在抑制[24]。本研究發(fā)現(xiàn)小鼠黑色素細(xì)胞沉默PEDF導(dǎo)致Wnt下游分子β-catenin、MITF的表達(dá)上調(diào),解除了PEDF對(duì)Wnt信號(hào)的抑制,黑色素細(xì)胞活力和黑色素合成增加。小鼠黑色素細(xì)胞過(guò)表達(dá)PEDF導(dǎo)致Wnt下游分子β-catenin、MITF的表達(dá)下降,加劇了PEDF對(duì)Wnt信號(hào)的抑制,黑色素細(xì)胞活力和黑色素合成減少。PEDF與Wnt1、Wnt3α、MITF和β-catenin的表達(dá)負(fù)相關(guān),提示PEDF在Wnt信號(hào)通路中位于以上4種基因的上游,下調(diào)Wnt信號(hào)通路中促進(jìn)黑色素合成因子的表達(dá),抑制Wnt信號(hào)通路,從而抑制黑色素的合成。

本研究初步闡釋了PEDF與黑色素生成調(diào)節(jié)因子之間的互作關(guān)系,為進(jìn)一步明確PEDF在黑色素合成過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制提供了基礎(chǔ);豐富了色素生產(chǎn)調(diào)控的分子機(jī)制,以期為人工調(diào)控動(dòng)物毛色和膚色的深淺提供借鑒。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn),色素上皮衍生因子對(duì)小鼠黑色素細(xì)胞活力存在抑制作用,通過(guò)抑制Wnt信號(hào)通路中Wnt1、Wnt3α、MITF、β-catenin的表達(dá),從而減少黑色素的合成。