載脂蛋白C1在腎透明細(xì)胞癌中表達(dá)及意義

張玉璽,崔萬(wàn)里,孫熙武,付永濤,布占強(qiáng),晉學(xué)飛,3*

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 泌尿外科二病區(qū),吉林 長(zhǎng)春130033;2.吉林省泌尿系統(tǒng)腫瘤分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,吉林 長(zhǎng)春130033;3.吉林省泌尿系統(tǒng)腫瘤重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,吉林 長(zhǎng)春130033)

腎透明細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma,CCRCC)是腎癌中常見(jiàn)的一種病理類型,約占所有腎細(xì)胞癌的75%～80%[1-2]。目前研究認(rèn)為CCRCC具有較高的侵襲性,且對(duì)于化療、放療的敏感性較差,導(dǎo)致其病死率也較高,預(yù)后較差,晚期CCRCC患者的5年總體生存率(overall survival,OS)約為10%,且對(duì)靶向治療不敏感[3-5]。載脂蛋白C1(apolipoprotein C1,APOC1)是載脂蛋白C家族的一員,其編碼基因位于19號(hào)染色體[6]。目前研究認(rèn)為APOC1可以通過(guò)調(diào)節(jié)脂蛋白代謝相關(guān)的酶的活性,影響外周血脂蛋白的代謝[7]。新近研究發(fā)現(xiàn)APOC1與大腸癌、胃癌、肺癌、前列腺癌等惡性腫瘤的發(fā)生及預(yù)后相關(guān)[8]。另外,KO等[9]研究發(fā)現(xiàn)APOC1在糖尿病腎病患者的腎小球組織中上調(diào),并通過(guò)促進(jìn)腎小球的硬化,促進(jìn)糖尿病腎病的進(jìn)展。本研究旨在通過(guò)生物信息學(xué)及體外實(shí)驗(yàn),觀察APOC1在CCRCC中的表達(dá)情況,及其與臨床病理學(xué)指標(biāo)和預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

從癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取CCRCC的腫瘤組織和正常組織的基因組數(shù)據(jù)和臨床病理學(xué)數(shù)據(jù),分析APOC1在兩組之間的表達(dá)差異、與臨床病理學(xué)參數(shù)以及預(yù)后的關(guān)系。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

786-O和UT33A細(xì)胞系均為CCRCC細(xì)胞系,HK-2細(xì)胞系為人腎皮質(zhì)近曲小管上皮永生化細(xì)胞系,均購(gòu)自ATCC。培養(yǎng)基為RPMI-1640,10%胎牛血清(FBS),100 U/ml青霉素和0.1 mg/ml鏈霉素。細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境條件為37℃,5%濃度CO2。應(yīng)用siRNA敲降細(xì)胞系中APOC1的表達(dá),si-APOC1-#1序列:5’-TTTGGAAACACACTGGAGGA-3’,si-APOC1-#2序列:5’-AACTCATCAGCCGCATCAAA-3’,con-APOC1序列:5’-CGAACUCACUGGUCUGACC-3’,靶向APOC1過(guò)表達(dá)載體pcDNA3.1-APOC1均由上海吉?jiǎng)P生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成。轉(zhuǎn)染試劑應(yīng)用Lipofectamine 3000(Invitrogen,Carlsbad,CA),按照說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.3 RNA的提取及表達(dá)檢測(cè)

應(yīng)用TRizol試劑提取細(xì)胞中總RNA。本次研究應(yīng)用RT-qPCR方法檢測(cè)mRNA的表達(dá)。APOC1引物序列:正向引物5’-AGGACAAGGCTCGGGAACTCAT-3’,反向引物5’-GATGTCACCCTTCAGGTCCTCA-3’,選擇β-actin作為內(nèi)參,引物序列:正向引物5’-GCAGGAGTATGACGAGTCCG-3’,反向引物5’-CGGACTCGTCATACTCCTGC-3’。基因相對(duì)定量采用2-△△Ct法計(jì)算。

1.4 蛋白表達(dá)測(cè)定

應(yīng)用蛋白印跡法測(cè)定細(xì)胞中蛋白表達(dá)。應(yīng)用含蛋白酶抑制劑的Ripa裂解液提取細(xì)胞中總蛋白,使用BCA試劑盒定量蛋白濃度。采用常規(guī)Western blot方法,用聚丙烯酰胺凝膠電泳法進(jìn)行電泳,然后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,5%脫脂奶粉封閉15 min,4 ℃下用一抗孵育過(guò)夜。次日用TBS-T將PVDF膜清洗3次,常溫下與二抗孵育1 h,再用TBS-T洗膜3次,用ECL顯影液顯影。相關(guān)抗體均購(gòu)自Abcam公司。

1.5 細(xì)胞增殖能力測(cè)定

應(yīng)用CCK-8法和集落形成法測(cè)定細(xì)胞增殖能力。CCK-8法:在96孔板中每孔鋪2×103個(gè)細(xì)胞,在0、24、48和72 h時(shí),用CCK-8試劑盒分別檢測(cè)450nm激發(fā)波長(zhǎng)的吸光光度值。集落形成法:在6孔板中每孔均勻種5×102個(gè)細(xì)胞,在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d,每3 d更換一次培養(yǎng)基,用4%多聚甲醛將細(xì)胞集落固定,0.1%結(jié)晶紫染料染色20 min,拍照并計(jì)集落形成數(shù)。

1.6 細(xì)胞遷移能力測(cè)定

應(yīng)用Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移能力。在Transwell板的上室中每孔加入1×105個(gè)細(xì)胞,并加入200 μl無(wú)血清培養(yǎng)基,下室加入500 μl含10%FBS的培養(yǎng)基。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,取出小室,擦除上室參與細(xì)胞,將下室細(xì)胞用4%多聚甲醛固定,0.1%結(jié)晶紫染料染色20 min,顯微鏡下選取5個(gè)互不重疊視野,計(jì)細(xì)胞數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。應(yīng)用t檢驗(yàn)比較兩組之間的差異,多組之間的對(duì)比通過(guò)單向ANOVA方差分析和Dunnett進(jìn)行評(píng)估。χ2檢驗(yàn)用于評(píng)估基因表達(dá)與臨床特征之間的相關(guān)性。當(dāng)P<0.05時(shí),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 APOC1在CCRCC組織中的表達(dá)情況

在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中,共有532例CCRCC組織樣本和72例癌旁組織樣本的基因表達(dá)數(shù)據(jù)。APOC1在CCRCC組織中的表達(dá)顯著高于癌旁正常組織(P<0.001),且在各個(gè)期別腫瘤組織中的表達(dá)均顯著高于癌旁正常組織(P<0.001)。qRT-PCR結(jié)果提示,CCRCC細(xì)胞系(786-O和UT33A)中APOC1的表達(dá)顯著高于HK-2細(xì)胞系(圖1)。

圖1 APOC1在CCRCC組織中的表達(dá)

2.2 APOC1的表達(dá)與臨床病理資料的關(guān)系

分析CCRCC腫瘤組織中APOC1的表達(dá)與臨床病理資料的關(guān)系,APOC1的表達(dá)與腫瘤分級(jí)、病理TNM分期、病理T分期、M分期相關(guān)(表1)。此外,根據(jù)APOC1表達(dá)中位數(shù),將532例患者分為APOC1高、低表達(dá)兩組。APOC1高表達(dá)的患者,OS顯著低于APOC1低表達(dá)的患者,風(fēng)險(xiǎn)比(高表達(dá)組:低表達(dá)組)為1.428(圖2)。

表1 APOC1的表達(dá)與臨床病理資料的關(guān)系

圖2 APOC1的表達(dá)與OS的關(guān)系

2.3 敲降和過(guò)表達(dá)APOC1細(xì)胞株的構(gòu)建

將si-APOC1#1、si-APOC1#2和con-APOC1轉(zhuǎn)染至786-O細(xì)胞,構(gòu)建APOC1敲降細(xì)胞株,發(fā)現(xiàn)si-APOC1#1敲降效率更高,故使用該細(xì)胞株作為APOC1敲降細(xì)胞株,命名為786-O-APOC1-KD,將con-APOC1轉(zhuǎn)染細(xì)胞株命名為786-O-APOC1-CON。將靶向APOC1過(guò)表達(dá)的載體pcDNA3.1-APOC1轉(zhuǎn)染至UT33A細(xì)胞,構(gòu)建APOC1過(guò)表達(dá)細(xì)胞株,命名為UT33A-APOC1-OE,空載體pc-DNA3.1轉(zhuǎn)染的UT33A細(xì)胞命名為UT33A-APOC1-vector。構(gòu)建完成的細(xì)胞株用qRT-PCR和WB進(jìn)行驗(yàn)證(圖3)。

圖3 敲降和過(guò)表達(dá)APOC1細(xì)胞株的構(gòu)建

2.4 APOC1的表達(dá)對(duì)CCRCC細(xì)胞生物學(xué)功能的影響CCK-8結(jié)果顯示,786-O-APOC1-KD細(xì)胞株增殖能力顯著低于786-O-APOC1-CON細(xì)胞,而UT33A-APOC1-OE細(xì)胞株增殖能力顯著高于UT33A-APOC1-vector。Transwell結(jié)果顯示,786-O-APOC1-KD細(xì)胞株遷移能力顯著低于786-O-APOC1-CON細(xì)胞,而UT33A-APOC1-OE細(xì)胞株遷移能力顯著高于UT33A-APOC1-vector(圖4)。

圖4 APOC1的表達(dá)對(duì)CCRCC細(xì)胞生物學(xué)功能的影響

2.5 APOC1的表達(dá)對(duì)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響應(yīng)用WB檢測(cè)786-O-APOC1-KD、786-O-APOC1-CON、UT33A-APOC1-OE和UT33A-APOC1-vector細(xì)胞株中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)786-O-APOC1-KD細(xì)胞株中E-cad水平顯著升高,而N-cad、Vimentin和Snail表達(dá)水平低于786-O-APOC1-CON。而在UT33A-APOC1-OE和UT33A-APOC1-vector細(xì)胞株中得到了相反的結(jié)果(圖5)。

圖5 APOC1的表達(dá)對(duì)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

3 討論

APOC1最初在脂質(zhì)代謝相關(guān)疾病中被發(fā)現(xiàn),隨后大量研究表明,其參與了諸如糖尿病、腎小球硬化、動(dòng)脈粥樣硬化等多種疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程[10-11]。近年來(lái),關(guān)于APOC1與腫瘤的關(guān)系的研究日益增多,其異常表達(dá)可能與乳腺癌、胃癌等多種惡性腫瘤預(yù)后相關(guān)[12-13],這些研究均表明APOC1高表達(dá)可能預(yù)示著較差的預(yù)后和較高的惡性程度。本研究結(jié)果顯示,CCRCC患者腫瘤組織中APOC1水平顯著升高,且與性別、腫瘤分級(jí)、病理TNM分期,病理T分期和M分期相關(guān),并且APOC1高表達(dá)的患者預(yù)后更差。這提示APOC1可能是CCRCC診斷和治療的新興分子靶點(diǎn)。

一些體外研究證明APOC1可能參與了調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能。SU等[14]研究發(fā)現(xiàn)降低前列腺癌細(xì)胞系中APOC1的表達(dá),可以降低細(xì)胞的增殖速度,并在一定程度上可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。TAKANO等[15]研究發(fā)現(xiàn)APOC1過(guò)表達(dá),可能會(huì)使胰腺癌細(xì)胞的侵襲性增強(qiáng)。此外,APOC1還被證實(shí)可能作為乳腺癌的生物標(biāo)志物之一,其體外研究也發(fā)現(xiàn)APOC1低表達(dá)的細(xì)胞,其增殖速度也較慢[16]。本研究發(fā)現(xiàn)APOC1在CCRCC中表達(dá)上調(diào),通過(guò)構(gòu)建APOC1敲降和過(guò)表達(dá)的CCRCC細(xì)胞株并進(jìn)行體外功能實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)APOC1的過(guò)表達(dá)可能增強(qiáng)CCRCC細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為,而降低APOC1的表達(dá)可以得到相反的結(jié)果,這提示APOC1可能加劇了CCRCC的惡性生物學(xué)行為,并可能促進(jìn)了CCRCC的進(jìn)展。

EMT最初認(rèn)為是在人類正常發(fā)育中起著較為關(guān)鍵的作用,在之后的研究中發(fā)現(xiàn)腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程也伴隨著腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生EMT后,腫瘤細(xì)胞極性降低,遷移能力增強(qiáng),并容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[17-18]。所以,抑制EMT過(guò)程,可能會(huì)降低腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移或者復(fù)發(fā)的幾率,這也為以EMT為靶點(diǎn)治療腫瘤提供了理論依據(jù)。此次研究結(jié)果提示,APOC1的表達(dá)與CCRCC細(xì)胞的EMT過(guò)程呈正相關(guān)。E-鈣黏蛋白的表達(dá)降低或缺失是腫瘤發(fā)展過(guò)程中,腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT的關(guān)鍵步驟,其表達(dá)水平降低提示腫瘤細(xì)胞黏附連接能力降低,不穩(wěn)定性增強(qiáng),故更容易發(fā)生腫瘤細(xì)胞遷移。此次研究結(jié)果提示,APOC1過(guò)表達(dá)可能會(huì)誘導(dǎo)CCRCC細(xì)胞發(fā)生EMT,提高了腫瘤細(xì)胞的惡性程度,從而影響了患者的預(yù)后。

綜上,APOC1在CCRCC組織中表達(dá)上調(diào),其可能通過(guò)促進(jìn)CCRCC的EMT,影響腫瘤細(xì)胞表型及患者預(yù)后,APOC1可能是治療CCRCC的新靶點(diǎn)。