雞傳染性喉氣管炎病毒W(wǎng)F03株關(guān)鍵抗原基因和毒力基因的遺傳演化與致病性分析

張 翼,王晨燕,楊 驍,邵國(guó)青,3,侯 博*

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/福建省畜禽疫病疾病防治工程技術(shù)研究中心,福州 350013;2.默沙東(寧波)動(dòng)物保健科技有限公司,寧波 315336;3.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所,南京 210014)

傳染性喉氣管炎病毒(infectious laryngotracheitis virus,ILTV)屬于皰疹病毒科、α皰疹病毒亞科傳染性喉氣管炎病毒屬。ILTV感染雞后引起雞喉氣管炎(infectious laryngotracheitis,ILT),主要危害成年雞和產(chǎn)蛋雞,造成死亡和/或產(chǎn)蛋下降,種雞的ILT 發(fā)病呈世界性分布,世界上許多國(guó)家都有該病的發(fā)病報(bào)道,該病在我國(guó)近幾年也呈散發(fā)流行趨勢(shì),不斷有養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生ILTV感染的報(bào)道[1-4]。臨床上嚴(yán)重的ILTV感染往往表現(xiàn)為呼吸困難、喘氣、咳血等,具有很高的致死性,而溫和型感染主要表現(xiàn)為黏液性氣管炎、鼻炎、結(jié)膜炎、不愿活動(dòng)和低死亡率等多種形式,不論是嚴(yán)重感染還是溫和型感染均給生產(chǎn)帶來(lái)了嚴(yán)重的損失和威脅。在集約化養(yǎng)禽的發(fā)達(dá)國(guó)家,已使用弱毒疫苗控制了蛋雞的ILT,但有報(bào)道稱(chēng)在2019年4月以來(lái)我國(guó)山東省多個(gè)地區(qū)發(fā)生了多起商品肉雞、地方品種肉雞等感染ILTV的病例,臨床主要表現(xiàn)為嚴(yán)重的咳血、呼吸困難以及呼吸道粘膜出血和充血[3],表明ILTV感染肉雞目前在我國(guó)呈現(xiàn)出散發(fā)和多發(fā)現(xiàn)象。

ILTV的基因組大小約為155 kb,是一種雙鏈DNA病毒,與其他皰疹病毒一樣,基因組包括長(zhǎng)獨(dú)特區(qū)、短獨(dú)特區(qū)以及兩端的反向重復(fù)序列等結(jié)構(gòu),編碼大量的糖蛋白以及與毒力和病毒復(fù)制有關(guān)的蛋白。gB和UL32基因編碼病毒粒子的表面糖蛋白,其中g(shù)B不僅是病毒感染所必需的糖蛋白,而且是一種主要的保護(hù)性抗原,可誘導(dǎo)體液免疫[5],并且在病毒感染過(guò)程中誘導(dǎo)膜融合和病毒穿入[6-7]。糖蛋白gD作為皰疹病毒的受體對(duì)于病毒結(jié)合到敏感細(xì)胞的表面是必需的[8-9]。糖蛋白gB和gD也是ILTV等皰疹病毒的保護(hù)性抗原,可誘導(dǎo)中和抗體和細(xì)胞免疫反應(yīng),是重要的免疫原蛋白[10-11]。而糖蛋白gE/gI對(duì)于ILTV在細(xì)胞與細(xì)胞之間擴(kuò)散具有顯著的促進(jìn)作用,缺失gE/gI的ILTV病毒噬斑形成能力顯著下降,僅能夠在單細(xì)胞內(nèi)增殖[12]。TK基因是ILTV的主要毒力基因[13],缺失TK可以使ILTV的致病力減弱但仍然保持良好的免疫原性[14]。ICP4基因參與激活病毒早/晚期基因的表達(dá),與病毒毒力存在關(guān)聯(lián)[15]。糖蛋白gC是ILTV主要的表面抗原蛋白,對(duì)病毒的復(fù)制是非必需的,但缺失gC可以使ILTV對(duì)雞的致病力減弱,并且增強(qiáng)先天性和特異性免疫反應(yīng)[16]。糖蛋白gG是ILTV的毒力因子,缺失gG可以使病毒毒力顯著減弱[17]。此外還有報(bào)道糖蛋白gD、gB、gH、gL、gK、gM、gN等參與了皰疹病毒致病性的形成[18-21]。

ILTV野毒株的毒力差異很大,部分毒株感染雞后具有很高的發(fā)病率和致死率,屬于強(qiáng)致病力毒株,而感染后癥狀輕微或不明顯、無(wú)致死率的毒株屬于溫和型毒株,因此及時(shí)了解我國(guó)當(dāng)前散發(fā)的ILTV毒株的致病性和主要抗原基因和毒力基因的系統(tǒng)發(fā)育和進(jìn)化關(guān)系,以及篩選一株攻毒后發(fā)病穩(wěn)定的強(qiáng)毒株用于ILTV活疫苗的效力檢驗(yàn),對(duì)于做好ILT的防控具有重要的臨床意義。本研究對(duì)1株臨床ILTV分離株的主要免疫原性基因和毒力基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析,了解其與疫苗株之間的進(jìn)化親緣關(guān)系,并在28日齡和56日齡SPF雞測(cè)定了該毒株的致病力,其研究結(jié)果為我國(guó)有效預(yù)防和控制ILTV的感染提供了臨床參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

含1%慶大霉素的胰蛋白磷酸鹽肉湯(TPB),購(gòu)自Sigma公司;1-5TM2×High Fidelity master Mix購(gòu)自MCLAB公司;DNA膠回收試劑盒購(gòu)自ThermoFisher公司,平末端載體pClone007 試劑盒購(gòu)自擎科生物科技有限公司;DNA提取試劑盒購(gòu)自Qiagen公司;舒泰購(gòu)自法國(guó)維克有限公司;SPF雞胚購(gòu)自濟(jì)南斯帕法斯家禽有限公司;56和28日齡SPF雞購(gòu)自濟(jì)南賽斯家禽科技有限公司。

PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。

表1 PCR擴(kuò)增使用的引物名稱(chēng)和序列

1.2 病毒的繁殖與EID50測(cè)定

ILTV臨床分離株WF03株由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所保存。該病毒株分離自免疫了ILTV細(xì)胞源弱毒活疫苗的黃羽肉雞群,雞群在40～50日齡出現(xiàn)了以咳血和死亡為特征的疑似ILT,發(fā)病率較高,部分雞出現(xiàn)死亡。采用有限稀釋法純化病毒,將保存的ILTV病毒液以TPB連續(xù)10倍稀釋,取10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀釋度采用雞胚尿囊膜(CAM)方式接種10日齡SPF雞胚,每個(gè)稀釋度接種6枚,接種量為0.2 mL·胚-1,棄去24 h內(nèi)死亡雞胚,繼續(xù)孵化7 d,每日檢查雞胚存活情況,7 d后對(duì)存活雞胚檢查尿囊膜,死亡雞胚和尿囊膜出現(xiàn)灰白色斑的雞胚判定為陽(yáng)性。取最高稀釋度的陽(yáng)性尿囊膜以1∶5的比例加入預(yù)冷的PBS進(jìn)行研磨,反復(fù)凍融3次,12 000 r·min-1,4 ℃離心10 min,取上清病毒液采用同樣方式繼續(xù)純化2次。將純化第3次收獲的陽(yáng)性病毒液命名為WF03株P(guān)0代。采用CAM方式接種10日齡SPF雞胚7 d后收獲尿囊膜并按照上述方法制備病毒液,記為P1代;依次傳代制備不同代次的病毒液,分別記為P2代、P3代等。

將待測(cè)EID50的病毒液以TPB連續(xù)稀釋成10-3.6、10-4.2、10-4.8、10-5.4和10-6.05個(gè)稀釋度,從高稀釋度到低稀釋度經(jīng)CAM接種病毒液,每個(gè)稀釋度接種6枚胚,每胚接種0.2 mL,置37 ℃繼續(xù)孵化7 d,每天檢查雞胚存活情況并作記錄。同時(shí)取6個(gè)SPF雞胚以同樣方式接種TPB作為陰性對(duì)照。棄去接種后24 h內(nèi)的死亡雞胚,每個(gè)稀釋度應(yīng)至少有4個(gè)雞胚存活,陰性對(duì)照雞胚在接種后第2～7天不應(yīng)該有死亡出現(xiàn),試驗(yàn)才有效。接種24 h后死亡的雞胚判定感染陽(yáng)性,接種第7天后對(duì)所有存活雞胚進(jìn)行檢查,當(dāng)雞胚尿囊膜有明顯增厚出現(xiàn)白色病斑,判為感染陽(yáng)性。采用Reed-Muench法計(jì)算雞胚半數(shù)感染量EID50,重復(fù)測(cè)定3次,至少2次測(cè)定試驗(yàn)成立,結(jié)果才有效。

1.3 ILTV主要基因的擴(kuò)增與測(cè)序

將300 mL ILTV P5代病毒液以45 000 r·min-1,4 ℃離心4.5 h,棄去上清后將沉淀物使用DNA提取試劑盒按照說(shuō)明書(shū)提取基因組DNA后,采用表1中的引物分別對(duì)免疫原性基因gB、UL32、gD、gC和參與毒力形成的基因TK、ICP4、gG、gE、gI、gH、gL、gK、gM、gN進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系:1-5TM2×High Fidelity master Mix 25 μL,上、下游引物各1 μL,DNA模板2 μL,ddH2O 21 μL;反應(yīng)條件:98 ℃ 2 min;98 ℃ 10 s,56 ℃ 15 s,72 ℃30 s,共30個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min。擴(kuò)增結(jié)束后,將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳,將目的條帶切膠并利用DNA膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。

將回收到的PCR產(chǎn)物連接到平末端載體pClone007中轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α后涂布含氨芐抗生素的平板,每個(gè)基因均篩選5個(gè)克隆子(菌液)送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4 關(guān)鍵抗原基因和毒力基因遺傳進(jìn)化分析

從NCBI下載ILTV國(guó)內(nèi)外主要分離株和疫苗株的基因組序列(表2),使用DNAStar軟件和Geneious軟件對(duì)參考毒株和分離毒株的免疫原性基因gB、UL32、gD、gC和毒力相關(guān)基因TK、ICP4、gG、gE、gI、gH、gL、gK、gM、gN進(jìn)行分析和串聯(lián)拼接,對(duì)拼接后的序列采用MEGA7軟件中的ClastalW算法對(duì)所有序列進(jìn)行多重序列比對(duì)后,以鄰接(neighbor-Joining,NJ)法中重復(fù)數(shù)1 000計(jì)算bootstrap值構(gòu)建免疫原性基因gB-gC-gD-UL32和毒力相關(guān)基因gE-gI-TK-ICP4-gG-gH-gK-gL-gM-gN的進(jìn)化樹(shù)。

表2 ILTV參考毒株信息

1.5 病毒對(duì)SPF雞的致病力分析

將測(cè)定過(guò)EID50的WF03 株P(guān)5代病毒液用TBP稀釋后以氣管攻毒途徑對(duì)SPF雞進(jìn)行感染。選取90羽28日齡SPF雞隨機(jī)分為5組,其中第1～4組(每組20羽)以氣管內(nèi)注射途徑分別以104.5、104.0、103.5和103.0EID50·羽-1的劑量接種WF03株0.2 mL;第5組(10羽)經(jīng)氣管內(nèi)注射途徑接種0.2 mL的TPB稀釋液,作為陰性對(duì)照。另取8周齡SPF雞,共分為2組,每組11只雞,其中1組用WF03株以104.0EID50·只-1的劑量進(jìn)行氣管內(nèi)注射0.2 mL,另一組以TBP稀釋液為空白對(duì)照組。

攻毒后,每日對(duì)所有雞進(jìn)行觀察兩次,共觀察14 d,每天記錄每羽雞的發(fā)病情況,包括死亡、咳血、呼吸癥狀、眼部癥狀和精神狀態(tài)等。死亡雞隨時(shí)解剖,未死亡雞在試驗(yàn)結(jié)束后采用舒泰過(guò)量麻醉致死后統(tǒng)一剖檢,重點(diǎn)觀察喉頭、氣管等病理變化,包括氣管內(nèi)有無(wú)血塊、黃色酪狀物栓塞。

2 結(jié) 果

2.1 ILTV 繁殖特性

ILTV WF03株通過(guò)CAM途徑采用有限稀釋法接種10日齡SPF雞胚,在接種雞胚7 d后,幸存胚的尿囊膜出現(xiàn)大量灰白色病灶或尿囊膜出現(xiàn)大量的灰白色痘斑(圖1)。測(cè)定純化后病毒的EID50,其P1、P2、P3和P5代的病毒含量分別為105.4、105.8、105.5和105.89EID50·mL-1。

ILTV接種雞胚7 d后尿囊膜顯示灰白色痘斑(右),左側(cè)為正常尿囊膜對(duì)照

2.2 ILTV關(guān)鍵抗原基因和毒力基因的遺傳進(jìn)化分析

對(duì)串聯(lián)的免疫原性基因gB-gC-gD-UL32的遺傳進(jìn)化分析顯示:WF03株與中國(guó)2009年的分離株LJS09株、2012年的分離株ck/CH/LHLJ/120305株、疫苗株K317和Nobilis Laringovac(R)處在一個(gè)大的進(jìn)化分支上,并且與疫苗株P(guān)oulvac ILT(R)、Laryngo Vac和LT Blen處在同一個(gè)分支上且親緣關(guān)系最近(圖2)。通過(guò)對(duì)WF03株與參考毒株的基因序列比對(duì)顯示:gB基因與參考毒株的相似性為99.67%～99.93%,gC基因與參考毒株的相似性為99.75%～100.00%,gD基因與參考毒株的相似性為99.14%～100.00%,UL32基因與參考毒株的相似性為99.90%～100.00%。

△.疫苗株;▲.本研究分離株

對(duì)串聯(lián)的毒力相關(guān)基因gE-gI-TK-ICP4-gG-gH-gK-gL-gM-gN的遺傳進(jìn)化分析顯示:WF03株與野毒株進(jìn)化關(guān)系表現(xiàn)為與韓國(guó)2010年分離的40798/10/Ko毒株親緣關(guān)系最近,其次與我國(guó)2012年分離株ck/CH/LHLJ/120305、2009年分離株LJS09或澳大利亞2016年分離株7b株的親緣關(guān)系較近;WF03株與疫苗株的進(jìn)化關(guān)系表現(xiàn)為與LT Blen株的親緣關(guān)系最近,與K317和Nobilis Laringovac(R)的親緣關(guān)系次之(圖3)。通過(guò)WF03株與參考毒株的基因序列比對(duì)顯示:gE基因與參考毒株的相似性為99.47%～100.00%,gI基因與參考毒株的相似性為99.05%～100.00%,TK基因與參考毒株的相似性為99.68%～100.00%,ICP4基因與參考毒株的相似性為98.71%～99.96%,gG基因與參考毒株的相似性為98.73%～100.00%,gH基因與參考毒株的相似性為99.58%～100.00%,gK基因與參考毒株的相似性為99.59%～100.00%,gL基因與參考毒株的相似性為99.84%～100.00%,gM基因與參考毒株的相似性為99.77%～100.00%,gN基因與參考毒株的相似性為99.28%～100.00%。

2.3 ILTV對(duì)SFP雞的致病力

WF03株以104.5、104.0、103.5和103.0EID50·羽-1的劑量感染28日齡SPF雞后發(fā)病率分別為100%(20/20)、100%(20/20)、95%(19/20)和85%(17/20),死亡率分別為45%(9/20)、30%(6/20)、35%(7/20)和10%(2/20),陰性對(duì)照組未發(fā)生特異性臨床癥狀。在WF03株攻毒后2 d開(kāi)始陸續(xù)出現(xiàn)臨床癥狀,持續(xù)期均超過(guò)2 d并且食欲廢絕,相繼出現(xiàn)精神沉郁、咳血、呼吸困難、張口呼吸等典型的ILT發(fā)病癥狀。對(duì)死亡雞解剖后發(fā)現(xiàn)氣管中有大量血液或血凝塊。其余存活雞從攻毒后第7天開(kāi)始臨床癥狀逐步消失。結(jié)果表明WF03株可以導(dǎo)致28日齡SPF雞出現(xiàn)較高的發(fā)病率和死亡率。

WF03株感染56日齡SPF雞后2 d開(kāi)始陸續(xù)出現(xiàn)臨床癥狀,持續(xù)期均超過(guò)3 d并且食欲廢絕,第5天時(shí)死亡3只,以中度至重度氣喘(11/11)(圖4)、咳血(7/11)(圖4)、中度至重度呼吸困難(7/11)為主要臨床癥狀。對(duì)第5天死亡雞解剖發(fā)現(xiàn)氣管中有大量血液或血凝塊(圖5),其余存活雞到攻毒后9日臨床癥狀消失。結(jié)果表明WF03株可以導(dǎo)致56日齡SPF雞100%(11/11)的發(fā)病率和27.3%(3/11)的死亡率。因此結(jié)果表明WF03株對(duì)于SPF雞的具有較強(qiáng)的致病力,其以不同劑量感染均可以使80%的雞發(fā)病。

3 討 論

在我國(guó),雞胚源(chicken embryo origin,CEO) 和組織細(xì)胞源(tissue culture origin,TCO) 2種弱毒活疫苗已批準(zhǔn)用于ILT預(yù)防和控制,但在近幾年仍有養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生ILTV感染的報(bào)道,尤其在肉雞中也發(fā)現(xiàn)了ILTV感染的病例[1-4]。糖蛋白gB、gD和gC以及UL32蛋白是ILTV重要的保護(hù)性抗原,可以誘導(dǎo)中和抗體和細(xì)胞免疫反應(yīng),并且還可以增強(qiáng)先天性和特異性免疫反應(yīng)[5,10-11,16],此外糖蛋白gB和gD還參與病毒黏附、膜融合和穿入的過(guò)程[6-9],而糖蛋白gC雖不是病毒復(fù)制必需基因,但缺失gC可以使ILTV對(duì)雞的致病力減弱[16],因此gB、gC和gD在ILTV致病力的形成中同樣發(fā)揮著重要作用。本研究通過(guò)對(duì)ILTV WF03分離株的免疫原性基因gB-gC-gD-UL32的遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)WF03分離株與我國(guó)早期ILTV分離株的親緣關(guān)系較近,其主要抗原基因與現(xiàn)有主要疫苗毒株K317、Poulvac ILT(R)、Laryngo Vac和LT Blen的親緣關(guān)系均較近,提示現(xiàn)有疫苗能夠?qū)δ壳暗腎LTV分離株提供有效保護(hù),然而在免疫雞群中仍然具有ILT的散發(fā)病例。目前預(yù)防ILTV感染的疫苗不僅有CEO和TCO兩種弱毒活疫苗,基因工程載體疫苗也已經(jīng)商品化,由于不同疫苗制備工藝不同,且ILTV臨床分離株的毒力強(qiáng)弱差異較大,因此選用何種疫苗免疫,應(yīng)該在使用前進(jìn)行有效性評(píng)估。

在皰疹病毒(包括ILTV)中,糖蛋白gE、gI和gG以及TK基因缺失可以使病毒毒力顯著減弱,并且使病毒保持良好的免疫原性[12-14,17]。ICP4基因參與激活病毒早/晚期基因的表達(dá),與病毒毒力存在關(guān)聯(lián)[15]。此外還有報(bào)道糖蛋白gH、gL、gK、gM、gN等也參與了皰疹病毒致病性的形成[18-21]。而在本研究中通過(guò)28和56日齡SPF雞的感染試驗(yàn)結(jié)果表明以104.0EID50的劑量攻毒后表現(xiàn)出嚴(yán)重的咳血和死亡,WF03株屬于強(qiáng)致病力毒株,但通過(guò)對(duì)毒力相關(guān)基因gE-gI-TK-ICP4-gG-gH-gK-gL-gM-gN的進(jìn)化樹(shù)分析,其親緣關(guān)系與韓國(guó)2010年分離的40798/10/Ko毒株親緣關(guān)系最近,其次分別與我國(guó)2012年分離株ck/CH/LHLJ/120305、2009年分離株LJS09和澳大利亞2016年分離株7b株的親緣關(guān)系較近,并且與疫苗株中的LT Blen和K317株的親緣關(guān)系同樣較近。有報(bào)道根據(jù)TK、ICP4、gB和UL32基因核苷酸序列分析結(jié)果,近年新分離的ILTV BT株與我國(guó)早期LJS09毒株等屬于同一進(jìn)化分支,未出現(xiàn)較大變異,但以104.0EID50的劑量氣管內(nèi)攻毒2周齡SPF雞未出現(xiàn)死亡,僅有少部分雞出現(xiàn)結(jié)膜分泌物,剖檢顯示喉頭氣管正常[22],但早期毒株LJS09株對(duì)4周齡雞以102EID50攻毒,急性癥狀出現(xiàn)在感染后4～6 d,表現(xiàn)為呼吸困難,并且發(fā)病率和死亡率分別為80%和10%[23],因此本試驗(yàn)ILTV WF03株感染28日齡和56日齡SPF雞后的發(fā)病時(shí)間、比例、癥狀與其他ILTV強(qiáng)致病力毒株感染情況基本一致。因此本研究通過(guò)對(duì)ILTV主要基因的遺傳特征分析表明目前ILTV臨床分離株與我國(guó)早期的分離株在毒力基因的遺傳關(guān)系上無(wú)顯著的差異,ILTV未發(fā)生較大的遺傳變異現(xiàn)象,但分離株的致病力具有較大差異,在臨床上可能呈現(xiàn)出溫和型和急性型ILTV共存的局面,目前現(xiàn)有疫苗可能仍對(duì)當(dāng)前ILTV強(qiáng)致病力毒株的流行具有保護(hù)作用。

此外,目前由于ILTV疫苗免疫效力評(píng)估尚沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)株使用,不同生物制品廠使用不同ILTV強(qiáng)毒株對(duì)疫苗進(jìn)行效力檢驗(yàn)。然而,ILTV野毒株的毒力差異很大,有的毒株具有很高的發(fā)病率和致死率屬于強(qiáng)致病力毒株,而有的毒株感染后僅表現(xiàn)出結(jié)膜炎等輕微癥狀或癥狀不明顯,對(duì)于篩選一株遺傳穩(wěn)定、發(fā)病可靠、臨床癥狀易于觀察的強(qiáng)毒株進(jìn)行ILTV疫苗的效力檢驗(yàn)是非常有必要的,也是非常重要的。WF03株以104.5、104.0、103.5和103.0EID50·羽-1的劑量感染28日齡SPF雞后至少有80%的雞發(fā)病,且以咳血、死亡為主要臨床癥狀,對(duì)56日齡SPF雞以104.0EID50·羽-1的劑量攻毒后,100%的雞發(fā)病,主要以氣喘、呼吸困難和咳血為主要臨床癥狀。因此WF03株可作為疫苗效力檢驗(yàn)用強(qiáng)毒株,其發(fā)病穩(wěn)定,臨床癥狀易于觀察。

4 結(jié) 論

本研究通過(guò)28和56日齡SPF雞的人工感染試驗(yàn)結(jié)果表明ILTV WF03分離株具有很強(qiáng)的致病力,對(duì)28和56日齡雞的致死性也較強(qiáng),但通過(guò)免疫原性基因gB-gC-gD-UL32和毒力相關(guān)基因gE-gI-TK-ICP4-gG-gH-gK-gL-gM-gN的遺傳進(jìn)化分析以及與參考毒株的基因序列相似性比較表明WF03株未發(fā)生明顯的遺傳變異,與我國(guó)早期的ILTV分離株和目前市場(chǎng)上的疫苗株具有很近的親緣關(guān)系,因此WF03株可用于當(dāng)前使用以及尚在開(kāi)發(fā)的ILTV商品疫苗的效力檢驗(yàn)用強(qiáng)毒株。