DNA 甲基化在肺癌早期診斷中的研究進(jìn)展

穆坎代斯·吐爾迪 夏宇（通訊作者）考吾沙爾·巴合提江 王萌萌

（新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 新疆烏魯木齊 830011）

從全世界范圍來看，癌癥死亡人數(shù)中占比最大的當(dāng)數(shù)肺癌，根據(jù)GLOBOCAN（全球癌癥流行病學(xué)的數(shù)據(jù)庫）2020 年數(shù)據(jù)顯示，新增肺癌患者高達(dá)220萬例（占癌癥患者總數(shù)的11.4%），死于肺癌的人數(shù)高達(dá)179 萬例（占癌癥總死亡人數(shù)的18.0%）。采用低劑量計(jì)算機(jī)斷層掃描（LDCT）對(duì)肺癌患者進(jìn)行初步篩查能夠提高肺癌的診斷率，從而提高肺癌患者生存率。但是LDCT 的靈敏度高而特異性低容易造成誤診，因此通過LDCT 檢測(cè)結(jié)果異常的患者需完善其他檢查以進(jìn)一步確認(rèn)。因此，仍需尋找簡(jiǎn)便易行、靈敏度和特異性好的無創(chuàng)手段對(duì)肺癌進(jìn)行早期診斷[1]。

由于DNA 甲基化與人類發(fā)育和腫瘤疾病密切相關(guān)，它是目前研究最透徹、最廣泛的表觀遺傳學(xué)的現(xiàn)象之一。DNA 甲基化往往在腫瘤發(fā)病的早期甚至癌前病變時(shí)就已經(jīng)發(fā)生，因此DNA 甲基化的異常改變或可成為用于肺癌早期診斷的生物標(biāo)記物。為此本文主要就肺組織、外周血、肺泡灌洗液等標(biāo)本當(dāng)中DNA 甲基化檢測(cè)與肺癌早期診斷的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 DNA 甲基化的定義

DNA 甲基化是一類可穩(wěn)定遺傳的表觀修飾，其參與了個(gè)體發(fā)育及細(xì)胞分化等基本生物學(xué)過程。DNA 甲基化是指在DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下，把甲基從通用甲基供體S- 腺苷-L- 甲硫氨酸添加到胞嘧啶的5-碳位置的一種化學(xué)修飾現(xiàn)象。這種方式能夠通過改變DNA 的穩(wěn)定性、DNA 和蛋白質(zhì)的互作方式以及染色質(zhì)結(jié)構(gòu)來調(diào)控靶向基因的表達(dá)。多項(xiàng)研究表明，DNA 的異常甲基化主要表現(xiàn)為全基因組的低甲基化狀態(tài)和啟動(dòng)子CpG 島的高甲基化狀態(tài)。

2 DNA 甲基化與肺癌

肺癌的發(fā)生發(fā)展涉及一系列異常的表觀遺傳變化。DNA 甲基化作為表觀遺傳的重要修飾手段之一與癌癥的發(fā)病有密切關(guān)系，是正常細(xì)胞癌變時(shí)最早發(fā)生的事件。在癌變的早期階段，不僅腫瘤細(xì)胞，甚至在非腫瘤細(xì)胞中也發(fā)生了異常的DNA 甲基化。抑癌基因失活的原因除了認(rèn)為與堿基的突變和缺失有關(guān)外，另一個(gè)重要的原因被認(rèn)為是其啟動(dòng)子區(qū)的高度甲基化。DNA 甲基化的異常在大部分時(shí)候早于癌性病變的發(fā)生，因此DNA 甲基化對(duì)于肺癌的早期診斷具有一定的臨床意義。而且DNA 是一種非常穩(wěn)定的分子，可以從大量體液中提取，DNA 甲基化的定量越來越準(zhǔn)確和敏感，這是有效診斷標(biāo)志物的關(guān)鍵特征，故通過測(cè)定基因DNA 甲基化水平能夠?yàn)榉伟┰缙谠\斷和預(yù)后評(píng)估提供可靠的生物靶點(diǎn)。

3 DNA 甲基化在肺癌診斷中的應(yīng)用

3.1 組織中DNA 甲基化檢測(cè)與肺癌早期診斷

組織中抑癌基因的甲基化被證實(shí)與肺癌關(guān)系密切。Yang 等人研究了非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者癌組織與癌旁組織中DAPK 基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化狀態(tài)，NSCLC 組織和癌旁組織中DAPK 甲基化頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示NSCLC 組織中DAPK 啟動(dòng)子甲基化的頻率明顯高于癌旁組織。Walter RFH 等人通過對(duì)肺癌患者的組織進(jìn)行DNA甲基化分析發(fā)現(xiàn)，L1RE1 基因表現(xiàn)為低甲基化而RASSF1 表現(xiàn)為高甲基化，因此這兩者結(jié)合可作為鑒別肺癌的生物標(biāo)記物。李靖[2]收集105 位NSCLC 患者癌組織及其配對(duì)非癌組織樣本分析，基因LDHB、PFKFB3、HK3、LDHC、PKLR 啟動(dòng)子的甲基化水平在配對(duì)的癌組織、癌旁組織和遠(yuǎn)端組織間的差異，發(fā)現(xiàn)LDHC 和HK3 啟動(dòng)子的甲基化水平在各組織樣品中存在差異，有可能成為NSCLC 診斷的生物標(biāo)志物。Feng X 等探討了NID2 甲基化在NSCLC 發(fā)生發(fā)展中的意義，NSCLC 組織中NID2 甲基化率高于NCLL 組織，提示腫瘤組織中NID2 甲基化狀態(tài)可能具有鑒定NSCLC 的潛力。

上述研究表明，組織中的甲基化檢測(cè)可以區(qū)分腫瘤組織和正常肺組織，這為甲基化檢測(cè)在肺癌早期診斷中的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

3.2 外周血中DNA 甲基化檢測(cè)與肺癌早期診斷

在腫瘤發(fā)生的整個(gè)病程中，位于癌細(xì)胞內(nèi)的DNA 片段能夠釋放入外周循環(huán)，因此我們可以通過外周血測(cè)定DNA 甲基化的變化。Wenhai Huang 等對(duì)肺癌組的104 名患者和良性肺部疾病組的36 名患者的血漿進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)SHOX2 和PTGER4都是檢測(cè)惡性結(jié)節(jié)的高度特異性標(biāo)記物，但敏感性較差，并推測(cè)可能的原因是血液樣本中DNA 含量相對(duì)較少，腫瘤負(fù)荷較小。王攀等人[3]通過對(duì)肺癌患者血漿中DNA 甲基化的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與健康人群和良性肺部結(jié)節(jié)患者的甲基化結(jié)果相比，肺癌患者CDO1 基因甲基化的水平顯著升高，且具有良好的診斷效能。Fujiwara K 等采用甲基化特異性PCR 方法檢測(cè)了200 例患者的血清RAR-β、p16、DAPK、RASSFlA 和MGMT 基因甲基化狀態(tài)，至少一個(gè)基因甲基化被評(píng)估為陽性時(shí)，診斷肺癌的敏感性和特異性分別為49.5%和85.0%，提示鑒定血清DNA 中抑癌基因的啟動(dòng)子甲基化可能有助于肺癌的早期檢測(cè)。

抑癌基因的表觀遺傳失活對(duì)于腫瘤的發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要，包括RASSF1A 在內(nèi)的基因在許多腫瘤中均被證實(shí)發(fā)生了甲基化改變。因此，分析血液的生物標(biāo)記物要求更高，標(biāo)記物需要對(duì)肺癌DNA 具有真正的特異性，以確保進(jìn)行高度特異性的肺癌檢測(cè)。

3.3 支氣管肺泡灌洗液中DNA 甲基化檢測(cè)與肺癌早期診斷

支氣管肺泡灌洗液（BALF）是通過支氣管鏡對(duì)肺段或亞段水平以下支氣管及肺泡反復(fù)以無菌生理鹽水灌洗、回收所得的混合液。目前支氣管鏡檢查廣泛應(yīng)用于臨床，獲取BALF 比較簡(jiǎn)便，并且允許局部采樣，相對(duì)靠近腫瘤細(xì)胞，定位相對(duì)準(zhǔn)確，幾乎沒有來自身體其他部位的污染，特異性較強(qiáng)，是肺癌生物標(biāo)志物比較理想的樣本替代來源。Zeng D 等的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，BALF 游離DNA（cfDNA）可以作為突變和甲基化分析的液體活檢介質(zhì)，與傳統(tǒng)方法相比，在區(qū)分微小惡性腫瘤和良性結(jié)節(jié)方面具有更好的敏感性。崔超等人通過對(duì)BALF 樣本中P16 基因的DNA甲基化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，其對(duì)NSCLC 的診斷具有較好的敏感度和特異度，或可成為NSCLC 的診斷靶點(diǎn)之一。Hojoong Kim 等的研究表明，p16、RASSF1A、H-鈣黏蛋白和RARB 基因的腫瘤特異性甲基化可能是BALF 中早期發(fā)現(xiàn)NSCLC 的一個(gè)有價(jià)值的生物標(biāo)記物。Schmidt B 等在總共523 例患者支氣管吸出物樣本中，用實(shí)時(shí)定量PCR 的檢測(cè)方法得出結(jié)論：SHOX2 基因甲基化能夠以高度特異性區(qū)分惡性和良性肺部疾病。

對(duì)于外周性病變，氣管鏡無法直視下取活檢的患者，采取BALF 甲基化檢查加病理學(xué)檢查有比較好的診斷準(zhǔn)確率。

3.4 痰液中DNA 甲基化檢測(cè)與肺癌早期診斷

痰液是BALF 的優(yōu)選替代樣本，其容易通過非侵入性方法獲取，簡(jiǎn)單方便，易被患者接受。Hubers 等研究RASSF1A、3OST2 和PRDM14 聯(lián)合檢測(cè)肺癌，結(jié)果提示痰液DNA 甲基化檢測(cè)具有早期診斷肺癌的能力，但需要補(bǔ)充診斷標(biāo)志物來提高敏感性。彭再梅等人用甲基化特異性PCR(MSP)技術(shù)分別檢測(cè)肺癌患者和良性肺結(jié)節(jié)患者組織中甲基化的異常，結(jié)果顯示RASSFIA、p16 和DAPK 這3 個(gè)基因的啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生了甲基化改變，或可作為肺癌診斷的有效靶標(biāo)。一項(xiàng)薈萃分析結(jié)果顯示，p16、CDO1、ZFP42、RASSF1A、FAM19A4、TAC1、MGMT、FHI 和SOX17 的異常甲基化可作為早期肺癌篩查和診斷的生物靶標(biāo)。

痰液樣本的主要缺點(diǎn)是肺泡細(xì)胞含量的可變性，除非患者接受過如何制備痰標(biāo)本的適當(dāng)培訓(xùn)，否則大部分樣本可能是不充分的。有研究表明，延長痰液收集的時(shí)間可以明顯提高痰液中甲基化聯(lián)合檢測(cè)的靈敏度。

3.5 其他樣本中DNA 甲基化檢測(cè)與肺癌早期診斷

尿液已被證明是檢測(cè)不同類型癌癥（包括尿路上皮癌、結(jié)腸癌和肺癌）循環(huán)腫瘤DNA 中特定腫瘤基因突變的來源。與其他體液來源相比，尿液樣本具有自己的優(yōu)勢(shì)，它們是非侵入性、易于獲取、體積更大、易于收集的，與其他樣本相比，它們的處理限制更小，可以在室溫下儲(chǔ)存，DNA 含量可以比其他體液穩(wěn)定更長時(shí)間。正因?yàn)槿绱耍蛞簶颖居锌赡茉诔跫?jí)醫(yī)療保健實(shí)踐中易于實(shí)施。但是尿液作為DNA 檢測(cè)樣本有其相應(yīng)的限制性，尿液是血漿超濾液，只有一小部分的血漿DNA 可以被過濾到尿液中，一些甲基化的cfDNA 分子可能太小而無法檢測(cè)。盡管存在這些差異，但尿液在癌癥檢測(cè)中的效用仍有待進(jìn)一步探索。

呼出氣體冷凝液（EBC）也可作為DNA 甲基化檢測(cè)的樣本，且它具有無創(chuàng)且樣本收集簡(jiǎn)便的特點(diǎn)。EBC 中鑒定的化合物包括腺苷、氨、過氧化氫、異前列腺素、白三烯、氮氧化物（NOx）、肽、細(xì)胞因子、質(zhì)子和各種離子。隨著微陣列技術(shù)、測(cè)序技術(shù)以及生物信息分析技術(shù)的廣泛應(yīng)用，現(xiàn)如今對(duì)基因改變的識(shí)別已能夠在微小樣本（如EBC）中進(jìn)行。收集EBC進(jìn)行DNA 甲基化檢測(cè)更適用于無法通過有創(chuàng)或微創(chuàng)手段獲得樣本進(jìn)行診斷的肺癌患者。

4 展望

雖然DNA 甲基化測(cè)序技術(shù)不斷改進(jìn)，DNA 甲基化的檢測(cè)樣本來源從組織細(xì)胞、肺泡灌洗液、痰液、血液發(fā)展到呼出氣冷凝液等，但各種檢測(cè)樣本和檢測(cè)技術(shù)均有各自的優(yōu)劣，暫無系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)方案，仍然需要檢測(cè)技術(shù)的不斷進(jìn)步予以彌補(bǔ)，使其更好地應(yīng)用于臨床。開發(fā)高靈敏度的表觀遺傳學(xué)生物標(biāo)記物，用于有限數(shù)量的組織，并以非侵入性方式獲得標(biāo)本將是未來工作的重點(diǎn)。