基于UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS/MS 技術(shù)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討蒲公英改善高脂血癥的活性成分及其作用機(jī)制

劉兆薇，任一冉#，劉亦菲，劉穎

1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488

2.北京中醫(yī)藥大學(xué) 北京中醫(yī)藥研究院，北京 102488

3.北京市科委中藥生產(chǎn)過(guò)程控制與質(zhì)量評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102488

4.中藥制藥與新藥開(kāi)發(fā)教育部工程研究中心，北京 100029

高脂血癥是由血脂代謝異常引起的代謝性疾病[1]。近年來(lái)，隨著人們生活方式的巨大變化，高脂血癥在全球范圍內(nèi)發(fā)病率不斷增加，已成為重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題[2]。當(dāng)身體長(zhǎng)期處于血脂異常狀態(tài)可顯著增加動(dòng)脈粥樣硬化、卒中、心肌梗死和其他心腦血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)；此外，高脂血癥還與肥胖及心血管疾病、2 型糖尿病、代謝相關(guān)脂肪性肝病等慢性代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]。近年來(lái)，中藥被廣泛用于高脂血癥的改善和治療[4-5]，可通過(guò)緩解脂質(zhì)代謝紊亂、抗氧化以及抑制炎癥反應(yīng)等達(dá)到調(diào)節(jié)血脂的療效，且具有藥效確切，不良反應(yīng)小等優(yōu)勢(shì)[6-7]。

蒲公英TaraxacummongolicumHand.-Mazz.，系菊科多年生草本植物，具有清熱解毒、消腫散結(jié)、利尿通淋的功效[8]，蒲公英的化學(xué)成分繁多，包括黃酮類、萜類、有機(jī)酸類、甾醇類、多糖類、苯丙素類和揮發(fā)油類等化學(xué)成分[9]。現(xiàn)代藥理表明，蒲公英可顯著降低高脂血癥模型小鼠的總膽固醇水平，同時(shí)升高高密度脂蛋白膽固醇水平[10]，減小高脂血癥大鼠肝臟的代謝負(fù)擔(dān)，減輕肝臟脂肪變性并保護(hù)肝臟，降低總膽固醇水平[11]。但是，目前對(duì)該藥物發(fā)揮改善高脂血癥作用的活性成分及其作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)尚不清晰。因此，本研究采用UHPLCLTQ-Orbitrap-MS/MS 技術(shù)對(duì)蒲公英化學(xué)成分進(jìn)行表征，結(jié)合數(shù)據(jù)網(wǎng)絡(luò)的維度分析基因、蛋白、疾病以及藥物之間的關(guān)聯(lián)性，并通過(guò)分子對(duì)接進(jìn)行虛擬驗(yàn)證，系統(tǒng)闡釋蒲公英發(fā)揮改善高脂血癥的潛在藥效物質(zhì)及可能參與調(diào)控的分子機(jī)制，為蒲公英改善高脂血癥的藥理機(jī)制研究及蒲公英資源的開(kāi)發(fā)利用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料

1.1 儀器

Ultimate 3000 超高效液相色譜儀、LTQ-Orbitrap XL 質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；R200D 型分析天平（德國(guó)Satorius 公司）；KQ-250DE型數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；YR-150 型多功能粉碎機(jī)（永康市五瑞工貿(mào)有限公司）；Heraeus Fresco 21 冷凍型微量臺(tái)式離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）。

1.2 藥材與試劑

蒲公英藥材購(gòu)買(mǎi)自同仁堂（四川）健康藥業(yè)有限公司，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)北京中醫(yī)藥研究院劉穎副研究員鑒定為菊科蒲公英屬植物蒲公英TaraxacummongolicumHand.-Mazz.干燥全草。鳥(niǎo)苷（批號(hào) 18031603）、3-咖啡?？鼘幩幔ㄅ?hào)18030620）、4-咖啡?？鼘幩幔ㄅ?hào)18031001）、5-咖啡酰奎寧酸（批號(hào)18032403）、3,4-二咖啡?？鼘幩幔ㄅ?hào)18031602）、3,5-二咖啡?？鼘幩幔ㄅ?hào)18031610）、4,5-二咖啡?？鼘幩幔ㄅ?hào)18031604）、咖啡酸（批號(hào)18032003）、芹菜素（批號(hào)18032605）、木犀草素（批號(hào)18012605）、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷（批號(hào)18041101）對(duì)照品均購(gòu)于成都曼斯特生物科技有限公司；尿苷（批號(hào)RFS-N02511804026）、腺苷（批號(hào)RFS-X0221803002）、菊苣酸（批號(hào)RFSJ00502107008）、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷（批號(hào)RFS-Q07211806001）、原兒茶醛（批號(hào)RFSY03211804028）、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷（批號(hào)RFS-Y09902012001）對(duì)照品購(gòu)于成都瑞芬思生物科技有限公司；單咖啡酰酒石酸（批號(hào)B20271）、木犀草-7-O-β-D-葡萄糖苷（批號(hào)B20877）購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；異鼠李素（批號(hào)110860200608）對(duì)照品購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，以上對(duì)照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%。純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司），質(zhì)譜級(jí)甲醇、甲酸、乙腈（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）。

2 方法

2.1 蒲公英化學(xué)成分分析

2.1.1 混合對(duì)照品溶液的制備 取各對(duì)照品適量，精密稱定，加60%甲醇溶液溶解并定容于10 mL 量瓶中，得對(duì)照品母液。分別吸取各對(duì)照品母液適量于10 mL 量瓶中，加60%甲醇溶液定容，得各成分質(zhì)量濃度為30 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 蒲公英干燥藥材，粉碎，過(guò)40 目篩，精密稱取1 g 粉末置50 mL 具塞錐形瓶中，精密加入60%甲醇30 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W、頻率40 kHz，）45 min，放冷，稱定質(zhì)量，用60%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 色譜條件 Waters Acquity UHPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）；柱溫：35 ℃，體積流量：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：2 μL。梯度洗脫：0～1 min，2% B；1～19 min，2%～30% B；19～29 min，30%～70% B；29～32 min，70%～90% B；32～34 min，90% B；34～35 min，90%～2% B；35～37 min，2% B。

2.1.4 質(zhì)譜條件 ESI 離子源，離子源溫度：350 ℃；正離子模式下：電離源電壓4.0 kV，毛細(xì)管電壓35 V，管透鏡電壓110 V；負(fù)離子模式下：電離源電壓-3.0 kV，毛細(xì)管電壓-35 V，管透鏡電壓-110 V；碰撞電壓：6～10 V；鞘氣（N2）體積流量40 arb，輔助氣（N2）體積流量20 arb；干燥氣流速15 L/min；樣品一級(jí)質(zhì)譜圖譜采用全掃描（質(zhì)量掃描范圍m/z100～1 200；檢測(cè)分辨率：30 000）；二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)采用數(shù)據(jù)依賴性掃描，選取一級(jí)豐度最高的3 個(gè)離子進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離碎裂方式，CID激活能量單位為0.25 q，歸一化能量為35%。對(duì)于未采集到二級(jí)碎片的離子采用母離子列表和選擇性離子檢測(cè)策略進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。

2.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.2.1 蒲公英活性成分的篩選及作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)根據(jù)UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS/MS 分析結(jié)果，借助SwissADME 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.swissadme.ch/），以胃腸吸收的得分為“high”、類藥性至少通過(guò)2 個(gè)“Yes”來(lái)篩選蒲公英潛在活性成分；結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[12-16]，將吸收入血、藥理活性較確切的化學(xué)成分納入到蒲公英潛在活性成分中。將篩選的化合物通過(guò)STITCH、Swiss Target Predection、TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)各潛在活性成分的作用靶點(diǎn)，去除重復(fù)靶點(diǎn)后，即得蒲公英改善高脂血癥的活性成分靶點(diǎn)。

2.2.2 高脂血癥有關(guān)靶點(diǎn)的收集 以“ hyperlipidemia ”“ acute hyperlipidemia ”“hypercholesterolemia”“hypertriglyceridemia”為關(guān)鍵詞，通過(guò) GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genecards.org/）、DrugBank 數(shù) 據(jù)庫(kù)（https://go.drugbank.com/）、OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://omim.org/）、Therapeutic Target Database 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://db.idrblab.net/ttd/）和PharmGKB 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.pharmgkb.org/）檢索并篩選獲取疾病靶點(diǎn)基因信息，將結(jié)果合并去重后即得到高脂血癥的相關(guān)靶點(diǎn)。

2.2.3 蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及關(guān)鍵基因篩選 將蒲公英潛在藥效成分靶點(diǎn)與高脂血癥相關(guān)靶點(diǎn)利用微生信在線平臺(tái)（http://www.bioinformatics.com.cn/）繪制韋恩圖得到交集靶點(diǎn)，并將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入 STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://cn.string-db.org/）中繪制構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)。使用Cytoscape 3.7.2 軟件進(jìn)行可視化分析，刪除獨(dú)立靶點(diǎn)，同時(shí)依據(jù)degree 值調(diào)整，構(gòu)建靶標(biāo)之間的相互作用即PPI網(wǎng)絡(luò)，得到蒲公英作用于高脂血癥的核心靶點(diǎn)。

2.2.4 基因本體（GO）功能京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）通路富集分析 將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://metascape.org/）進(jìn)行GO功能及KEGG 通路富集分析，并運(yùn)用Cytoscape 3.7.2 軟件，構(gòu)建活性成分-炎癥靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖，通過(guò)degree 值、中心度和緊密度指標(biāo)篩選核心靶點(diǎn)。

2.3 分子對(duì)接

采用AutoDock Tools 1.5.6 軟件對(duì)degree 值前10 位的核心靶點(diǎn)和核心成分進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。通過(guò)Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org/）獲取核心 靶 點(diǎn) 的 Uniprot ID，通 過(guò) PDB 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（https://www.rcsb.org/）下載核心靶點(diǎn)相關(guān)蛋白的晶體結(jié)構(gòu)。利用PyMOL 軟件進(jìn)行去水、加氫、去除蛋白自身攜帶小分子的操作，導(dǎo)出用于分子對(duì)接的核心靶點(diǎn)蛋白。通過(guò)Pubchem 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得核心成分的2D 結(jié)構(gòu)文件，通過(guò)Chem3D 20.0 軟件，將獲得的核心成分的2D 結(jié)構(gòu)文件轉(zhuǎn)換為3D 結(jié)構(gòu)；將核心靶點(diǎn)相關(guān)的晶體結(jié)構(gòu)及核心成分的3D 結(jié)構(gòu)導(dǎo)入AutoDock Tools 1.5.6 軟件，采用AutoDock vina 進(jìn)行分子對(duì)接，獲得對(duì)接結(jié)合能（binding energy）、氫鍵（hydrogen bond）信息，在微生信平臺(tái)（http://www.bioinformatics.com.cn/）網(wǎng)站進(jìn)行核心成分與核心靶點(diǎn)間結(jié)合能的熱圖繪制，使用PyMOL軟件對(duì)分子對(duì)接結(jié)果可視化處理。

3 結(jié)果

3.1 蒲公英成分分析

采用UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS/MS 技術(shù)，分別在正離子和負(fù)離子模式下對(duì)蒲公英化學(xué)成分進(jìn)行表征，其總離子流圖（TIC）見(jiàn)圖1。質(zhì)譜信息結(jié)合對(duì)照品裂解規(guī)律，并參考相關(guān)文獻(xiàn)共鑒定和推斷化合物126 個(gè)，包括黃酮類58 個(gè)，有機(jī)酸類29 個(gè)，萜類23 個(gè)，苯丙素類8 個(gè)，核苷類3 個(gè)和其他類5個(gè)，見(jiàn)表1。

圖1 正離子（A）和負(fù)離子（B）模式下蒲公英的TIC 圖Fig.1 Total ion chromatography of Taraxacum mongolicum in positive ion (A) and negative ion (B) mode

3.2 蒲公英網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

3.2.1 蒲公英活性成分篩選及作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 根據(jù)SwissADME 平臺(tái)設(shè)定的藥動(dòng)學(xué)篩選方法結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[12-16]，將不符合篩選標(biāo)準(zhǔn)但入血成分、藥效作用確切的成分進(jìn)行補(bǔ)充，共獲得54 個(gè)蒲公英潛在藥效成分，見(jiàn)表 1。通過(guò) SwissTarget Prediction、STITCH、TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)其作用靶點(diǎn)，經(jīng)去重匯總后共得到464 個(gè)潛在的活性成分作用靶點(diǎn)。

3.2.2 蒲公英改善高脂血癥潛在靶點(diǎn)分析 根據(jù)2.2.2 項(xiàng)下篩選高脂血癥相關(guān)靶點(diǎn)2 664 個(gè)。將蒲公英活性成分靶點(diǎn)與高脂血癥的相關(guān)靶點(diǎn)取交集并繪制韋恩圖，得到共有潛在靶點(diǎn)252 個(gè)，見(jiàn)圖2。

圖2 蒲公英活性成分靶點(diǎn)和高血脂癥靶點(diǎn)的韋恩圖Fig.2 Venn diagram of active components of Taraxacum mongolicum targets and hyperlipidemia targets

3.2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)及核心靶點(diǎn) 獲取的交集靶點(diǎn)采用Cytoscape 3.7.2 軟件繪制PPI 網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖3，包括節(jié)點(diǎn)150 個(gè)，節(jié)點(diǎn)邊379 個(gè)。按degree 值從大到小排序，排在前5 位的核心靶點(diǎn)分別為蛋白激酶B（Akt1）、腫瘤蛋白（TP53）、酪氨酸蛋白激酶（SRC）、表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）和促分裂原活化蛋白激酶3（MAPK3），表明這些靶點(diǎn)對(duì)蒲公英改善高脂血癥有著重要意義。

圖3 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 PPI network diagram

3.2.4 GO 功能和KEGG 通路富集分析 利用Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)蒲公英改善高脂血癥作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能及KEGG 分析。GO 功能富集分析了2 436 個(gè)GO 生物功能條目，包括2 036 個(gè)生物學(xué)過(guò)程（BP），119 個(gè)細(xì)胞組分（CC）和281 個(gè)分子功能（MF）。根據(jù)P值進(jìn)行排序，分別取BP、CC、MF 富集基因前10 位進(jìn)行可視化分析，見(jiàn)圖4。蒲公英改善高脂血癥的靶點(diǎn)在BP 上與激素水平的調(diào)節(jié)、對(duì)外來(lái)生物刺激的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)氮化合物的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)有機(jī)氮化合物的反應(yīng)和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)等相關(guān)；在CC 上與細(xì)胞膜膜筏、膜微區(qū)、細(xì)胞質(zhì)核周?chē)鷧^(qū)域、細(xì)胞囊腔和神經(jīng)元胞體等相關(guān)；在MF上與氧化還原酶活性、單氧酶活性、類固醇結(jié)合活性、單羧酸結(jié)合活性和核受體活性等相關(guān)。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，共獲得208 條蒲公英改善高脂血癥信號(hào)通路，按P值排序取前20 位進(jìn)行可視化分析，見(jiàn)圖5。蒲公英改善高脂血癥可能與脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、含血清素的神經(jīng)突觸、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、胰島素抵抗、晚期糖基化終末化產(chǎn)物（AGE）-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGE）和類固醇激素生物合成等信號(hào)通路相關(guān)。

圖4 GO 功能分析Fig.4 Diagrams of GO function

圖5 KEGG 富集分析Fig.5 Diagrams of KEGG pathway enrichment

3.2.5 活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò) 利用Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，共包括618 個(gè)節(jié)點(diǎn)和2 518 條邊。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)degree 值進(jìn)行排名，槲皮素、異鼠李素、香葉木素、白楊素、芹菜素作為關(guān)鍵活性成分，他們分別連接106、105、104、102、101 個(gè)靶點(diǎn)。將碳酸酐酶2（CA2）、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）、腫瘤壞死因子（TNF）、SRC、EGFR 和Akt1 等靶點(diǎn)作為蒲公英發(fā)揮降脂活性作用的重要靶點(diǎn)。按degree值排序脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化、磷脂酰肌醇-3-羥激酶（PI3K）/Akt 信號(hào)通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化及AGERAGE 信號(hào)通路為蒲公英改善高脂血癥的重要通路，見(jiàn)圖6。

圖6 活性成分–靶點(diǎn)–通路網(wǎng)絡(luò)圖Fig.6 Component-target-pathway network diagram

3.2.6 分子對(duì)接驗(yàn)證 選擇“活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)中degree 值前10 位的核心成分與核心靶點(diǎn)采用AutoDock Tools 1.5.7 軟件依次進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。蒲公英的核心成分與高脂血癥的核心靶點(diǎn)的結(jié)合能熱圖，見(jiàn)圖7。槲皮素、異鼠李素、四氫日登內(nèi)酯B 與靶點(diǎn)Akt1 結(jié)合較好，槲皮素、異鼠李素、木犀草素與靶點(diǎn)TNF 結(jié)合能力較好，四氫日登內(nèi)酯B、白楊素與靶點(diǎn)EGFR 結(jié)合較好，山柰酚、芹菜素、木犀草素與靶點(diǎn)SRC 結(jié)合能力較好。使用PyMOL 軟件對(duì)核心成分與核心靶點(diǎn)進(jìn)行可視化處理，見(jiàn)圖8。槲皮素與TNF 在TRP-28、GLN-47、ASN-46、LYS-90、GLU-50 位形成氫鍵，與Akt1 在ARG-67、THR-87、ARG-86 位形成氫鍵。四氫日登內(nèi)酯B 與EGFR 在CYS-797、SER-720、LYS-745位形成氫鍵，與Akt1 在GLN-47、ALA-50、GLU-40、LYS-39 位形成氫鍵，與TNF 在GLN-47、LYS-90、GLU-50 位形成氫鍵。

圖7 分子對(duì)接數(shù)據(jù)熱圖分析Fig.7 Heat map analysis of molecular docking data

圖8 分子對(duì)接可視化圖Fig.8 Visualization of molecular docking

4 討論

本研究采用UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS/MS技術(shù)鑒定出蒲公英的主要化學(xué)成分黃酮類58 個(gè)，有機(jī)酸類29 個(gè)，萜類23 個(gè)。其中黃酮類化合物槲皮素可通過(guò)調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和腸道菌群而降低總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白膽固醇（LDLC）水平，調(diào)節(jié)血脂異常[17]；芹菜素可通過(guò)抑制低密度脂蛋白受體-1（LOX-1）基因表達(dá)，提高淋巴細(xì)胞瘤-2 基因（Bcl-2）蛋白/Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bcl-2/Bax）比值從而降低高脂血癥大鼠的血脂水平并發(fā)揮預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的作用[18]；白楊素可能通過(guò)抗氧化而降低TG 水平、血脂濃度，且抗高膽固醇血癥活性明顯[19-20]；木犀草素、木犀草苷通過(guò)影響脂肪酸代謝、膽固醇的合成與轉(zhuǎn)運(yùn)等生物學(xué)過(guò)程發(fā)揮降脂作用，可作為調(diào)脂的潛在食源性物質(zhì)[21-23]。有機(jī)酸類成分咖啡?？鼘幩峥娠@著抑制脂質(zhì)合成相關(guān)基因的表達(dá)，降低HepG2 肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積聚和細(xì)胞內(nèi)TC 和TG 水平[23-24]。萜類成分可能通過(guò)調(diào)節(jié)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα）通路治療高脂血癥[25]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果顯示，degree值前10 位的活性成分多數(shù)為黃酮類化學(xué)成分（槲皮素、異鼠李素、香葉木素、白楊素、山柰酚、木犀草素、芹菜素、甘草素）和一個(gè)萜類成分（四氫日登內(nèi)酯B）。由此推測(cè)，黃酮類成分可能是蒲公英發(fā)揮調(diào)脂活性的重要組成成分。

通過(guò)對(duì)蒲公英“活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)分析，本研究發(fā)現(xiàn)蒲公英的活性成分主要通過(guò)Akt1、TNF、EGFR、淀粉樣前體蛋白（APP）、SRC、MMP2、CA2、AKR1B1、CA7、NADPH 氧化酶4（NOX4）等核心靶點(diǎn)發(fā)揮作用。TNF 作為參與炎癥的重要信號(hào)分子，和炎癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其家族蛋白水平已成為衡量高脂血癥相關(guān)疾病發(fā)展和藥物治療的重要指標(biāo)[26-27]；Akt1 是胰島素調(diào)節(jié)途徑所必須，且可控制葡萄糖和脂質(zhì)的穩(wěn)態(tài)，Akt1 蛋白缺乏會(huì)導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，影響脂質(zhì)代謝過(guò)程，而激活的Akt1 蛋白可以正向調(diào)節(jié)葡萄糖和脂肪的代謝[28-30]；EGFR 對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化等生理過(guò)程發(fā)揮重要作用，已被證實(shí)參與維持代謝穩(wěn)態(tài)，其抑制劑能減少炎癥、氧化應(yīng)激反應(yīng)[31]；MMP-2 是一種鋅依賴性和含鈣的分泌型內(nèi)蛋白酶，可高效降解膠原，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞遷移，在血管重生、炎癥反應(yīng)以及動(dòng)脈粥樣病變形成過(guò)程中起關(guān)鍵作用，其表達(dá)上調(diào)與高脂血癥密切相關(guān)[32-33]；SRC 是一種非受體酪氨酸激酶基因，可促進(jìn)吞噬、產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子、誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、遷移、凋亡等在免疫炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，并在巨噬細(xì)胞脂質(zhì)代謝中發(fā)揮相關(guān)作用[34]；AKR1B1 的表達(dá)在氧化應(yīng)激狀態(tài)下被上調(diào)[35]；NOX4 的表達(dá)在高血糖和缺氧的情況下上調(diào)，與糖尿病、糖尿病腎病、糖尿病視網(wǎng)膜血管病變等的發(fā)展密切相關(guān)[36-37]；APP 是廣泛存在于全身組織細(xì)胞上的單次跨膜蛋白，在調(diào)節(jié)脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[38]；CA2、CA7 均為含鋅金屬蛋白酶，可參與糖類、脂肪、尿素的合成等生理過(guò)程[39]。由此推斷，蒲公英可能通過(guò)調(diào)節(jié)脂質(zhì)、糖和免疫系統(tǒng)代謝、抑制炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等多個(gè)生物過(guò)程改善高脂血癥。

本研究發(fā)現(xiàn)，蒲公英核心靶點(diǎn)富集的通路與高脂血癥發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，富集的通路主要包括脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、PI3K-Akt 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化和AGERAGE 信號(hào)通路等。大量研究證實(shí)脂質(zhì)異常與動(dòng)脈粥樣硬化密切相關(guān)[40-41]，PI3K-Akt 信號(hào)通路作用廣泛，能參與糖穩(wěn)態(tài)、脂質(zhì)代謝、蛋白合成等生命活動(dòng)；同時(shí)，Akt 是核轉(zhuǎn)錄因子-кB（NF-кB）的上游蛋白，NF-кB 信號(hào)通路是PI3K-Akt 通路的下游通路，在免疫、炎癥及細(xì)胞增殖分化等生命活動(dòng)中扮演重要角色，更是脂質(zhì)代謝異常過(guò)程中重要的炎癥通路[42]。PI3K-Akt 信號(hào)通路的抑制會(huì)導(dǎo)致NF-κB 信號(hào)降低，進(jìn)而抑制炎癥因子分泌達(dá)到調(diào)控脂質(zhì)代謝的目的[43]。此外，NF-кB 信號(hào)增加與肥胖和多種代謝紊亂有關(guān)，抑制NF-кB 信號(hào)通路可以有效下調(diào)TG、TC 水平以調(diào)節(jié)脂質(zhì)異常[44]。MAPK 信號(hào)通路和脂質(zhì)代謝中的炎癥通路相關(guān)，其表達(dá)可抑制炎癥因子釋放、減輕炎癥反應(yīng)[45]，MAPK 信號(hào)通路可參與NF-кB 的活化調(diào)節(jié)，NF-кB 可在炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)中發(fā)揮作用[46]。流體剪切應(yīng)力與調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)和功能密切相關(guān)，當(dāng)血管中剪切應(yīng)力增大時(shí)，相應(yīng)位置的脂質(zhì)降低[47]。AGE-RAGE 信號(hào)通路能夠激活NF-кB 從而誘發(fā)炎癥反應(yīng)，促使IL-6、IL-8、TNF-α等炎癥因子大量釋放，導(dǎo)致組織細(xì)胞的功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷，同時(shí)激活的NF-кB 也會(huì)反過(guò)來(lái)增強(qiáng)RAGE 的表達(dá)重復(fù)該過(guò)程，其與糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化等高脂血癥相關(guān)慢性疾病的發(fā)生密切相關(guān)[48]。由此推斷，蒲公英可能通過(guò)激活NF-кB 調(diào)控上述信號(hào)通路減少脂質(zhì)蓄積，改善高脂血癥。

綜上，本研究在對(duì)蒲公英化學(xué)成分表征的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)其改善高脂血癥作用的主要活性成分可能為黃酮類成分，活性成分作用于Akt1、TNF、EGFR等核心靶點(diǎn)激活NF-кB 而調(diào)控脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、PI3K-Akt、MAPK、AGE-RAGE 等信號(hào)通路，通過(guò)調(diào)控脂質(zhì)代謝、炎癥反應(yīng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、氧化應(yīng)激和免疫調(diào)節(jié)等過(guò)程延緩高脂血癥的發(fā)生發(fā)展。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突