蘋果14-3-3 基因家族的鑒定與MdGRF13 的功能分析

任家玄 李艷梅 馬維峰 吳宙 毛娟

摘要：【目的】通過鑒定和分析蘋果14-3-3 基因家族，并在蘋果愈傷組織中過表達(dá)MdGRF13，研究逆境脅迫下其對(duì)蘋果愈傷組織生長(zhǎng)的影響，為探究該家族基因功能提供理論參考?！痉椒ā坷蒙镄畔W(xué)方法對(duì)蘋果14-3-3 基因家族進(jìn)行鑒定和表達(dá)分析，構(gòu)建MdGRF13 過表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化蘋果愈傷組織?！窘Y(jié)果】共鑒定出36 個(gè)蘋果14-3-3 基因家族成員。系統(tǒng)進(jìn)化分析將該家族成員分為ε 類和非ε 類，每個(gè)亞族基因結(jié)構(gòu)相似，且高度保守。共線性分析發(fā)現(xiàn)片段重復(fù)是該基因家族擴(kuò)張的主要原因?；蚪M織特異性表達(dá)分析顯示，蘋果14-3-3 家族基因在莖中多數(shù)上調(diào)表達(dá)。亞細(xì)胞定位表明MdGRF13 蛋白定位在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上。qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，在PEG和NaCl 處理下分別有14 和13 個(gè)基因在不同時(shí)間點(diǎn)上調(diào)表達(dá)。過表達(dá)型（OE）愈傷組織在PEG和NaCl處理下長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)于野生型（WT）?！窘Y(jié)論】鑒定出36 個(gè)蘋果14-3-3 基因家族成員，且各亞族成員結(jié)構(gòu)高度保守。過表達(dá)MdGRF13 增強(qiáng)了蘋果愈傷組織的抗旱性和耐鹽性。

關(guān)鍵詞：蘋果；14-3-3 基因家族；表達(dá)分析；亞細(xì)胞定位；愈傷組織

中圖分類號(hào)：S661.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980（2023）03-0405-17

植物在生長(zhǎng)發(fā)育過程中會(huì)受到高鹽、干旱、低溫和重金屬離子毒害等環(huán)境變化引起的非生物脅迫，造成植物生長(zhǎng)緩慢或死亡[1-2]。為了適應(yīng)這些非生物脅迫，植物自身進(jìn)化出多種保護(hù)系統(tǒng)來抵御逆境脅迫所造成的損傷[3]。14-3-3 作為應(yīng)激誘導(dǎo)蛋白通過參與真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來增強(qiáng)植物對(duì)逆境的耐受性，它通過激素信號(hào)途徑和離子通道來調(diào)控多種靶標(biāo)的活性，在非生物脅迫中起關(guān)鍵作用[4-6]。14-3-3 蛋白也具有調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)和發(fā)育的功能，其與鈣調(diào)蛋白激酶CDPK（calcium- dependentprotein kinase）共同作用調(diào)控植物新陳代謝、激素合成和開花等多種生物學(xué)途徑[7-8]。

目前14-3-3 蛋白已在甜瓜（Cucumis melo）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、番茄（Solanum lycopersicum）、大豆（Glycine max）、苜蓿（Medicago truncatula）、楊樹（Populus trichocarpa）、水稻（Oryza sativa）、花生（Arachis hypogaea）、棉花（Gossypium hirsutum）和杧果（Mangifera indica）中完成了鑒定[9-17]。研究發(fā)現(xiàn)，根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化和內(nèi)含子數(shù)量，14-3-3 基因家族劃分為ε 類和非ε 類，非ε 類含有4 個(gè)外顯子和3 個(gè)內(nèi)含子，而ε 類一般包含6～7 個(gè)外顯子和4～6 個(gè)內(nèi)含子[8，16-17]。14-3-3 基因在小麥、葡萄和香蕉生殖器官中高表達(dá)來調(diào)節(jié)植物淀粉合成、果實(shí)發(fā)育和漿果成熟等過程[18-20]。研究發(fā)現(xiàn)，4 個(gè)Md14-3-3 蛋白與花整合因子MdTFL1 和MdFT相互作用參與植物開花調(diào)控[21]，而過表達(dá)毛竹PvGF14b、PvGF14c 和PvGF14e 能夠延緩擬南芥的開花時(shí)間[22]。在番茄根系中，14-3-3 蛋白通過調(diào)控脫落酸（abscisic acid，ABA）信號(hào)通路來維持植物細(xì)胞滲透平衡和氣孔開度，進(jìn)而響應(yīng)干旱或鹽堿逆境脅迫[9]。前人研究發(fā)現(xiàn)，小麥TaGF14b 在煙草中過表達(dá)增強(qiáng)了植物對(duì)非生物脅迫的耐受性[23]。此外，Xia 等[15]通過qPCR 發(fā)現(xiàn)杧果植株在干旱處理12 h 后Mi14-3-3-A1 的表達(dá)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。水稻OsCPK21 與OsGF14e 磷酸化作用來調(diào)控ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和耐鹽性，而擬南芥14-3-3 蛋白質(zhì)充當(dāng)鹽過度敏感（SOS）信號(hào)通路分子開關(guān)，響應(yīng)鹽脅迫[24- 25]。棉花葉片中的5 個(gè)基因（Gh-GRF3、GhGRF4、GhGRF5、GhGRF7 和GhGRF16）在鹽脅迫下下調(diào)表達(dá)[26]。同時(shí)，過表達(dá)MdGRF11 可提高轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷組織和擬南芥對(duì)干旱和鹽脅迫的耐受性[27]。以上研究表明14-3-3 家族蛋白在植物生長(zhǎng)、發(fā)育和脅迫反應(yīng)中具有重要作用。

蘋果（Malus×domestica Borkh.）是中國(guó)廣泛種植的經(jīng)濟(jì)水果之一，而干旱和鹽堿等非生物脅迫仍是限制我國(guó)蘋果產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素。筆者在本研究中利用擬南芥和水稻蛋白序列在蘋果基因組中進(jìn)行同源比對(duì)，鑒定出36 個(gè)蘋果14-3-3 基因家族成員，對(duì)其理化性質(zhì)、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系及保守基序進(jìn)行分析，并探究該家族基因在植物組織和逆境脅迫下的表達(dá)情況，以及分析過表達(dá)MdGRF13 愈傷組織在PEG和NaCl 脅迫下的影響，為該家族基因響應(yīng)逆境功能研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與處理

試驗(yàn)于2021 年在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院果樹生理與生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。選擇繼代培養(yǎng)30 d生長(zhǎng)良好且一致的蘋果品種嘎拉實(shí)生苗外植體擴(kuò)繁的試管苗，轉(zhuǎn)接到含有15% PEG、100 μmol · L- 1ABA和200 mmol·L-1 NaCl [28]的MS液體培養(yǎng)基（降低濃度誤差）進(jìn)行處理，以等體積MS 培養(yǎng)基處理為對(duì)照，對(duì)照與各處理同步時(shí)長(zhǎng)均為2、12 和24 h，pH 值為5.8～6.0，采用紙橋法進(jìn)行固定。每組處理設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5 株試管苗。使用qRT-PCR 對(duì)10 年生嘎拉實(shí)生苗（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)日光溫室）進(jìn)行組織特異性數(shù)據(jù)分析。另外，使用本實(shí)驗(yàn)保存的蘋果王林愈傷組織進(jìn)行MdGRF13 的過表達(dá)分析。

1.2 蘋果14-3-3 家族基因的鑒定

用擬南芥（https：//www.arabidopsis.org/）和水稻（http：//rice.plantbiology.msu.edu/index.sh-tml）14-3-3家族的蛋白序列在蘋果數(shù)據(jù)庫(kù)GDR（https：//www.rosaceae.org/）中利用Blast 工具進(jìn)行比對(duì)，然后用SMART（http：//smart.emblheidelberg.de/） 和Pfam（http：//pfam.sanger.ac.uk/search）在線網(wǎng)站進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域的檢索，去除不含保守結(jié)構(gòu)域的蘋果序列，根據(jù)蘋果14-3-3 家族基因在染色上的位置進(jìn)行命名。

1.3 蘋果14-3-3 家族蛋白理化性質(zhì)及二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

對(duì)蘋果14-3-3 家族蛋白的理論等電點(diǎn)（pI）、分子質(zhì)量和不穩(wěn)定性指數(shù)等基本信息使用ExPASy（https：//web.expasy.org/protparam/）工具進(jìn)行分析。

根據(jù)二級(jí)結(jié)構(gòu)在線工具SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi- bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）對(duì)蘋果14-3-3 家族蛋白進(jìn)行α 螺旋、β 轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無(wú)規(guī)則卷曲比例的預(yù)測(cè)。

1.4 蘋果14-3-3 家族蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

下載大豆、番茄和二穗短炳草（NCBI）14-3-3 家族蛋白序列，與擬南芥、水稻以及蘋果蛋白序列用MEGA 7.0 軟件比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，校驗(yàn)參數(shù)默認(rèn)值為1000。

1.5 蘋果14-3-3 家族蛋白結(jié)構(gòu)和保守基序分析

采用GSDS（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）對(duì)蘋果14-3-3 家族基因成員進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析；利用在線網(wǎng)站MEME（http：//meme-suite.org/）對(duì)其蛋白保守基序預(yù)測(cè)。

1.6 蘋果14-3-3 家族基因共線性和蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

利用軟件TBtools 1.6 對(duì)蘋果14-3-3 家族基因進(jìn)行共線性分析，繪制關(guān)系圖。通過Phytozome v12.1：Home （https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）下載擬南芥和水稻的CDS序列及基因注釋文件，在GDR（https：//www.rosaceae.org/）中下載蘋果的基因組數(shù)據(jù)，使用TBtools 1.6 軟件繪制蘋果、水稻和擬南芥之間的關(guān)聯(lián)性圖。對(duì)36 個(gè)蘋果14-3-3 家族蛋白通過String 蛋白互作數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//string-db.org/）進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析和參數(shù)默認(rèn)。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR分析

36 個(gè)蘋果14-3-3 家族基因qRT-PCR 引物（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司在線設(shè)計(jì)，提取RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Prime Script RT reagentKit，Perfect Real Time，TaKaRa）合成cDNA；用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（LightCycler? 96 Real- TimePCR System，Roche，瑞士）和試劑盒（SYBR GreenⅠ，TaKaRa）進(jìn)行該家族基因在不同組織、PEG、ABA及NaCl 處理下表達(dá)量的分析。反應(yīng)體系為20 μL，分別加入6 μL ddH2O、2 μL cDNA、上下游引物各1 μL和10 μL SYBR。用SPSS 22.0 和Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及作圖。

1.8 MdGRF13 基因的克隆及亞細(xì)胞定位分析

RNA 來自嘎拉蘋果試管苗葉片。蘋果MdGRF13 基因克隆引物為F：5- GAGCTCGGTACCCGGGGATCCATGGCGGCAACCACCCCC-3，R：5-GGTGTCGACTCTAGAGGATCCGGTCTCGATCTTGGATTGGTAGTC-3。按照反應(yīng)程序95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火42 s，72 ℃延伸1 min，40 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)并回收目標(biāo)條帶。連接pCAMBIA1300 載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α（天根生物科技有限公司），進(jìn)行菌液PCR鑒定后，送生工生物工程（西安）股份有限公司測(cè)序。

將pCAMBIA1300-MdGRF13-GFP 表達(dá)載體質(zhì)粒和pCAMBIA1300-GFP 空載體質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101（北京博邁徳基因技術(shù)有限公司）。參照劉勇等[29]農(nóng)桿菌介導(dǎo)煙草葉片的侵染方法，將重懸菌液注射到本氏煙草葉片背面，培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d后，采用激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.9 MdGRF13 愈傷組織轉(zhuǎn)化、表型觀察及生理指標(biāo)測(cè)定

愈傷組織侵染參照張婷婷等[30]的方法。選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的蘋果王林愈傷組織進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染，并在誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含有潮霉素50 mg·L-1和頭孢霉素300 mg · L-1）上篩選。使用超光速mix（MF848）試劑盒（北京聚合美生物科技有限公司）鑒定轉(zhuǎn)基因愈傷組織，鑒定所用抗性基因Hyg 引物為，F(xiàn)：5-ATGAAAAAGCCTGAACTCACCG-3，R：5-CTATTTCTTTGCCCTCGGACGA-3；繼代培養(yǎng)。

取野生型和MdGRF13 過表達(dá)系OE-4、OE-2 及OE-3 愈傷組織0.05 g，放在分別含有2% PEG、4%PEG、0.06 mol · L-1 NaCl 和0.08 mol · L-1 NaCl 的MS固體培養(yǎng)基[27，31]上處理15 d，拍照并進(jìn)行鮮質(zhì)量統(tǒng)計(jì)。蘋果愈傷組織中丙二醛（MDA）含量及SOD、POD和CAT活性分別采用硫代巴比妥酸法[32]、氮藍(lán)四唑（NBT）法、愈創(chuàng)木酚法和紫外吸收法[33]測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果14-3-3 家族基因成員的鑒定

從蘋果基因組中共鑒定得到36 個(gè)14-3-3 家族基因（表2）。蘋果14-3-3 家族基因相對(duì)分子質(zhì)量為11 221.52～113 854.16 Da；氨基酸長(zhǎng)度介于98～1006 aa 之間；等電點(diǎn)（pI）為4.68～10.55；不穩(wěn)定系數(shù)MdGRF17 最小，為36.92，MdGRF8 最大，為98.48；大多數(shù)蘋果14-3-3家族蛋白的pI值小于7，其可能是酸性蛋白。對(duì)蘋果14-3-3家族36個(gè)基因編碼蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)其主要在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行相關(guān)表達(dá)，其次是細(xì)胞核，其中MdGRF2、MdGRF7、MdGRF8、MdGRF12、MdGRF16、MdGRF28 和MdGRF31 完全定位在細(xì)胞核中，預(yù)測(cè)這7 個(gè)蛋白僅在細(xì)胞核中發(fā)揮相關(guān)作用。MdGRF4 和MdGRF11 在葉綠體中有一定量的表達(dá)，預(yù)測(cè)這2 個(gè)蛋白可能與植物光合作用相關(guān)。

2.2 蘋果14-3-3 家族蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

對(duì)蘋果36 個(gè)14-3-3 家族蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明（圖1）。其蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)以α 螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為主，分別占23.08%（MdGRF8）～78.57%（MdGRF13）、15.47%（MdGRF18）～64.10%（MdGRF8）。而β 轉(zhuǎn)角占0%（MdGRF13）～7.93%（MdGRF16），延伸鏈占2.04%（MdGRF13）～22.65%（MdGRF33），二者所占比例較小。

2.3 蘋果14-3-3 家族基因進(jìn)化分析

將蘋果、擬南芥、水稻、大豆、二穗短柄草以及番茄的14-3-3 家族蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2）。

結(jié)果表明，該基因家族可分為ε 類和非ε 類，又分為5個(gè)亞族。其中，Ⅰ亞族有6 個(gè)蘋果14-3-3 家族基因，Ⅱ亞族有10 個(gè)蘋果14-3-3 家族基因，Ⅲ亞族有3 個(gè)蘋果14-3-3 家族基因，Ⅳ亞族有10 個(gè)蘋果14-3-3 家族基因，Ⅴ亞族有7 個(gè)蘋果14-3-3 家族基因。蘋果跟擬南芥14-3-3 家族基因有較高的同源性，進(jìn)化關(guān)系較近。

2.4 蘋果14-3-3 家族基因結(jié)構(gòu)和motif分析

對(duì)36 個(gè)蘋果14-3-3 基因家族構(gòu)建進(jìn)化樹以及基因結(jié)構(gòu)分析（圖3-A～B），該基因家族可分為ε 類和非ε 類。MdGRF11、MdGRF14、MdGRF23 和MdGRF27 僅有一個(gè)內(nèi)含子，MdGRF16 和MdGRF26有2 個(gè)內(nèi)含子，MdGRF7 和MdGRF24 有14 個(gè)內(nèi)含子。MdGRF24 和MdGRF33 明顯長(zhǎng)于其他基因，序列長(zhǎng)度超過8 kb。MdGRF2、MdGRF8、MdGRF13 和MdGRF28 屬于內(nèi)含子缺失類，整條序列均為外顯子，不同亞族序列外顯子分布位置和長(zhǎng)度差異較大，推測(cè)不同亞族有較大功能差異。對(duì)蘋果14-3-3 家族成員的motif 分析顯示（圖3-C），共鑒定出10 個(gè)motif，且都含有motif 3。MdGRF8、MdGRF12 和MdGRF14 蛋白只有一個(gè)保守基序，分別為motif 3、motif 2 和motif 1。同一亞族成員結(jié)構(gòu)相似，具有較高的保守性，其在蘋果生長(zhǎng)中可能發(fā)揮相似的功能；不同亞族間的motif 存在差異，表明其可能具有不同的生物學(xué)功能。

2.5 蘋果14-3-3 家族基因的共線性和蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

對(duì)36 個(gè)蘋果14-3-3 家族蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析表明（ 圖4-A）。15 個(gè)成員（MdGRF3、MdGRF4、MdGRF6 、MdGRF10 、MdGRF11 、MdGRF13 、MdGRF15 、MdGRF18 、MdGRF22 、MdGRF25 、MdGRF26 、MdGRF31 、MdGRF32 、MdGRF34 和MdGRF36）在網(wǎng)絡(luò)中與FT2、MdFT1 和XP—008366662.1 蛋白互作，推測(cè)蘋果14-3-3 家族蛋白與植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、生殖生長(zhǎng)和開花調(diào)控相關(guān)。

染色體定位顯示，33 個(gè)蘋果14-3-3 家族基因分布在11 條蘋果染色體上，3 個(gè)蘋果14-3-3 家族基因分布在chrUr 染色體上，而染色體Chr 05 上分布最多，有5 個(gè)蘋果14-3-3 家族基因（圖4-B）。對(duì)蘋果的36 個(gè)14-3-3 家族基因進(jìn)行共線性分析，結(jié)果如圖4-B 所示：10 對(duì)基因存在共線性，分別為MdGRF1/MdGRF34、MdGRF2/MdGRF32、MdGRF4/MdGRF20、MdGRF4/MdGRF29、MdGRF7/MdGRF18、MdGRF9/MdGRF21、MdGRF17/MdGRF30、MdGRF20/MdGRF29、MdGRF22/MdGRF35 和MdGRF24/MdGRF36，原因可能與大片段復(fù)制有關(guān)。存在MdGRF2/MdGRF3、MdGRF6/MdGRF7、MdGRF9/MdGRF10、MdGRF24/MdGRF25、MdGRF30/MdGRF31 和MdGRF32/MdGRF33 6 對(duì)串聯(lián)重復(fù)基因，片段重復(fù)在蘋果14-3-3 基因家族擴(kuò)展中占主要作用，該家族基因具有較高的同源性。

為了探討不同物種14-3-3 家族基因的進(jìn)化關(guān)系，分析了蘋果、單子葉植物水稻以及模式植物擬南芥之間的同源基因，結(jié)果表明（圖5），蘋果與擬南芥之間的關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)，存在20 對(duì)共線性基因?qū)ΓO果與水稻之間的關(guān)聯(lián)性相對(duì)較弱，存在3 對(duì)基因?qū)?。表明蘋果與擬南芥的14-3-3 家族基因親緣關(guān)系較近。

2.6 蘋果14-3-3 家族基因的組織特異性表達(dá)分析

對(duì)蘋果14-3-3 家族基因在根、莖和葉中的表達(dá)差異分析顯示（圖6），36 個(gè)基因在根、莖和葉中都有表達(dá)。4 個(gè)基因（MdGRF2、MdGRF17、MdGRF25 和MdGRF28）在根中有較高表達(dá)，16 和12 個(gè)基因分別在莖和葉中表達(dá)量較高。綜上所述，蘋果14-3-3 家族基因在不同組織中存在表達(dá)差異，且在莖中表達(dá)量高于葉和根。

2.7 蘋果14-3-3 家族基因?qū)Ψ巧锩{迫的表達(dá)分析

通過qRT-PCR 分析了36 個(gè)蘋果14-3-3 家族基因在PEG、ABA 和NaCl 處理下的相對(duì)表達(dá)量（圖7）。結(jié)果表明，ABA 處理2 h 后，MdGRF18 和MdGRF26 較對(duì)照顯著上調(diào)表達(dá)，MdGRF4 和MdGRF16 也有上調(diào)表達(dá)，MdGRF24 在ABA 處理24 h 后上調(diào)表達(dá)，其余基因均下調(diào)表達(dá)。MdGRF5、MdGRF14、MdGRF24 和MdGRF26 在PEG 處理2 h下與對(duì)照相比呈顯著上調(diào)表達(dá)，MdGRF2、MdGRF13和MdGRF26 在12 h 有較高表達(dá)，且MdGRF13 在24 h 表達(dá)量最高，為對(duì)照的1.8 倍，而其余基因表達(dá)量較低。NaCl處理下，MdGRF4、MdGRF5、MdGRF12、MdGRF14、MdGRF16、MdGRF19 和MdGRF24 在2 h較對(duì)照上調(diào)表達(dá)，MdGRF1、MdGRF9、MdGRF10、MdGRF13、MdGRF15 和MdGRF24 在12 h 顯著上調(diào)；MdGRF2 始終處于上調(diào)表達(dá)，且在2 h 表達(dá)量最高，為對(duì)照的18.6 倍，其可能在鹽脅迫中起正調(diào)控作用。MdGRF4、MdGRF5、MdGRF14 和MdGRF16 在NaCl 處理2 h 后表達(dá)量分別為對(duì)照的7.6、7.5、6.5 和15.6 倍，而MdGRF13 在NaCl 處理12 h 及24 h 后顯著上調(diào)表達(dá)，為對(duì)照的2.1 倍，推測(cè)蘋果14-3-3 家族基因可能響應(yīng)鹽脅迫。

2.8 蘋果MdGRF13基因克隆和亞細(xì)胞定位分析

由qRT-PCR 分析（圖7）表明MdGRF13 基因在15% PEG 以及200 mmol·L-1 NaCl 處理12 h 和24 h后較對(duì)照顯著上調(diào)表達(dá)，說明其在抵御非生物脅迫的過程中發(fā)揮重要的作用。因此，選擇MdGRF13基因克隆并進(jìn)行功能驗(yàn)證。

以嘎拉蘋果cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到與預(yù)期目標(biāo)一致的條帶（圖8-A），將擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后連接大腸桿菌DH5α 并通過PCR 陽(yáng)性檢測(cè)，所得結(jié)果與原序列（297 bp）相吻合（圖8-B）。最后轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，PCR檢測(cè)條帶合適（圖8-C）。

以pCAMBIA1300-GFP 空載體為陽(yáng)性對(duì)照，將MdGRF13 重組質(zhì)粒在煙草葉片中瞬時(shí)表達(dá)。結(jié)果表明（圖9），pCAMBIA1300-MdGRF13-GFP 表達(dá)載體的熒光定位在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上。

2.9 MdGRF13 過表達(dá)在蘋果愈傷組織的功能鑒定

將過表達(dá)載體pCAMBIA1300-MdGRF13-GFP轉(zhuǎn)化王林蘋果愈傷組織（圖10-A）。對(duì)所得轉(zhuǎn)基因愈傷組織通過PCR檢測(cè)，獲得了與陽(yáng)性對(duì)照片段大小一致的條帶（圖10-B），證明MdGRF13 在蘋果愈傷組織中轉(zhuǎn)化成功。選取過表達(dá)型OE-4、OE-2 和OE-3 進(jìn)行處理。

對(duì)野生型與過表達(dá)型愈傷組織經(jīng)不同濃度PEG處理下表型觀察發(fā)現(xiàn)（圖10-C），過表達(dá)型（OE）愈傷組織長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)于野生型（WT），且差異顯著，而2%PEG 處理下愈傷組織整體長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)于4% PEG。

0.06 mol·L-1 NaCl 處理下，過表達(dá)型（OE）愈傷組織長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)于野生型（WT），而在0.08 mol·L-1 NaCl 處理下，過表達(dá)型（OE）愈傷組織長(zhǎng)勢(shì)與野生型（WT）無(wú)顯著差異。

對(duì)WT和OE 愈傷組織進(jìn)行鮮質(zhì)量統(tǒng)計(jì)，并對(duì)MDA（丙二醛）含量以及CAT、POD 和SOD 酶活性進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明（圖10-D），0.08 mol·L-1 NaCl處理下，OE愈傷組織鮮質(zhì)量、MDA含量以及CAT、POD和SOD酶活性較WT無(wú)顯著差異，而其他處理下，OE愈傷組織鮮質(zhì)量以及CAT、POD和SOD酶活性高于WT，而OE 的MDA含量低于WT。表明過表達(dá)MdGRF13 能夠增強(qiáng)蘋果愈傷組織對(duì)干旱和鹽脅迫的抗性。

3 討論

14-3-3 蛋白是一類調(diào)控植物激酶與轉(zhuǎn)錄因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的基礎(chǔ)性蛋白，參與調(diào)節(jié)植物多種生理和發(fā)育過程[34-35]。筆者在本研究中通過對(duì)蘋果基因組數(shù)據(jù)分析鑒定得到36 個(gè)蘋果14-3-3 基因家族成員，與研究鑒定得到的擬南芥[16]、番茄[9]、苜蓿[11]、大豆[12]和茶樹[36]14-3-3 家族成員（分別為15、12、18、11 和23個(gè)）相比，蘋果14-3-3 基因家族成員數(shù)量大，表明14-3-3 基因家族成員在不同物種間有較大差異，而本研究較Ren 等[27]和Zuo 等[21]已發(fā)表文章鑒定出更多的蘋果14-3-3 家族成員，其中7 個(gè)基因（MdGRF8、12、13、16、23、26 和27）未被鑒定，且都存在于進(jìn)化關(guān)系的非ε 類，MdGRF12/MdGRF13、MdGRF16/MdGRF26 及MdGRF23/MdGRF27 相鄰（圖2），進(jìn)化關(guān)系較近。筆者在本文中通過qPCR 分析發(fā)現(xiàn)MdGRF19（MD10G1280300）在莖中表達(dá)量最高，而在葉中表達(dá)量最低，與Ren 等[27]的研究結(jié)果相反，與Zuo 等[21] 的研究結(jié)果相同。MdGRF11（MD10G1280300）[27]在ABA 和PEG 處理下表達(dá)趨勢(shì)與本文MdGRF19（MD10G1280300）研究結(jié)果基本一致。Zuo 等[21] 亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)MdGF14j（MD10G1280300）蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，與Ren 等[27]的研究結(jié)果相同。推測(cè)其原因可能是不同版本的數(shù)據(jù)庫(kù)有差異，以蘋果不同品種間的數(shù)據(jù)比對(duì)篩選出更多被識(shí)別的基因。

理化性質(zhì)分析表明，蘋果14-3-3 蛋白pI 值小于7，這與李菲等[11]14-3-3 蛋白是酸性氨基酸的研究結(jié)果一致。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示蘋果14-3-3 基因家族分為ε 類和非ε 類，且非ε 類雙子葉植物蘋果（52.8%）、擬南芥（57.1%）和番茄（58.3%）比例高于單子葉植物二穗短柄草（85.7%）和番茄（85.7%），在ε 類的結(jié)果相同[17]。Zuo 等[21]的研究表明，蘋果MdGF14a、MdGF14d、MdGF14i 和MdGF14j 蛋白與關(guān)鍵的花整合因子MdTFL1 和MdFT相互作用，參與開花調(diào)控，在本研究中，MdGRF6 在系統(tǒng)發(fā)育樹與MdGF14i 和MdGF14j 相鄰，推測(cè)其具有相似的作用。研究發(fā)現(xiàn)，14-3-3 蛋白以N-端和C-端不同的motif 為核心結(jié)構(gòu)發(fā)揮不同功能[37]，本研究中蘋果14-3-3 家族蛋白ε和非ε 類的N-端與C-端有不同的motif，該家族蛋白可能與靶蛋白相結(jié)合發(fā)揮重要功能。蘋果14-3-3 家族基因有10 對(duì)片段重復(fù)和6 對(duì)串聯(lián)重復(fù)基因，表明片段重復(fù)在其基因家族的進(jìn)化過程中起著重要的作用，并且串聯(lián)和片段重復(fù)事件有利于植物進(jìn)化過程中基因家族成員的擴(kuò)展[38-39]。煙草葉片瞬時(shí)表達(dá)亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)表明，MdGRF13 蛋白定位在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中，與Ren等[27]和Zuo等[21]所得結(jié)果相似，說明14-3-3 家族蛋白在不同植物中有保守功能，其可能在細(xì)胞核中調(diào)控部分基因的轉(zhuǎn)錄。

組織特異性表達(dá)有助于了解植物中的基因功能[40-41]。通過qRT-PCR發(fā)現(xiàn)蘋果14-3-3 家族基因在根、莖和葉組織中都有表達(dá)，而在莖中表達(dá)量較高，與木薯14-3-3 蛋白在塊根不同發(fā)育時(shí)期有不同組織的表達(dá)研究結(jié)果相似[42]，說明14-3-3 家族基因在蘋果中有一定的組織特異性表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，水稻OsGF14b 的突變對(duì)干旱和滲透脅迫耐受性的提高可能與ABA 信號(hào)通路有關(guān)[43]。qPCR 結(jié)果顯示，MdGRF4、MdGRF16、MdGRF18 和MdGRF26 在ABA處理下上調(diào)表達(dá)，本文結(jié)果與以上研究相似，推測(cè)該家族基因功能與ABA相關(guān)，表明蘋果14-3-3蛋白可能與ABA介導(dǎo)的保衛(wèi)細(xì)胞相結(jié)合，進(jìn)而影響其在激活A(yù)BA應(yīng)答基因中的轉(zhuǎn)錄[5]。干旱脅迫會(huì)降低植物的光合和碳水化合物的合成，進(jìn)而減緩植物的生長(zhǎng)發(fā)育[44]。14-3-3 蛋白作為重要的干旱調(diào)控因子在脅迫反應(yīng)中有不同程度的表達(dá)，MdGRF26 在PEG處理下高表達(dá)，同時(shí)，6 個(gè)基因有一定量的上調(diào)表達(dá)。本研究在蘋果愈傷組織過表達(dá)MdGRF13，在不同濃度PEG處理下，轉(zhuǎn)基因愈傷組織長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)于野生型，且以2% PEG 處理下長(zhǎng)勢(shì)最好，與棉花CGF14-4[45]和油菜GF14omeg 基因[46]在干旱脅迫下上調(diào)表達(dá)研究結(jié)果相似，表明過表達(dá)MdGRF13 增強(qiáng)了蘋果愈傷組織的抗旱性。實(shí)時(shí)熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)，MdGRF2、MdGRF4、MdGRF5、MdGRF13、MdGRF14 和MdGRF16 在NaCl 處理下表達(dá)量分別為對(duì)照的18.6、7.6、7.5、2.1、6.5 和15.6 倍，且本研究在0.06 mol·L-1 NaCl 處理下，轉(zhuǎn)基因愈傷組織長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)于野生型，與小麥[23]、番茄[9]、水稻[47]及短柄草[48]TaGF14b 在煙草中異位表達(dá)時(shí)增強(qiáng)鹽脅迫耐受性的研究結(jié)果相似，表明過表達(dá)MdGRF13 增強(qiáng)了蘋果愈傷組織對(duì)鹽脅迫的抗性。而在0.08 mol·L-1 NaCl 處理下，轉(zhuǎn)基因愈傷組織較野生型表型未發(fā)生較大變化，可能是較高濃度NaCl 處理抑制了愈傷組織的生長(zhǎng)。同時(shí)，本文研究結(jié)果與Ren 等[27]MdGRF11（MD10G1280300）在愈傷組織中過表達(dá)可增強(qiáng)抗旱性和耐鹽性研究結(jié)果一致。說明蘋果14-3-3 家族基因在抵御非生物脅迫的過程中發(fā)揮了重要的作用。

4 結(jié)論

本研究通過生物信息學(xué)分析鑒定出36 個(gè)蘋果14-3-3 基因家族成員，系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)其與擬南芥同源性較高，且各亞族成員結(jié)構(gòu)保守。亞細(xì)胞定位顯示，MdGRF13 蛋白定位在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中。過表達(dá)MdGRF13 增強(qiáng)了蘋果愈傷組織的抗旱性和耐鹽性。對(duì)進(jìn)一步研究蘋果14-3-3 家族成員的功能具有重要意義。

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