DART-MS/MS快速檢測(cè)食品中非法添加的N-芐基他達(dá)拉非等7種新型PDE-5型抑制劑

任 靜，董培智，趙麗紅

（1. 山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 晉中 030619；2. 山西省檢驗(yàn)檢測(cè)中心藥品檢驗(yàn)技術(shù)研究所 食品藥品安全防控山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030031）

近年，很多不法商家在利益的驅(qū)動(dòng)下，在一些食品中非法添加化學(xué)物質(zhì)以增強(qiáng)其宣稱功能。由于添加的化學(xué)物質(zhì)未經(jīng)毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)且劑量隨意，對(duì)消費(fèi)者的身心健康帶來(lái)一定隱患[1]。因此，解決食品安全中存在的非法添加亂象及建立相應(yīng)的檢測(cè)方法顯得尤為重要。

目前，文獻(xiàn)報(bào)道中有關(guān)磷酸二酯酶5（PDE-5）抑制劑傳統(tǒng)檢測(cè)方法多為高效液相色譜法[2-4]，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[5-9]，核磁共振波譜法[10-12]等。上述方法中，所使用的儀器設(shè)備較大，大多需要繁瑣的樣品提取、制備和分離過程[13]，且成本高，污染大。理想的快速檢測(cè)方法應(yīng)該是具有快速、省時(shí)、簡(jiǎn)便、環(huán)保等特點(diǎn)[14]。

近年興起的實(shí)時(shí)直接分析（direct analysis in real time，DART）質(zhì)譜是一種新型的質(zhì)譜電離技術(shù)[15-16]。其原理是利用He或N2氣體分子在高壓放電針下形成輝光放電產(chǎn)生等離子體，隨后等離子體打在待測(cè)品表面，使待測(cè)物品分子電離，產(chǎn)生的離子進(jìn)入質(zhì)譜檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)[17-19]。DART質(zhì)譜不再需要繁瑣的樣品前處理、制備大量的流動(dòng)相，只需幾秒鐘就可分析單個(gè)樣品，特別適合樣品的實(shí)時(shí)、快速、高通量篩查[20]。

本研究以市售宣稱具有抗疲勞等作用的食品為研究對(duì)象，采用DART-MS/MS技術(shù)對(duì)非法添加的PDE-5抑制劑的分析條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了一種高效、準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)單的分析方法，以期為保障食品質(zhì)量安全提供技術(shù)支撐。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent Ultivo LC/TQ質(zhì)譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；SVP-DART離子源（美國(guó)IonSense公司）；Eppendorf移液器（德國(guó)艾本德公司）；DV215CD電子天平（美國(guó)奧豪斯公司）。

1.2 藥品與試劑

3-羥丙基去甲他達(dá)拉非對(duì)照品，羥基卡巴地那非對(duì)照品，環(huán)己基去甲他達(dá)拉非對(duì)照品，四氫咔啉對(duì)照品，N-苯基丙氧苯基卡巴地那非對(duì)照品，N-芐基他達(dá)拉非對(duì)照品（加拿大TLC Pharmachem公司）；丙氧苯基去碳去甲基卡巴地那非對(duì)照品（湖北省藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院）。以上對(duì)照品純度均≥96.0 %。乙腈（色譜純，美國(guó)迪馬公司）；高純氦氣，氮?dú)猓兌取?9.999 %，太原市泰能氣體有限公司）。牡蠣粉，蛋白粉，咖啡，金咖啡，蟲草強(qiáng)腎片樣品為歷年抽檢樣品；海參肽片、鹿鞭牡蠣粉由上海市食品藥品檢驗(yàn)研究院提供。

2 方法

2.1 對(duì)照品溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取7種那非類對(duì)照品各5 mg，置入50 ml量瓶，用乙腈溶解并定容，得到100 μg/ml的儲(chǔ)備溶液，保存在0～5 ℃冰箱中，臨用前用乙腈稀釋為10 μg/ml的工作液或配制成10 μg/ml的混合溶液。

2.2 樣品前處理

取樣品適量，混勻，研細(xì)，取約2 g，精密稱定，置入50 ml量瓶，用乙腈定容[21]，然后手動(dòng)振搖混合溶液10 s。用移液器吸取4 μl溶液置玻棒尖端，滑動(dòng)速度為0.2 mm/s，然后在氦氣流中放置約10 s，進(jìn)樣。

2.3 檢測(cè)條件

DART條件：氦氣為離子化氣體，氮?dú)鉃榇龣C(jī)氣體，采用12位液體樣品進(jìn)樣模塊（12-Dip-it Module）進(jìn)樣，篩網(wǎng)電壓為250 V，離子源出口距質(zhì)譜進(jìn)口為2.5 cm，氣體壓力為0.50 MPa，用濃度為10μg/ml的單一對(duì)照品溶液和10 μg/ml的混合對(duì)照品溶液分別優(yōu)化7種PDE-5抑制劑的離子源溫度、進(jìn)樣速率和進(jìn)樣體積，以碎裂離子的總峰面積選擇最優(yōu)參數(shù)，其余DART參數(shù)均為儀器默認(rèn)設(shè)置。

MS/MS條件：正離子模式采集；碎裂電壓135 V；質(zhì)量掃描范圍為m/z100～1000；采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式，將濃度為10 μg/ml的7種PDE-5標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜碎裂，以碎裂離子峰的峰面積選定最優(yōu)碰撞能量（見表1），其余質(zhì)譜參數(shù)為儀器默認(rèn)參數(shù)。

表1 7種PDE-5抑制劑的質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)

2.4 定性過程

用移液器吸取4 μl混合對(duì)照品溶液（10 μg/ml）點(diǎn)于自動(dòng)進(jìn)樣架上的玻棒尖端，DART離子源和MS/MS條件見2.3，在MRM模式下進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜碎裂，確定了7種PDE-5化合物的碎片離子峰（見表1），并利用離子豐度比進(jìn)行定性分析，當(dāng)樣品色譜圖中所選擇監(jiān)測(cè)離子對(duì)的相對(duì)豐度比與相當(dāng)濃度的對(duì)照品溶液的離子相對(duì)豐度比（K）偏差不超過規(guī)定范圍[21]，即可判定樣品中檢出相應(yīng)的化合物。

3 結(jié)果與分析

3.1 DART離子源條件的優(yōu)化

3.1.1 離子源溫度的選擇 對(duì)于DART離子源，其溫度的改變會(huì)影響化合物的離子化效率。DART加熱室的溫度提高，激發(fā)態(tài)氦原子的離子化能力也隨之增強(qiáng)，使得分子離子碎片的比例提高[22]。因此，實(shí)驗(yàn)中用單一對(duì)照品溶液對(duì)DART離子源溫度進(jìn)行優(yōu)化。分別取適量10 μg/ml單一對(duì)照品溶液，分別于300～500 ℃（以50 ℃為梯度）下進(jìn)樣，利用每個(gè)溫度下測(cè)得的離子總峰面積來(lái)評(píng)價(jià)離子源溫度對(duì)檢測(cè)靈敏度的影響，結(jié)果見圖1。由圖1可見，溫度在300～500 ℃范圍內(nèi)，離子化效率隨溫度的升高呈上升趨勢(shì)。300 ℃時(shí)7種化合物的總峰面積很小，這可能是由于較低溫度下分析物的解吸不良導(dǎo)致[23]。超過450 ℃后離子信號(hào)減弱，這可能是由于溫度過高使得樣品分解、碳化[24]。綜合考慮最終選擇的最佳溫度為450 ℃。

圖1 7種PDE-5抑制劑離子總峰面積與離子源溫度的關(guān)系

3.1.2 樣品傳輸速度的選擇 對(duì)于DART離子源，其軟件操控的滑動(dòng)軌道速度也會(huì)對(duì)結(jié)果造成影響。一般來(lái)說(shuō)樣品傳輸速度越小，離子化氣體與目標(biāo)化合物接觸越充分，進(jìn)入檢測(cè)器的離子越多，離子響應(yīng)強(qiáng)度也越高，反之，離子化強(qiáng)度越低[25]。因此，本試驗(yàn)用混標(biāo)溶液對(duì)樣品傳輸速度進(jìn)行優(yōu)化。分別取適量10μg/ml混合對(duì)照品溶液，分別在0.2～1.0 mm/s（以0.2 mm/s為梯度）速度下進(jìn)樣，利用每個(gè)速度下測(cè)得的離子總峰面積來(lái)評(píng)價(jià)樣品傳輸速度對(duì)離子化效率的影響，結(jié)果見圖2。由圖2可見，樣品在0.2 mm/s的傳輸速度下得到的離子峰面積最大，且峰形良好。綜合其對(duì)各檢測(cè)值的影響，最終選擇的最佳傳輸速度為0.2 mm/s。

圖2 7種PDE-5抑制劑離子總峰面積與進(jìn)樣速率的關(guān)系

3.1.3 進(jìn)樣體積的選擇 實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)利用玻管蘸取混合對(duì)照品溶液置氦氣流中，其質(zhì)譜信號(hào)弱，且峰形較差。故采用移液器吸取混合對(duì)照品溶液置玻管尖端的方式，對(duì)進(jìn)樣體積進(jìn)行優(yōu)化。分別吸取2～10 μl（以2 μl為梯度）濃度為10μg/ml的混合對(duì)照品溶液進(jìn)樣，利用每個(gè)待測(cè)體積下測(cè)得的離子總峰面積來(lái)評(píng)價(jià)進(jìn)樣體積對(duì)檢測(cè)靈敏度的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可見，離子信號(hào)強(qiáng)度隨進(jìn)樣體積的增加而增加，但隨著進(jìn)入質(zhì)譜儀的離子增多，而質(zhì)譜儀中可容的離子數(shù)量有限，離子的響應(yīng)強(qiáng)度也會(huì)隨之減弱[26]。綜合考慮，選擇4μl作為最優(yōu)進(jìn)樣量。

圖3 7種PDE-5抑制劑離子總峰面積與進(jìn)樣體積的關(guān)系

3.2 專屬性

分別取空白溶劑、對(duì)照品溶液，并將收集好的陰性、陽(yáng)性、基質(zhì)樣品按2.2項(xiàng)下方法操作，獲得相應(yīng)色譜圖，見圖4。結(jié)果表明，7種被測(cè)成分的響應(yīng)均未受到溶劑、樣品組分的干擾，且響應(yīng)度良好。

圖4 DART-MS/MS檢測(cè)食品中7種新型PDE-5型抑制劑的典型圖譜

3.3 重復(fù)性

取陰性蛋白粉樣品適量，加入一定體積的對(duì)照品溶液，混勻，晾干，自制同一含量的陽(yáng)性樣品粉末6份并進(jìn)行測(cè)定。3-羥丙基去甲他達(dá)拉非、羥基卡巴地那非、環(huán)己基去甲他達(dá)拉非、四氫咔啉、N-芐基他達(dá)拉非、N-苯基丙氧苯基卡巴地那非、丙氧苯基去碳去甲基卡巴地那非的平均含量分別為1.36，0.7，12，0.6，6.2，0.6，3.2 μg/g；RSD分別為8.7 %，10.1 %，2.4 %，3.4 %，2.8 %，5.2 %，10.8 %。

3.4 穩(wěn)定性

分別考察3.3項(xiàng)下自制陽(yáng)性樣品溶液于25 ℃放置0，2，4，8，12，24 h的穩(wěn)定性，并進(jìn)樣分析。結(jié)果表明，自制陽(yáng)性樣品在室溫考察時(shí)間內(nèi)均穩(wěn)定，RSD為1.6 %～6.0 %。

3.5 檢出限

在上述優(yōu)化后條件下，在空白基質(zhì)中加入混標(biāo)溶液，樣品經(jīng)前處理后進(jìn)樣檢測(cè)。以3倍信噪比時(shí)進(jìn)樣濃度為檢出限確定了7種PDE-5抑制劑的檢出限，見表2。由表2可見，該方法PDE-5抑制劑的檢出限為0.025～12.5 μg/g，可滿足此類藥物的篩查要求。

表2 7種PDE-5抑制劑檢出限

表3 180批市場(chǎng)抽檢樣品檢出情況

3.6 樣品檢測(cè)

采用本方法對(duì)180批次市場(chǎng)抽檢樣品進(jìn)行檢測(cè)。比較樣品與對(duì)照品的分子離子峰及碎片離子峰的相對(duì)離子豐度：樣品色譜圖中所選擇監(jiān)測(cè)的離子相對(duì)豐度與相當(dāng)濃度對(duì)照品溶液的離子相對(duì)豐度比（K）偏差不超過規(guī)定范圍[±（20 %～25 %）][21]，檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)4種陽(yáng)性樣品，分別非法添加羥基卡巴地那非、環(huán)己基去甲他達(dá)拉非、N-芐基他達(dá)拉非和N-苯基丙氧苯基卡巴地那非。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)建立了采用DART離子源結(jié)合三重四極桿質(zhì)譜定性檢測(cè)3種基質(zhì)中7種PDE-5抑制劑的方法。該方法與傳統(tǒng)的液相、液質(zhì)等技術(shù)相比，不需要復(fù)雜的樣品前處理、耗時(shí)的色譜分離及大量化學(xué)試劑的消耗，適用于食品中非法添加的PDE-5抑制劑的快速篩查。