山奈酚與肽聚糖聯(lián)合對HepG2細胞增殖和凋亡的影響*

柯飛燕，伍志偉，何玉林，顧超豪，陳根

835000 新疆 伊犁，伊犁師范大學 生物與地理科學學院（柯飛燕、伍志偉）；541199 廣西 桂林，桂林醫(yī)學院 基礎醫(yī)學院（柯飛燕、何玉林、顧超豪、陳根）

肝癌是全球范圍內最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈現(xiàn)出明顯的上升趨勢。據(jù)估計，到2025年，我國肝癌的年發(fā)病率將超過100萬。其中，肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）在中國是最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率高達75%以上［1］。目前，肝癌治療主要采用手術療法、化療、放療、生物治療等措施。然而，由于肝癌發(fā)展迅速，早期癥狀不明顯，HCC通常在晚期被診斷出來，使得這些治療措施很難開展［2］。因此，探索治療HCC的新藥物已成為目前研究的熱點。

枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）是一種好氧、抗逆性極強的優(yōu)質益生菌，對維持腸道的微生態(tài)平衡具有重要作用［3］；肽聚糖（peptidoglycan，PG）是枯草芽胞桿菌細胞壁的主要成分，在體內具有抗腫瘤及免疫賦活等多種功能［4］。羅漢果（Siraitia grosvenorii）是葫蘆科多年生藤類植物，是我國首批公布的藥食兩用材料之一，具有極高的藥用價值和營養(yǎng)價值，素有“神仙果”之稱［5］。本課題組前期通過網絡藥理學的方法，探討羅漢果抑制HCC的有效成分、作用靶點及相關信號通路，發(fā)現(xiàn)羅漢果山奈酚（kaempferol，KF）可能通過凋亡途徑抑制HCC的增殖。在此基礎上，本研究旨在通過羅漢果KF聯(lián)合枯草芽胞桿菌PG作用于人肝癌HepG2細胞，觀察細胞形態(tài)、遷移、凋亡以及相關蛋白、mRNA表達情況，探討二者聯(lián)合對人肝癌細胞HepG2增殖的抑制效果及分子作用機制。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物

KF（純度≥97%，批號：520-18-3）、PG（批號：69554）均購自Sigma公司。

1.2 細胞株

人肝癌HepG2細胞株和人正常肝細胞LO2細胞株均為廣西腫瘤免疫與微環(huán)境調控重點實驗室自存。

1.3 試劑

DMEM培養(yǎng)基（批號：812248）購自Gibco公司；0.25%胰酶（批號：T1300）、青鏈霉素雙抗（批號：P1400）均購自北京索萊寶科技有限公司；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（批號 ：556547）購自BD Pharmingen 公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號：P0010S）購自上海碧云天生物技術有限公司；AKT1（批號：A17909）、p-Akt（批號：AP1259）Bax（批號：A19684）、Bcl-2（批號：A19693）和β-actin（批號：AC006）兔單克隆抗體及Goat Anti-Rabbit IgG（HRP）二抗（批號：AS014）均購自ABclonal公司；Trizol試劑購自美國Life technologies公司。

1.4 儀器

細胞培養(yǎng)箱（新加坡ESCO有限公司）；渦旋震蕩儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；酶標儀（美國BIO-Tek公司）；JY系列電子天平（上海方瑞儀器有限公司）；PCR基因擴增儀、實時熒光定量PCR儀（美國BIO-RAD公司）；超聲破碎儀（美國SONICS公司）。

1.5 方法

1.5.1 細胞培養(yǎng) HepG2在添加10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基里培養(yǎng)，37℃、5% CO2、飽和濕度條件下靜置培養(yǎng)。在指數(shù)生長期收集細胞，研究其抗腫瘤作用。

1.5.2 MTT實驗 將HepG2細胞或LO2細胞以5×103個/mL初始密度接種到96孔板中，每孔0.2 mL；分別加入不同終濃度（0、10、20、40、60、80 μmol/L）KF、（0、10、20、40、60、80 μg/mL）PG及相應的PG + KF組合培養(yǎng)24 h、48 h和72 h。培養(yǎng)至相應時間點后，加入MTT 20 μL，孵育4 h后去除上清液，然后每孔中加200 μL DMSO ，震蕩溶解沉淀，酶標儀在490 nm處檢測其OD值。

1.5.3 細胞分組及處理 將細胞隨機分為對照組（不作處理）、PG組（40 μg/mL）、KF組（40 μmol/L）、聯(lián)合組（40 μg/mL PG + 40 μmol/L KF）

1.5.4 細胞形態(tài)學觀察 HepG2按1×105個/mL 初始密度接種于六孔板中，按“1.5.3”處理48 h后，顯微鏡下觀察HepG2細胞形態(tài)并拍照。

1.5.5 劃痕實驗檢測HepG2細胞遷移能力 HepG2按4×105個/mL密度接種于六孔板中，過夜貼壁后，用10 μL無菌槍頭垂直劃線以模擬傷口。然后，用預熱的PBS清洗劃痕，以去除細胞碎片。洗滌后在含有1%胎牛血清的DMEM中培養(yǎng)細胞。分別于0 h、48 h在光學顯微鏡下拍攝圖像，計算細胞傷口愈合面積。

1.5.6 流式細胞儀檢測HepG2細胞凋亡情況 HepG2按1×105個/孔接種于六孔板中，按“1.5.3”處理48 h后，收集細胞，用300 μL Binding Buffer懸浮，5 μL FITC Annexin V和5 μL PI充分混勻；室溫避光孵育15 min后，1 h內上機檢測細胞，計算細胞凋亡率。

1.5.7 Western blot檢測細胞蛋白表達的變化 收集用藥物處理48 h后的細胞，經細胞裂解、離心、收集上清液獲得總蛋白。用BCA蛋白試劑盒測定其濃度。取相同質量蛋白樣品進行電泳，轉膜，在5% BCA中室溫封閉2 h，4℃下過夜孵育一抗（1∶1 000）。次日室溫孵育1 h與其相對應的種屬二抗（1∶10 000），按說明書配制發(fā)光液進行發(fā)光。

1.5.8 qRT-PCR檢測相關基因mRNA水平 HepG2細胞按1×105個/孔接種于六孔板中，按“1.5.3”處理48 h后，用Trizol提取細胞總RNA。根據(jù)逆轉錄試劑盒操作將其反轉錄為cDNA，隨后根據(jù)說明書上機檢測。引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1.Primer Sequence

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 PG和KF對HepG2細胞增殖的抑制作用及對LO2細胞毒性的影響

MTT結果顯示，不同濃度的KF和PG干預HepG2細胞不同時間的抑制率不同，且具有時間濃度依賴性（圖1A、B）。為了檢驗KF和PG對正常肝細胞LO2是否具有毒害作用，分別進行給藥處理24 h、48 h、72 h。實驗結果表明二者對正常肝細胞LO2在48 h和72 h存在輕微抑制作用（圖1C、D）。用不同濃度PG和KF聯(lián)合處理HepG2細胞24 h、48 h、72 h檢測細胞增殖能力。結果表明（圖2），相比對照組，48 h和72 h的細胞增殖能力明顯受到抑制，其中40 μg/mL PG、40 μmol/L KF最為顯著（P ＜ 0.01）。將40 μg/mL PG、40 μmol/L KF及聯(lián)合用藥組（40 μg/mL PG + 40 μmol/L KF）進行綜合分析發(fā)現(xiàn)（圖1E），聯(lián)合用藥組的抑制效果明顯強于單獨用藥組。因此選取40 μmol/L KF、40 μg/mL PG，聯(lián)合用藥組為40 μg/mL PG + 40 μmol/L KF，時間為48 h進行后續(xù)實驗。

圖1 MTT檢測PG和KF對HepG2和LO2細胞增殖的影響Figure 1.Effects of Peptidoglycan and Kaempferol on the Proliferation of HepG2 and LO2 Cells

圖2 PG和KF聯(lián)合用藥抑制HepG2細胞增殖Figure 2.Inhibition of HepG2 Proliferation by the Combination of Peptidoglycan and Kaempferol

2.2 PG和KF對HepG2細胞形態(tài)的影響

鏡下觀察顯示（圖3），對照組細胞貼壁良好，形態(tài)規(guī)則，輪廓清晰，細胞之間的連接較為緊密；PG組雖然部分細胞變圓脫落但總體數(shù)量與對照組相比并不顯著；KF組細胞密度降低，細胞間聯(lián)系減少；聯(lián)合用藥組細胞數(shù)量明顯減少，并伴有較多漂浮死細胞，表明聯(lián)合用藥組對細胞增殖的抑制作用較單獨用藥顯著。

圖3 PG和KF對HepG2細胞生存的影響（×10）Figure 3.Effects of Peptidoglycan and Kaempferol on the Survival of HepG2 Cells （×10）

2.3 PG和KF對HepG2細胞遷移能力的影響

與對照組相比（圖4），單獨應用PG與KF均對HepG2細胞遷移有明顯抑制作用；與單獨用藥組相比，聯(lián)合用藥后，細胞遷移能力顯著降低（P＜0.05），說明聯(lián)合用藥有效提高藥物對HepG2細胞遷移的抑制作用。

圖4 PG和KF對HepG2細胞遷移能力的影響（×4）Figure 4.Effects of Peptidoglycan and Kaempferol on the Migration of HepG2 Cells （×4）

2.4 PG和KF對HepG2細胞凋亡的影響

對照組凋亡率為4.64%，PG組凋亡率為15.56%，KF組凋亡率為12.26%，明顯高于對照組；聯(lián)合用藥組凋亡率為38.5%，較單獨用藥組顯著增高（P ＜0.05；圖5）。

圖5 PG和KF對HepG2細胞凋亡率的影響Figure 5.Effects of Peptidoglycan and Kaempferol on the Apoptosis Rate of HepG2 Cells

2.5 PG和KF對HepG2細胞相關蛋白表達的影響

與對照組相比（圖6），單獨用藥組細胞中Bax蛋白相對表達量增加，Bcl-2蛋白相對表達量減少；與單獨用藥組相比，藥物聯(lián)合處理后，Bax蛋白相對表達量顯著提高（P ＜ 0.05），Bcl-2蛋白相對表達量顯著降低（P ＜ 0.05），而Akt蛋白在藥物處理48 h后基本保持不變，p-Akt蛋白相對表達量下降，說明在HCC中，與單獨用藥相比，聯(lián)合用藥組可進一步加速細胞的凋亡過程。

圖6 PG和KF作用于HepG2細胞后對相關蛋白表達情況Figure 6.Expression of Related Proteins in HepG2 Cells Treated with Peptidoglycan and Kaempferol

2.6 KF和PG對HepG2細胞中Bax和Bcl-2 mRNA的影響

與對照組相比（圖7），單獨用藥組均可使促凋亡相關分子Bax mRNA水平升高，而使抑凋亡相關分子Bcl-2 mRNA水平降低；與單獨用藥組相比，聯(lián)合用藥進一步提高了Bax mRNA在HepG2細胞中的水平、降低了Bcl-2 mRNA在細胞中的水平（P ＜ 0.05）。

圖7 PG和KF對凋亡分子的表達情況Figure 7.Effects of Peptidoglycan and Kaempferol on the Expression of Apoptotic Molecules

3 討 論

近年來，腫瘤已成為世界上最主要的疾病致死原因之一，也是影響人類平均生活質量的主要因素之一［6］。“一種藥物，一個目標，一種疾病”的傳統(tǒng)治療方法已逐漸轉變?yōu)椤岸喑煞?、多靶點”的復合療法，在控制病情發(fā)展、改善癥狀等方面的優(yōu)勢日益凸出［7］。有大量研究表明，中藥已逐漸應用于肝癌治療，在改善肝功能、免疫功能等方面效果顯著［8］。

根據(jù)《中藥志》的記載，羅漢果味甘、性涼，具有清熱解毒、潤腸通便、潤肺止咳等作用，在臨床上廣泛應用于各種疾病［9］。課題組前期通過網絡藥理學檢索發(fā)現(xiàn)KF為羅漢果有效成分之一。KF是一種常見的黃酮類化合物，目前應用于癌癥化療，對肺癌、肝癌、結腸癌、口腔癌、膀胱癌、卵巢癌等有抑制作用［10］。研究表明，KF可通過內質網應激CHOP信號通路來誘導HepG2細胞凋亡［11］。由N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸通過β-1，4糖苷鍵連接聚合而成的PG是細菌細胞壁的主要成分［12］。大量研究表明，PG可以抑制多種癌細胞的轉移、增殖和侵襲。例如，雙歧桿菌PG通過抑制上皮間質轉化進程［13］、調節(jié)VEGF、Ki67等［14］的表達從而誘導結腸癌細胞SW480增殖及遷移，進而發(fā)揮抗腫瘤活性。此外，體內研究表明，PG對小鼠免疫功能具有調節(jié)作用，其腫瘤體積明顯縮?。?5-16］。本研究結果顯示，較PG、KF單獨使用，二者聯(lián)用能明顯抑制HepG2細胞增殖和遷移能力，并提高細胞凋亡率。

細胞凋亡在維持細胞死亡和分裂之間的平衡方面起著至關重要的作用，逃避凋亡會使細胞不受控制地增殖，從而導致不同的疾病，如癌癥。凋亡受多個基因調控，Bcl-2家族參與其中。Bcl-2是一個具有抑制凋亡作用的原癌基因，而Bcl-2同系蛋白Bax則具有促凋亡作用。Bcl-2家族成員之間的平衡及相互作用是決定細胞是否生存或凋亡的關鍵［17-18］。本研究的實驗結果表明，與單獨使用PG或KF比較，聯(lián)合用藥組的Bax表達水平增加，Bcl-2和p-Akt表達水平降低，提示二者聯(lián)合能促進HepG2細胞凋亡。

綜上所述，細胞實驗發(fā)現(xiàn)PG與KF兩者聯(lián)合具有抑制HepG2細胞增殖、遷移能力和促進凋亡的作用，其機制可能與調控細胞內Bax、Bcl-2和Akt表達有關。然而，本實驗僅僅在體外細胞層面進行了研究，缺乏在動物實驗等方面的研究，且肝癌的發(fā)病機制較為復雜，二者聯(lián)合是否可以直接應用于肝癌的臨床治療，還有待進一步研究證實。

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