康萊特注射液對人膽管癌細胞RBE 和HCCC9810生長、凋亡、遷移的影響*

史亞波 周夢娜 劉華兵 殷俊翔 曹振軍 龔帥昌#

（1 南昌大學醫(yī)學院 江西 南昌 330006；2 江西省人民醫(yī)院 南昌 330006；3 南昌醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 江西 南昌 330006）

膽管癌是繼肝細胞癌之后的第二大常見肝臟惡性腫瘤，在過去的40 年中，膽管癌的總體發(fā)病率在全球范圍內逐漸增加[1]。手術是首選治療方案，但大多數患者處于疾病中晚期，無法根治性治療影響其結局?？等R特注射液是一種雙相廣譜抗腫瘤藥物，用于治療多種原發(fā)性惡性腫瘤，包括肺癌、肝癌、胃癌和乳腺癌，其在體外和體內腫瘤模型中被證實對許多腫瘤細胞系具有抗增殖和促凋亡作用[2]。臨床應用證明，康萊特與化療、放療或手術相結合，可顯著降低癌癥惡病質，提高癌癥患者的生活質量，改善預后[3]。而康萊特注射液是否可用于膽管癌的臨床治療以及作用機制等方面的相關研究甚少。本研究采用人膽管癌細胞RBE 和HCCC9810 作為研究對象，探討康萊特注射液可能的抗腫瘤相關機制，為膽管癌臨床診斷及藥物治療篩選提供新的理論依據?，F(xiàn)報道如下：

1 資料與方法

1.1 材料 人膽管癌細胞RBE 和HCCC9810（上?？道噬锟萍加邢薰荆?，臨床藥物100 mg/ml 康萊特注射液（國藥準字Z10970091），RPMI-1640 培養(yǎng)基（美國GIBCO 公司），10%胎牛血清（FBS，美國GIBCO 公司），磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）和胰蛋白酶-EDTA（德國Merck 公司），CCK-8 試劑盒和蛋白提取試劑盒（上海碧云天公司），Transwell 小室（北京萌壯科技有限公司），兔抗人Bcl-2、Bax 和Caspase-3 單克隆抗體（美國CellSignaling 公司），鼠抗人GAPDH 單克隆抗體（美國Abcam 公司），0.1%結晶紫染色液（廣州和為醫(yī)藥科技有限公司），碘化丙啶（北京奧萊博科技有限公司），4%多聚甲醛溶液（湖北科沃德化工有限公司），辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG（美國Santa Cruz 公司），RIPA 細胞裂解液（北京索萊寶科技有限公司），Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒（美國BD 公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 取用人膽管癌細胞RBE 和HCCC9810 分別置于內含10%FBS 及1%青霉素鏈霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2和98%相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在pH 7.4 下用PBS洗滌，并用胰蛋白酶-EDTA（0.25%）分離傳代后取對數生長期細胞用于實驗。

1.2.2 運用CCK-8 法檢測康萊特注射液對人膽管癌細胞RBE 和HCCC9810 的增殖影響 采用100 mg/ml 康萊特注射液處理人膽管癌細胞RBE 和HCCC9810（制備成單細胞懸液），取對數生長期的細胞分別以每孔5×103個細胞/ml 接種于96 孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)，四周用PBS 填滿，作為實驗組，同時以此方法設置空白對照組（康萊特濃度為0 mg/ml）。分別在24 h、48 h、72 h、96 h 4 個時間段檢測每個時間段的細胞生長狀態(tài)，設置6 個復孔，加入10 μl CCK-8 溶液，在37℃、5%CO2和98%相對濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h 后酶標儀測定450 nm 波長處各孔的吸光度（OD 值），同時繪制生長曲線，實驗重復3 次。

1.2.3 運用流式細胞儀測定人膽管癌細胞RBE 和HCCC9810 的凋亡情況 采用100 mg/ml 康萊特注射液處理人膽管癌細胞RBE 和HCCC9810，取對數生長期的細胞分別接種5×105個細胞至6 孔板，置于37℃、5%CO2和98%相對濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后，離心收集上述細胞，作為實驗組，以同樣的方式進行空白對照組處理（康萊特濃度為0 mg/ml）。同時用預冷的PBS 洗滌細胞并重懸，將細胞懸液（400 μl）加入15 μl Annexin V-FITC、10 μl 碘化丙啶（PI）中充分混勻，孵育20 min 后用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況，分析細胞凋亡并記錄，實驗重復3 次，用FlowJo V10 軟件處理。

1.2.4 Transwell 實驗檢測人膽管癌細胞RBE 和HCCC9810 的遷移能力 采用100 mg/ml 康萊特注射液處理人膽管癌細胞RBE 和HCCC9810 作為實驗組，并細胞計數，另設空白對照組（康萊特濃度為0 mg/ml）。將細胞沉淀用無FBS 的培養(yǎng)基進行稀釋（1:6），并調整濃度為1×105個/ml，取80 μl 細胞懸液接種于上室。在下室中加入含有10%FBS 作為趨化劑的培養(yǎng)基。在37℃、5%CO2和98%相對濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出Transwell 小室，PBS 沖洗，用棉簽拭去上下室的液體，使用4%多聚甲醛溶液固定20 min，后再次PBS 沖洗，并用0.1%結晶紫染色30 min，后顯微鏡下觀察、拍照計數，實驗重復3 次。

1.2.5 Western Blot 檢測人膽管癌細胞RBE 和HCCC9810 信號通路中關鍵蛋白Caspase-3、Bcl-2和Bax 的表達 采用100 mg/ml 康萊特注射液處理48 h 的人膽管癌細胞RBE 和HCCC9810 作為實驗組，以同樣的方式進行空白對照組處理（康萊特濃度為0 mg/ml）。后分別用PBS 洗滌細胞2 次，使用RIPA 緩沖液充分裂解細胞，于冰上裂解30 min 后離心，取上清，使用二辛可酸法（BCA）法測定蛋白質濃度，通過SDS-PAGE 在80 V 電泳下分離1.5 h，并在100 V 電泳下轉移到PVDF 膜2 h。5%脫脂奶粉封閉，加入一抗Caspase-3（1:1 000）、Bcl-2（1:2 000）、Bax（1: 2 000）及內參GAPDH（1:2 000）在4℃室溫下孵育過夜。然后在室溫下與HRP 綴合的多克隆IgG（1:1 000）（二抗）結合，孵育2 h，PBST 洗滌5 min×3 次，使用數字成像儀拍照，并使用Image J 進行灰度值比較分析記錄，實驗重復3 次。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用Graphpad Prism 8.0 軟件對所有數據進行統(tǒng)計學分析，計量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 康萊特注射液對人膽管癌細胞RBE 和HCCC9810 增殖的影響康萊特注射液（100 mg/ml）處理RBE 和HCCC9810 細胞后，與對照組（康萊特濃度為0 mg/ml）相比，隨著藥物作用時間的延長，顯著降低了RBE 和HCCC9810 細胞的活力，抑制細胞增殖，并且抑制程度存在時間依賴性，隨作用時間的延長而逐步增加，96 h 時最為明顯（P＜0.05）。見圖1、表1 與圖2、表2。

表1 康萊特對人膽管癌細胞RBE 增殖的影響（）

注：n=3 是指重復了3 次實驗。

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表2 康萊特對人膽管癌HCCC9810 細胞增殖的影響（）

表2 康萊特對人膽管癌HCCC9810 細胞增殖的影響（）

注：n=3 是指重復了3 次實驗。

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圖1 康萊特對人膽管癌細胞RBE 增殖的影響

圖2 康萊特對人膽管癌HCCC9810 細胞增殖的影響

2.2 康萊特注射液對人膽管癌細胞RBE 和HCCC9810 凋亡率的影響 采用流式細胞術計算細胞凋亡率，經康萊特注射液（100 mg/ml）處理48 h后，與對照組相比（康萊特濃度為0 mg/ml），康萊特注射液能加速RBE 和HCCC9810 細胞凋亡（P＜0.05）。見圖3、表3 和圖4、表4。

表3 康萊特對人膽管癌RBE 細胞凋亡的影響（%，）

表3 康萊特對人膽管癌RBE 細胞凋亡的影響（%，）

注：n=3 是指重復了3 次實驗。

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表4 康萊特對人膽管癌細胞HCCC9810 凋亡的影響（%，）

表4 康萊特對人膽管癌細胞HCCC9810 凋亡的影響（%，）

注：n=3 是指重復了3 次實驗。

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圖3 康萊特對膽管癌RBE 細胞凋亡的影響

圖4 康萊特對人膽管癌細胞HCCC9810 凋亡的影響

2.3 蛋白質印跡法檢測結果 人膽管癌細胞RBE和HCCC9810 經100 mg/ml 康萊特注射液處理48 h后，與對照組比較（康萊特濃度為0 mg/ml），凋亡通路中的關鍵蛋白Bcl-2、Bax 和Caspase-3 被檢測到。隨著作用時間的延長，Caspase-3 蛋白表達增加，Bcl-2 逐漸開始減少，Bax 隨藥物作用時間的增加呈現(xiàn)逐漸上調的趨勢（P＜0.05）。見圖5、圖6。

圖5 康萊特對人膽管癌細胞RBE 凋亡通路中的關鍵蛋白Caspase-3、Bcl-2 及Bax 蛋白表達水平的影響

圖6 康萊特對人膽管癌細胞HCCC9810 凋亡通路中的關鍵蛋白Caspase-3、Bcl-2 及Bax 蛋白表達水平的影響

2.4 康萊特注射液對人膽管癌細胞RBE 和HCCC9810 遷移能力的影響 （Transwell 小室實驗結果）觀察顯微鏡單視野下穿過小室的人膽管癌細胞RBE 和HCCC9810 細胞數量見圖7、圖8 及表5。結果顯示，隨著康萊特用藥時間的延長，在顯微鏡單視野下穿過小室的RBE 和HCCC9810 細胞數量與對照組相比較，遷移細胞的數量明顯減少（P＜0.05）。

表5 康萊特對人膽管癌細胞RBE 和HCCC9810 遷移能力的影響（個/ 高倍鏡，）

表5 康萊特對人膽管癌細胞RBE 和HCCC9810 遷移能力的影響（個/ 高倍鏡，）

注：n=3 是指重復了3 次實驗。

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圖7 康萊特對人膽管癌細胞RBE 遷移能力的影響（結晶紫染色200）

圖8 康萊特對人膽管癌細胞HCCC9810 遷移能力的影響（結晶紫染色200）

3 討論

膽管癌是一種起源于膽管上皮細胞的惡性腫瘤。它是僅次于肝細胞癌的第二大最常見的原發(fā)性肝惡性腫瘤，約占所有原發(fā)性肝腫瘤的15%和所有胃腸道癌癥的3%[4]。然而，過去幾十年中，膽管癌的發(fā)病率和病死率在全球范圍內不斷增加，這對公共衛(wèi)生帶來了巨大的挑戰(zhàn)，其預后較差。目前，膽管癌的主要治療方案仍是外科手術切除，輔以化療。但是，即使進行根治性手術，患者的5 年生存率仍然較低，中位生存時間不到12 個月。這主要是由于膽管癌常常在晚期才被發(fā)現(xiàn)，且易于轉移和復發(fā)。近年來中醫(yī)藥制劑在肝膽腫瘤的治療中起到重要的作用，例如能夠提高外科手術成功率、改善機體內環(huán)境、調節(jié)患者免疫力等，同時聯(lián)合應用化療藥物不僅能降低化療所帶來副反應，還能使其抗腫瘤作用增效，從而提高治療效果[5～6]。

抗腫瘤藥物康萊特注射液的有效成分薏苡仁，具有多種抗癌作用，其主要活性成分是含有4 種脂肪酸的甘油三酯化合物，可以作用于腫瘤細胞的G2/M 期，抑制細胞的有絲分裂及生長[7]。此外，康萊特注射液還能有效地抑制腫瘤血管的形成、促進腫瘤細胞凋亡和抑制腫瘤細胞增殖[8]。研究表明，康萊特注射液可以通過對Na+/K+-ATP 酶的抑制來調控腫瘤生長及影響其細胞周期，進而產生抗癌作用[9]。此外，康萊特已被證明通過調節(jié)PI3K/Akt/mTOR 信號通路來誘導細胞凋亡并抑制癌細胞增殖，從而增強腫瘤細胞對化療的敏感性[10～11]?？等R特還可激活機體免疫系統(tǒng)，如NK 細胞的活性，增加CD4+/CD8+的比例，使白細胞介素（IL）-2 水平分泌增多，降低轉錄調節(jié)核因子-κB（NF-κB），促進吞噬細胞的吞噬功能及脾淋巴結的增殖，通過免疫調節(jié)作用在體內表現(xiàn)出抗腫瘤活性[12～13]。這些作用在體內表現(xiàn)出抗腫瘤活性，使康萊特注射液成為一種重要的抗癌藥物，但康萊特注射液是否能影響人膽管癌細胞RBE 和HCCC98100 生長、凋亡、遷移，相關報道不多見。

本研究發(fā)現(xiàn)，康萊特注射液在作用于人膽管癌細胞RBE 和HCCC9810 后，與對照組相比，康萊特注射液能夠抑制人膽管癌細胞RBE 和HCCC9810的增殖、遷移能力，誘導其發(fā)生凋亡，機制可能與凋亡信號通路關鍵蛋白Caspase-3、Bax 和Bcl-2 有關。Bcl-2 家族的促凋亡和抗凋亡因子通過復雜的相互作用共同決定著細胞進程，抗凋亡蛋白Bcl-2 高表達時，形成Bcl-2/Bax 異源二聚體，保護細胞，抑制凋亡；而促凋亡蛋白Bax 高表達時形成Bax/Bax 同源二聚體，通過從線粒體中釋放細胞色素C 和抑制Bcl-2 的抗凋亡作用使細胞趨向凋亡。所以，Bcl-2 與Bax 比例大小決定著細胞的最終歸宿[14]。Bax 是最知名的直接影響細胞凋亡的下游p53 轉錄靶標之一，同時Bcl-2 和Bax 的表達均受抑癌基因p53 的調節(jié)，p53 已被證明可直接激活促凋亡蛋白Bax、Caspase-3，從而促進細胞凋亡[15]。Caspase 是程序性細胞死亡的關鍵介質，凋亡的早期啟動和晚期進展與之密切相關。激活Caspase-3 使其表達后能夠催化許多關鍵細胞蛋白發(fā)生特異性裂解。Caspase-3 通過自身蛋白水解切割、加工、激活組裝核酸內切酶，使核體間DNA 斷裂，導致細胞凋亡，其第2 個途徑涉及線粒體的參與，線粒體將Caspase 激活蛋白釋放到細胞質中，從而形成凋亡小體。Caspase-3 也可介導PAK2 和凝溶膠蛋白裂解導致細胞凋亡[16]。通過本研究，實驗組中康萊特注射液作用于人膽管癌RBE 和HCCC9810 后，Caspase-3、Bax 蛋白表達明顯上調，Bcl-2 蛋白表達下調；基于上述研究結果，康萊特注射液可能通過調控細胞凋亡信號通路關鍵蛋白Caspase-3、Bcl-2 和Bax 來抑制膽管癌的惡性生物學行為。

綜上所述，本研究表明康萊特注射液可能是一種潛在的、治療膽管癌的藥物，可以抑制人膽管癌細胞RBE 和HCCC9810 的生長和遷移能力，促進其凋亡，機制可能與其能上調凋亡信號通路關鍵蛋白Caspase-3、Bax 和下調Bcl-2 蛋白表達有關。未來的研究還應進一步探討康萊特注射液在膽管癌治療中的具體作用機制，以及其與其他治療方法的聯(lián)合應用是否可以提高治療效果。