滇黃精及其炮制品中皂苷類成分的薄層色譜研究

戴萬生 彭凱 邱斌 賀森 顧雯

【摘 要】 目的：建立滇黃精及其炮制品的薄層色譜鑒別方法，考查滇黃精炮制前后皂苷類成分的變化差異。方法：在《中國藥典》2020版黃精薄層色譜法的基礎上，對供試液的提取方法、展開劑比例、飽和時間、點樣量等進行考察，并對滇黃精不同炮制品進行薄層分析。結果：優(yōu)化方法為水飽和正丁醇超聲提取總皂苷，以石油醚（60～90 ℃）∶[KG-*3/5]乙酸乙酯∶[KG-*3/5]甲酸（5∶[KG-*3/5]2.5∶[KG-*3/5]0.8） 展開，飽和時間為10 min，點樣量為6 μL，5%香草醛硫酸溶液顯色。黃精炮制后皂苷類成分產(chǎn)生一定變化。結論：本鑒別方法簡單、快捷、分離效果好、斑點清晰，可用于滇黃精及其炮制品的鑒別。

【關鍵詞】 滇黃精；炮制品；總皂苷；薄層色譜

【中圖分類號】R284.1 【文獻標志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2023）15-0029-04

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.13.zgmzmjyyzz202315007

Abstract：Objective To establish a TLC method for the identification of Polygonatum kingianum and its processed products， and to investigate the changes of saponins in Polygonatum kingianum before and after processing.Methods On the basis of TLC of Rhizoma Polygonati in Chinese Pharmacopoeia 2020， the extraction method， developing agent ratio， saturation time， the amount of sample， etc. of the test solution were investigated， and the different processed products of Polygonatum kingianum. were analyzed by TLC. Results The optimized method was water saturated n-butanol ultrasonic extraction of total saponins，and developed with petroleum ether （60-90 ℃）： ethyl acetate： formic acid （5∶[KG-*3/5]2.5∶[KG-*3/5]0.8）. The saturation time was 10min， the amount of sample was 6 μL， and the color was developed with 5% vanillin sulfuric acid solution. After processing， saponins of Polygonatum kingianum produced certain changes. Conclusion The identification method is simple， rapid， with good separation effect and clear spots， which can be used to identify Polygonatum kingianum and its processed products.

Keywords：Polygonatum kingianum; Processed Products; Total Saponins; Thin Layer Chromatography

黃精為百合科黃精屬植物滇黃精Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl.、黃精Polygonatum sibiricum Red.或多花黃精Polygonatum cyrtonema Hua.的干燥根莖。按形狀不同，習稱“大黃精”“雞頭黃精”“姜形黃精”［1］。中醫(yī)認為，黃精味甘、性平，歸脾、肺、腎經(jīng)。具有養(yǎng)陰潤肺、補脾益氣、滋腎填精的功效，常用于肺陰虧虛所致的干咳痰少、胸中隱痛，腎陰不足所致的腰膝酸軟、頭暈乏力，脾胃虧虛所致的納差食少等。黃精生用具麻味，刺人咽喉，故多蒸后入藥，蒸后可增強補脾潤肺益腎的功效，并可消除其麻味，減輕對咽喉的刺激。現(xiàn)代研究［2］表明，黃精含有黃精多糖、低聚糖、甾體皂苷、黃酮等多種化學成分，具有抗衰老、降血糖、降血脂、防動脈粥樣硬化、提高和改善記憶等廣泛的作用。《中國藥典》［1］收載的黃精薄層鑒別，藥材和飲片相同，與對照藥材色譜相應的位置上顯相同顏色的斑點，但存在拖尾和斑點不夠清晰；亦有文獻［3-5］報道采用黃精皂苷元的薄層鑒別，分離效果較好且斑點清晰，可作為黃精的定性鑒別，但不能反映黃精及其炮制品的區(qū)別，黃精皂苷類成分為其主要有效成分之一，理論上加熱會產(chǎn)生一定的水解反應，從而產(chǎn)生藥性和藥理的變化。南北朝雷斅著《雷公炮炙論》首次記載黃精為“蒸黃精”（凡采得，以溪水洗凈后，蒸，從巳至子，刀薄切，曝干用），以后歷代以九蒸九曬黃精為主，《中國藥典》收載為酒黃精，云南炮制規(guī)范收載為炙黃精，主要區(qū)別在于所加輔料和蒸制時間的不同，炮制不加輔料或加黃酒、黑豆、蜂蜜等不同輔料，蒸制時間從幾小時到幾十小時不等，炮制是否“適度”無客觀指標控制，其內(nèi)在質量的差異難于判定［6-7］。因此本文以滇黃精為原料加工炮制為不同炮制品后，改進《中國藥典》黃精薄層鑒別方法，建立滇黃精不同炮制品的皂苷類成分薄層鑒別方法，并對其進行色譜分析，為滇黃精炮制工藝和質量標準的制定提供科學依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 AR224CN型分析天平［奧豪斯儀器（常州）有限公司］；SK7210HP型超聲波清洗器（上?？茖С晝x有限公司）；DK-98-IIA型電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試藥 硅膠G（青島海洋化工有限公司，批號：20170915）；薯蕷皂苷元對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號：S102115-79-7）；5％香草醛硫酸試液［5 g香草醛加10%硫酸乙醇100 mL（無水乙醇）配制而成］；其余化學試劑均為分析純。黃精采自云南祿豐，經(jīng)邱斌教授鑒定為滇黃精Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl.的根莖。

2 方法與結果

2.1 樣品的炮制［1，8-9］

2.1.1 生黃精 取鮮黃精，去除雜質，洗凈，置沸水中煮15 min，取出，放涼，切3～4 mm厚片，60 ℃干燥，得生黃精片， 粉碎，過60目篩，備用。

2.1.2 蒸黃精 取鮮黃精，去除雜質，洗凈，置蒸制容器內(nèi)蒸14 h，取出，切3～4 mm厚片，60 ℃干燥，得蒸黃精， 粉碎，過60目篩，備用。

2.1.3 酒黃精 取生黃精片，適宜的容器內(nèi)，加20％黃酒及適量（100%）水拌勻，浸潤過夜，置蒸制容器內(nèi)蒸12 h，悶潤12 h，取出，60 ℃干燥，得酒黃精，粉碎，過60目篩，備用。每100 kg黃精，用黃酒20 kg。

2.1.4 炙黃精 取生黃精片，置適宜的容器內(nèi)，加入黑豆汁、蜂蜜、白酒及適量水（85%）拌勻，浸潤過夜，置蒸制容器內(nèi)蒸12 h，悶潤12 h，取出，60 ℃干燥，得炙黃精，粉碎，過60目篩，備用。每100 kg黃精，用黑豆10 kg，蜂蜜5 kg，白酒5 kg。

2.1.5 九蒸九曬黃精 取鮮黃精，去除雜質，洗凈，置蒸制容器內(nèi)蒸4 h，取出，60 ℃干燥4 h，如此反復9次，切3～4 mm厚片，取出，60 ℃干燥，得九蒸九曬黃精，粉碎，過60目篩，備用。

2.2 溶液制備方法

2.2.1 對照品溶液的制備 取薯蕷皂苷元對照品適量，精密稱定，制成濃度為0.06 mg/mL 的溶液，備用。

2.2.2 供試液的制備

2.2.2.1 甲醇超聲提取法 取黃精粉末10 g，置燒瓶中，加入15倍量甲醇，浸泡30 min，60 ℃超聲提取50 min，過濾，按上法加入甲醇再提1次，合并濾液，回收溶劑至干，殘渣加甲醇10 mL使溶解，備用。

2.2.2.2 乙醇提取正丁醇萃取法 取黃精粉末10 g，加70%乙醇20 mL，加熱回流1 h，過濾，濾液蒸干，殘渣加水10 mL使溶解，加正丁醇振搖提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇10 mL使溶解，備用。

2.2.2.3 正丁醇超聲提取法 取黃精粉末10 g，置燒瓶中，加入15倍量水飽和正丁醇，浸泡30 min，60 ℃超聲提取50 min，提取2次，合并濾液，減壓濃縮回收溶劑至干，殘渣加甲醇10 mL使溶解，備用。

2.3 供試液提取方法的選擇 取2.2.2項下3種方法制得的供試液和薯蕷皂苷元對照品溶液分別點于同一硅膠G薄層板上，點樣量4μL，以石油醚（60～90 ℃）∶[KG-*3/5]乙酸乙酯∶[KG-*3/5]甲酸（5∶[KG-*3/5]2∶[KG-*3/5]0.5））為展開劑，將展開劑倒于展缸中飽和30 min，薄層板飽和30 min后展開，展距8 cm左右，取出，晾干，用5%香草醛硫酸溶液顯色。結果： 正丁醇超聲提取法，分離較好，斑點清晰，效果最好。因此，按正丁醇超聲提取法制備供試液。見表1，如圖1所示。

2.4 色譜條件的優(yōu)化

2.4.1 展開劑系統(tǒng)的優(yōu)化 展開系統(tǒng)優(yōu)先考慮低毒性而采用藥典所用展開系統(tǒng)，但多次預實驗表明其分離效果不佳，故對其展開劑系統(tǒng)比例進行優(yōu)化以期達到更好的分離效果。取生黃精、酒黃精、九蒸九曬黃精的正丁醇超聲提取樣液和對照品點于同一硅膠G薄層板上，點樣量4 μL，以不同比例的石油醚（60～90 ℃）∶[KG-*3/5]乙酸乙酯∶[KG-*3/5]甲酸展開系統(tǒng)①5∶[KG-*3/5]2∶[KG-*3/5]0.1；②5∶[KG-*3/5]2∶[KG-*3/5]0.5；③5∶[KG-*3/5]2∶[KG-*3/5]0.8；④5：1.5∶[KG-*3/5]0.8；⑤5∶[KG-*3/5]2.5∶[KG-*3/5]0.8展開，晾干，用5%香草醛硫酸溶液顯色。結果： 綜合分離情況、Rf值大小、斑點數(shù)和清晰度，展開系統(tǒng)比例為5∶[KG-*3/5]2.5∶[KG-*3/5]0.8時效果較理想，故選用展開劑⑤為展開劑。如圖2所示。

2.4.2 飽和時間的考察 取對照品、生黃精、酒黃精、九蒸九曬黃精樣液點于同一硅膠G薄層板上，點樣量4 μL，展開系統(tǒng)：石油醚（60～90 ℃）∶[KG-*3/5]乙酸乙酯∶[KG-*3/5]甲酸（5∶[KG-*3/5]2.5∶[KG-*3/5]0.8），飽和10 min、20 min、30 min后展開，晾干，用5%香草醛硫酸溶液顯色。結果： 飽和時間對展開效果影響不大，故選擇飽和10 min為展開飽和時間。如圖3所示。

2.4.3 點樣量的考察 分別取對照品與生品、酒制品、九蒸九曬品樣液不同點樣量2 μL、4 μL、6 μL點于同一硅膠G薄層板上，展開系統(tǒng)：石油醚（60～90 ℃）∶[KG-*3/5]乙酸乙酯∶[KG-*3/5]甲酸（5∶[KG-*3/5]2.5∶[KG-*3/5]0.8），飽和10 min 展開后，晾干，用5%香草醛硫酸溶液顯色。結果： 點樣量6 μL時，斑點比較清晰，故選擇點樣量為6 μL。如圖4所示。

2.5 不同炮制品的薄層分析 分別取對照品、生黃精、蒸黃精、酒黃精、炙黃精、九蒸九曬黃精樣液6μL點于硅膠G薄層板上，展開系統(tǒng)∶[KG-*3/5]石油醚（60～90 ℃）∶[KG-*3/5]乙酸乙酯∶[KG-*3/5]甲酸（5∶[KG-*3/5]2.5∶[KG-*3/5]0.8），飽和10 min 后展開，晾干，用5%香草醛硫酸溶液顯色。結果： 不同滇黃精炮制品分離效果好，共7個藍色或藍紫色斑點，Rf值分別為0.08、0.20、0.50、0.55、0.63、0.86和0.90。其中蒸黃精中Rf值為0.63的斑點明顯較淡，九蒸九曬黃精中Rf值為0.08的斑點較大，且顏色與其它炮制品不一樣。如圖5所示。

3 結論與討論

《中國藥典》黃精薄層鑒別方法采用70%乙醇提取正丁醇萃取制備供試液，本文改用水飽和正丁醇超聲提取更加簡單、快捷，所得供試液雜質少、濃稠度低，色譜分離效果好、斑點更清晰（如圖1）；對《中國藥典》所用展開系統(tǒng)石油醚（60～90 ℃）∶[KG-*3/5]乙酸乙酯∶[KG-*3/5]甲酸（5∶[KG-*3/5]2∶[KG-*3/5]0.1）與其它不同比例進行比較研究表明：展開系統(tǒng)比例為5∶[KG-*3/5]2.5∶[KG-*3/5]0.8時，分離效果、斑點數(shù)多，清晰度較理想（如圖2）。

本實驗中選用薯蕷皂苷元作為對照品主要考慮滇黃精中含有多種甾體皂苷以薯蕷皂苷為主，但實驗中對照品薯蕷皂苷元斑點略低于滇黃精Rf值0.50的斑點，且顏色不一致，薯蕷皂苷元顯黃色，而滇黃精Rf值0.50的斑點顯藍紫色，說明滇黃精及其炮制中薯蕷皂苷元含量較低。鐘凌云等［10］研究亦表明黃精炮制后黃精中薯蕷皂苷元含量下降，薄層色譜斑點色澤與大小不同， 其中生品斑點較大且顏色較深， 而制品斑點較小且顏色較淡。實驗說明滇黃精炮制后薯蕷皂苷轉化為薯蕷皂苷元較少，可能主要為其它次生苷類成分。故薯蕷皂苷元不宜做為其薄層色譜分析的對照品，以暫用滇黃精對照藥材為宜。此外，王倩等［11］報道滇黃精炮制過程中甾體皂苷轉化成延齡草苷和薯蕷皂苷元，含量增大。其原因待于進一步研究。

有關滇黃精蒸制“時間”“適度”問題的討論。雷斅首創(chuàng)黃精單蒸法炮制，蒸制間為14 h；孫思邈發(fā)展為“重蒸法”蒸制到“食之如蜜”，估算時間在十幾小時至二十小時；后經(jīng)孟詵建立“九蒸九曝”之法，直到清代九蒸九曬之法成為黃精炮制的主要方法，蒸制時間較長，不統(tǒng)一；現(xiàn)代，黃精以灑蒸法為主，蒸制時間在6～48 h?，F(xiàn)行《藥典》黃精質量標準中以黃精多糖為含量測定指標，問題是黃精多糖隨蒸制時間的延長而降低，時間越長含量越低，這與黃精炮制后“增效”不符，所以飲片生產(chǎn)企業(yè)按藥典含量指標要求炮制往往存在黃精炮制“不及”情況；另一方面，民間過度強調“九蒸九曬”，蒸制時間過長，易出現(xiàn)苦味和酸味等不良氣味，可能會降低其藥性和功效。所以“適度”是炮制的基本原則。通過不同滇黃精的薄層色譜分析（如圖5）發(fā)現(xiàn)：九蒸九曬黃精薄層色譜中出現(xiàn)一個較大的墨綠色斑點，證明滇黃精經(jīng)過九蒸九曬后確實生成了新的成分，此斑點是否是滇黃精薯蕷皂苷轉化生成的主要次生苷有必要進一步研究。筆者認為此斑點可視為滇黃精炮制由量變到質變的特征性斑點，可以做為滇黃精炮制是否“不及”的判定，后期實驗筆者發(fā)現(xiàn)滇黃精蒸24 h時些斑點明顯，故建立的滇黃精薄層鑒別方法可用于生、制滇黃精的鑒別。

《中國藥典》采用的展開劑按比例配制后直接應用，調整比例后的展開劑需配制后分層取上層液應用。

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（收稿日期：2022-11-13 編輯：陶希睿）

基金項目：云南省科技廳-云南中醫(yī)藥大學應用基礎研究聯(lián)合專項（2017FF116-017）；云南省生物醫(yī)藥2021重大專項（202102AA310045）。

作者簡介：戴萬生（1967—），男，漢族，碩士，副教授，研究方向為中藥炮制機理及規(guī)范化研究。E-mail：1363598221@qq.com