基于RNA-Seq技術(shù)研究枸杞多糖對(duì)環(huán)磷酰胺致雛雞免疫抑制的拮抗機(jī)制

王建東,唐玉林,王 敏,張寶鎖,楊富強(qiáng),高?；?于 洋,郭延生*

(1.寧夏農(nóng)林科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所,銀川 750002;2.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院,銀川 750021;3.寧夏銀川市婦幼保健院,銀川 750001;4.寧夏順寶現(xiàn)代農(nóng)業(yè)股份有限公司,青銅峽 751600)

免疫抑制是免疫系統(tǒng)的一種暫時(shí)性或永久性紊亂,易由病毒、化學(xué)藥物、應(yīng)激等多種因素引起,其中病毒引起的免疫抑制在畜禽中非常普遍[1]。近年來,單一或混合感染性免疫抑制病毒,如馬立克氏病病毒(MDV)、網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞增多癥病毒(REV)、禽白血病病毒(ALV)、傳染性法氏囊病病毒(IBDV)、雞傳染性貧血病毒(CIAV)等廣泛存在于雞群中[2]。這些免疫抑制病毒往往會(huì)降低機(jī)體對(duì)疫苗免疫反應(yīng)的敏感性,增加雞群傳染病的發(fā)病率和死亡率,給養(yǎng)雞業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。當(dāng)前控制免疫抑制病和預(yù)防繼發(fā)性感染的方法主要還是通過長期的疫苗接種和高劑量的藥物治療,然而滅活疫苗不能產(chǎn)生足夠的抗體,高劑量的藥物治療也面臨著動(dòng)物產(chǎn)品中藥殘問題[4-5]。因此,尋找防治免疫抑制疾病的新方法迫在眉睫,而使用免疫增強(qiáng)劑來增強(qiáng)宿主的防御能力被認(rèn)為是最有前途的替代方法[6]。近年來,一些傳統(tǒng)中藥制劑被證明具有免疫增強(qiáng)的作用,而進(jìn)一步研究表明,其發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用與其所含的活性成分植物多糖有著密切聯(lián)系。多糖是由糖苷鍵連接的單糖聚合物,在植物中廣泛存在,并被廣泛用作免疫調(diào)節(jié)劑[7]。枸杞多糖(Lyciumbarbarumpolysaccharides,LBP)是從枸杞成熟果實(shí)中分離出的有效活性成分之一,主要由阿拉伯糖、甘露糖、木糖、鼠李糖、半乳糖和葡萄糖6種單糖組成[8],且以半乳糖為主鏈結(jié)構(gòu)組成[9]。據(jù)報(bào)道,LBP具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、增強(qiáng)免疫、生殖保護(hù)及神經(jīng)保護(hù)等作用[10-14]。Long等[15]研究發(fā)現(xiàn),在肉雞日糧中添加LBP能顯著提高肉雞生長性能,增強(qiáng)機(jī)體抗氧化應(yīng)激能力,并增加血清中IgG、IgA、IL-4、IL-6、TNF-α和IFN-γ水平。王思月[16]研究表明,LBP能夠顯著改善肉雞腸道菌群結(jié)構(gòu),提高血中IgA和IgG水平,并增加IL-2和IL-6基因的表達(dá)水平,從而達(dá)到增強(qiáng)免疫的作用,但目前關(guān)于枸杞多糖對(duì)雛雞免疫抑制調(diào)節(jié)的分子機(jī)制尚未見報(bào)道。

環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide,CY)是一種常被用于腫瘤化療的藥物,但其靶向性不強(qiáng),在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)會(huì)殺傷如淋巴細(xì)胞在內(nèi)的大量免疫細(xì)胞,導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)免疫抑制等嚴(yán)重副作用,可用來構(gòu)建免疫抑制模型。因此,本試驗(yàn)采用RNA-Seq技術(shù)研究LBP對(duì)環(huán)磷酰胺所致免疫抑制雛雞脾組織基因的調(diào)節(jié)作用,旨在揭示LBP干預(yù)雛雞免疫抑制的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要?jiǎng)游锱c藥品

1日齡雛雞購自北京華都峪口禽業(yè)有限公司;枸杞多糖購自寧夏天仁枸杞生物科技股份有限公司;環(huán)磷酰胺購自大連美侖生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物分組與處理

將120羽1日齡海蘭褐蛋雞,適應(yīng)性飼養(yǎng)至7日齡后隨機(jī)分成3組,每組40羽,即空白組(NC組)、環(huán)磷酰胺組(CY組)及枸杞多糖組(CYLbGp組),NC組連續(xù)3 d肌注生理鹽水,其余2組連續(xù)3 d每日肌注80 mg·kg-1環(huán)磷酰胺進(jìn)行造模,造模后CYLbGp組通過飲水的方式每日給予5 mg·kg-1枸杞多糖,連續(xù)30 d。在CYLbGp組給藥結(jié)束后第1天,每組隨機(jī)選取6只雞處死后取脾組織于凍存管中,-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.3 測序試驗(yàn)流程

使用TRIzol試劑(Invitrogen)從雛雞脾組織樣品中提取總RNA,隨后利用Nanodrop2000、瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的濃度、純度及完整性,再使用Agilent 2100測定RNA完整值(RNA integrity number,RIN)。加入buffer后,利用帶有Oligo(dT)磁珠分離出300 bp左右mRNA的小片段,加入隨機(jī)引物合成一鏈cDNA,隨后進(jìn)行二鏈合成。將得到的雙鏈cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增(15個(gè)cycles),最后在cBot系統(tǒng)上進(jìn)行橋式PCR擴(kuò)增,完成整個(gè)文庫的制備工作。將構(gòu)建好的文庫用Illumina NovaSeq6000平臺(tái)進(jìn)行測序(PE文庫,讀長2×150 bp)。

1.4 RNA-Seq質(zhì)量評(píng)估和序列比對(duì)

對(duì)原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾,得到高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)(Clean data)。使用SeqPrep、Sickle等在線平臺(tái)修剪、剔除測序數(shù)據(jù)中的問題片段,再對(duì)過濾所得到的高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估,計(jì)算Q20、Q30(Q20、Q30分別指測序質(zhì)量在99%和99.9%以上的堿基占總堿基的百分比)和GC含量,同時(shí)選擇對(duì)應(yīng)的測序堿基平均錯(cuò)誤率(Error rate)小于0.1%的用于后續(xù)的轉(zhuǎn)錄組分析。將得到的高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)與參考基因組進(jìn)行比對(duì),獲得用于后續(xù)分析的比對(duì)率(Mapped data),同時(shí)對(duì)本次測序的比對(duì)結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估,并使用TopHat2軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析。

1.5 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

獲得基因的Read Counts數(shù)后,使用RSEM軟件對(duì)其進(jìn)行TPM(Transcripts per million)轉(zhuǎn)換,進(jìn)而得到標(biāo)準(zhǔn)化的基因表達(dá)水平。利用軟件DESeq2篩選出各組樣本間差異表達(dá)基因(|log2(Fold change)|≥0,P-adjust<0.05)。利用Blast2go 2.5對(duì)基因集進(jìn)行GO注釋分析,采用軟件Goatools對(duì)基因集內(nèi)的基因進(jìn)行GO富集分析,使用KOBAS對(duì)基因集內(nèi)的基因進(jìn)行KEGG通路富集分析,篩選差異表達(dá)基因顯著富集的途徑。

1.6 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析

使用String 11.5(http:∥string-db.org/)平臺(tái)構(gòu)建枸杞多糖回調(diào)差異基因的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析圖(PPI),選擇多種蛋白模式(Multiple proteins),將所篩選的差異基因名導(dǎo)入模塊(List Of Names),從物種類別里選擇雞(Gallusgallus)進(jìn)行搜索,將所得圖片數(shù)據(jù)下載后導(dǎo)入Cytoscape3.8.2軟件進(jìn)行調(diào)整,使用Analysis Network進(jìn)行分析獲得Degree值,根據(jù)Degree值的大小進(jìn)行相關(guān)基因節(jié)點(diǎn)的繪制,進(jìn)一步挖掘枸杞多糖在拮抗免疫抑制網(wǎng)絡(luò)中的重要基因。

1.7 RT-qPCR驗(yàn)證

從差異表達(dá)基因中隨機(jī)挑選5個(gè)差異基因CD83、CCL4、PSPH、LPIN2和ULK2,以β-actin為內(nèi)參基因,采用RT-qPCR法驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的準(zhǔn)確性。所用引物經(jīng)上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司合成,見表1。RT-qPCR反應(yīng)體系為20 μL,2×ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix 10 μL,上、下游引物各0.8 μL,50×ROX Reference Dye 1 0.4 μL,cDNA 2 μL,ddH2O 6 μL。反應(yīng)條件為:95 ℃變性5 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸40 s,40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCT法測定與對(duì)照組相比試驗(yàn)各組基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 RT-qPCR引物序列

2 結(jié) 果

2.1 免疫抑制雛雞模型判斷

CY組和CYLbGp組雛雞在肌注3 d環(huán)磷酰胺后,外觀明顯可見精神狀態(tài)萎靡不振、喜臥、閉目呆立、羽毛凌亂、少食,出現(xiàn)體重減輕,表明免疫抑制雛雞模型建立成功。前期研究中也發(fā)現(xiàn),環(huán)磷酰胺所致免疫抑制雛雞可出現(xiàn)脾臟指數(shù)、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率顯著降低,脾組織結(jié)構(gòu)較正常組生發(fā)中心減少[17-18]。

2.2 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估與序列比對(duì)

3個(gè)試驗(yàn)組的脾組織樣本轉(zhuǎn)錄組測序后數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估和序列比對(duì)詳細(xì)結(jié)果見表2。結(jié)果顯示,對(duì)各組樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序后,NC組、CY組和CYLbGp組分別共獲得363 058 878、330 263 170和355 979 838條原始測序數(shù)據(jù)條目數(shù),對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控、過濾后分別共獲得了357 135 798、324 728 438和350 233 042個(gè)測序條目數(shù)。測序所得數(shù)據(jù)的各樣本Q20、Q30的最小含量分別為97.39%、93.05%(一般Q20在85%以上,Q30在80%以上被認(rèn)為測序質(zhì)量可靠),GC含量在50.16%～52.40%之間,且所有樣品的唯一比對(duì)率均達(dá)到83.76%以上。質(zhì)量評(píng)估結(jié)果表明,本次轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)質(zhì)量較高、結(jié)果可靠,可用于后續(xù)分析。

表2 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量處理與序列比對(duì)

2.3 轉(zhuǎn)錄組樣本關(guān)系分析

利用比對(duì)至基因組的結(jié)果以及基因組注釋文件,獲得每個(gè)樣本基因的Read Counts。然后使用RSEM對(duì)其進(jìn)行TPM轉(zhuǎn)換,進(jìn)而得到標(biāo)準(zhǔn)化的基因表達(dá)水平。依據(jù)得到的TPM數(shù)據(jù)進(jìn)行小提琴圖繪制,如圖1所示。

圖1 3組樣本基因表達(dá)量小提琴圖

PCA分析基于基因表達(dá)量對(duì)樣本進(jìn)行聚類,圖中樣本間的距離遠(yuǎn)近,表明樣本間相似性的高低,距離越近相似性越高。為了解各樣本間和組間差異基因的表達(dá)情況,采用DESeq軟件進(jìn)行PCA分析,見圖2。結(jié)果表明,3組雛雞脾樣本表達(dá)結(jié)果均處于95%置信區(qū)間內(nèi),表明各組組內(nèi)脾樣本基因表達(dá)情況相似,數(shù)據(jù)穩(wěn)定性好,樣本可信度高。CYLbGp組和NC組基因表達(dá)輪廓重合,表示兩組基因表達(dá)水平無明顯差異,而CY組較NC和CYLbGp兩組樣本的組間差異大,基因表達(dá)水平發(fā)生明顯改變,提示CY顯著改變了雛雞脾的基因表達(dá)情況,而LBP對(duì)CY刺激產(chǎn)生的影響有明顯改善作用。

圖2 3組樣本間PCA得分圖

2.4 差異表達(dá)基因篩選

NC和CY組、CY和CYLbGp組之間以P-adjust<0.05和|log2FC|≥0為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)基因,結(jié)果見圖3。如圖所示,與NC組相比,CY組篩選出差異表達(dá)基因有408個(gè),其中上調(diào)193個(gè),下調(diào)215個(gè)。與CY組相比,CYLbGp組共篩選出差異表達(dá)基因896個(gè),其中上調(diào)了408個(gè),下調(diào)488個(gè)。為明確LBP拮抗CY免疫抑制作用的主要靶基因,篩選CY組較NC組上調(diào)的差異表達(dá)基因與CYLbGp組較CY組下調(diào)差異表達(dá)基因的交集,得到108個(gè)差異表達(dá)基因;將CY組較NC組下調(diào)的差異表達(dá)基因與CYLbGp組較CY組上調(diào)差異表達(dá)基因的交集,得到70個(gè)差異表達(dá)基因(圖4)。

圖3 差異表達(dá)基因火山圖

A.與NC組相比,CY組上調(diào)的差異表達(dá)基因數(shù)目,以及與CY組相比,CYLbGp組下調(diào)的基因數(shù)目;B.與NC組相比,CY組下調(diào)的差異表達(dá)基因數(shù)目,以及與CY組相比,CYLbGp組上調(diào)的基因數(shù)目

2.5 差異表達(dá)基因的GO功能注釋分析

對(duì)枸杞多糖干預(yù)后上、下調(diào)差異基因集進(jìn)行GO功能注釋分析,結(jié)果主要分為三個(gè)模塊:生物過程主要涉及到細(xì)胞過程、生物調(diào)節(jié)等,細(xì)胞成分主要涉及細(xì)胞部分、膜部分、膜、細(xì)胞器部分、細(xì)胞器等,分子功能主要涉及結(jié)合、催化活性等。結(jié)果如圖5、6所示。

cell part:細(xì)胞部分;membrane:膜;organelle:細(xì)胞器;organelle part:細(xì)胞器部分;membrane part:膜部分;protein-containing complex:蛋白復(fù)合體;synapse:突觸;cellular process:細(xì)胞過程;biological regulation:生物調(diào)節(jié);metabolic process:代謝過程;response to stimulus:對(duì)刺激的反應(yīng);localization:本地化;developmental process:發(fā)展過程;cellular component organization or biogenesis:細(xì)胞組成組織或生物發(fā)生;multicellular organismal process:多細(xì)胞生物過程;multi-organism process:多組織過程;binding:結(jié)合;catalytic activity:催化活性;molecular transducer activity:分子換能器活性;transcription regulator activity:轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子活性

2.6 差異表達(dá)基因的GO功能富集分析

為研究枸杞多糖干預(yù)免疫抑制雛雞后差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能,對(duì)給予枸杞多糖后發(fā)生顯著改變的差異基因進(jìn)行GO功能富集分析。其中在CY刺激后上調(diào),給予枸杞多糖干預(yù)后下調(diào)的108個(gè)基因顯著富集到6個(gè)屬于生物過程模塊的GO條目(P-adjust<0.05)上,如圖7所示,生物質(zhì)量調(diào)節(jié)、細(xì)胞對(duì)化學(xué)刺激的反應(yīng)、生物調(diào)節(jié)、多細(xì)胞生物過程的調(diào)節(jié)、穩(wěn)態(tài)過程、化學(xué)反應(yīng)。在CY刺激后下調(diào),給予枸杞多糖干預(yù)后上調(diào)的70個(gè)基因也顯著富集于23條GO BP條目上(Padjust<0.05),見圖8。其中許多條目與免疫調(diào)節(jié)相關(guān),包括免疫系統(tǒng)過程的正向調(diào)節(jié)、淋巴細(xì)胞活化、免疫系統(tǒng)過程、免疫系統(tǒng)過程的調(diào)節(jié)、白細(xì)胞活化、白細(xì)胞分化、白細(xì)胞-細(xì)胞黏附的調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程。

cell part:細(xì)胞部分;membrane:膜;organelle:細(xì)胞器;membrane part:膜部分;organelle part:細(xì)胞器部分;protein-containing complex:蛋白復(fù)合體;binding:結(jié)合;catalytic activity:催化活性;transcription regulator activity:轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子活性;transporter activity:運(yùn)輸活動(dòng);biological regulation:生物調(diào)節(jié);cellular process:細(xì)胞過程;localization:本地化;metabolic process:代謝過程;developmental process:發(fā)展過程;cellular component organization or biogenesis:細(xì)胞組成組織或生物發(fā)生;response to stimulus:對(duì)刺激的反應(yīng);immune system process:免疫系統(tǒng)過程;locomotion:運(yùn)動(dòng);multicellular organismal process:多細(xì)胞生物過程

response to chemical:對(duì)化學(xué)物質(zhì)的反應(yīng);homeostatic process:穩(wěn)態(tài)過程;regulation of multicellular organismal process:多細(xì)胞生物過程的調(diào)節(jié);biological regulation:生物調(diào)節(jié);cellular response to chemical stimulus:細(xì)胞對(duì)化學(xué)刺激的反應(yīng);regulation of biological quality:生物質(zhì)量調(diào)節(jié)

caicium ion transport:鈣離子遷移;cell activation:細(xì)胞活化;regulation of leukocyte cell-cell adhesion:白細(xì)胞-細(xì)胞黏附的調(diào)節(jié);regulation of cellular component movement:調(diào)節(jié)細(xì)胞成分的運(yùn)動(dòng);cell motility:細(xì)胞活性;regulation of cell-cell adhesiorr:細(xì)胞-細(xì)胞黏附的調(diào)節(jié);regulation of locomotion:運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié);leukocyte differentiation:白細(xì)胞分化;movemenf of cell or subcellular component:細(xì)胞或亞細(xì)胞成分的運(yùn)動(dòng);leukocyte activation:白細(xì)胞活化;intracelular signal transductior:細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)器;regulation of cell motility:細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié);regulation of immune system process:免疫系統(tǒng)過程的調(diào)節(jié);locomotion:運(yùn)動(dòng);regulation of cell migration:細(xì)胞遷移的調(diào)節(jié);immune system process:免疫系統(tǒng)過程;positive reguiation of locomotiorr:積極調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)能力;positive regulation of celluiar component movemet:細(xì)胞成分運(yùn)動(dòng)的正向調(diào)節(jié);positive regulation of cell motility:細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的正向調(diào)節(jié);metal ion transport:金屬離子運(yùn)輸;positive regulation of cell migratiorr:正向調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移;lymphocyte activation:淋巴細(xì)胞活化;positive regulation of immune system process:免疫系統(tǒng)過程的正向調(diào)節(jié)

2.7 差異表達(dá)基因的KEGG通路富集分析

對(duì)178個(gè)枸杞多糖干預(yù)后發(fā)生顯著回調(diào)的差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG通路富集分析。結(jié)果顯示,CY刺激后發(fā)生上調(diào),在給予枸杞多糖干預(yù)后發(fā)生下調(diào)的108個(gè)差異基因顯著富集通路有13條,主要涉及到線粒體自噬-動(dòng)物、mTOR信號(hào)通路和AMPK信號(hào)通路等與細(xì)胞自噬相關(guān)通路上(圖9)。在CY刺激后發(fā)生下調(diào),給予枸杞多糖干預(yù)后發(fā)生上調(diào)的70個(gè)差異基因顯著富集通路有79條,主要涉及到趨化因子信號(hào)通路、C型凝集素受體信號(hào)通路、B細(xì)胞受體信號(hào)通路、血小板活化、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、Th1和Th2細(xì)胞分化等免疫相關(guān)信號(hào)通路上(圖10)。去除掉未知基因后共有17個(gè)差異表達(dá)基因被富集到上述通路中(表3)。

Mitophagy-animal:線粒體自噬-動(dòng)物;cGMP-PKG signaling pathway:cGMP-PKG信號(hào)通路;Pathways in cancer:癌癥通路;Thyroid hormone signaling pathway:甲狀腺激素信號(hào)通路;Adipocytokine signaling pathway:脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路;Longevity regulating pathway-worm:壽命調(diào)節(jié)通路-蟲;PPAR signaling pathway:PPAR信號(hào)通路;mTOR signaling pathway:mTOR信號(hào)通路;Salivary secretion:唾液分泌;Fatty acid degradation:脂肪酸降解;Mineral absorption:礦物質(zhì)的吸收;AMPK signaling pathway:AMPK信號(hào)通路;Longevity regulating pathway-multiple species:長壽調(diào)節(jié)途徑-多物種

Chemokine signaling pathway:趨化因子信號(hào)通路;Ras signaling pathway:Ras信號(hào)通路;C-type lectin receptor signaling pathway:C型凝集素受體信號(hào)通路;Phosphatidylinositol signaling system:磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng);Spinocerebellar ataxia:脊髓小腦的共濟(jì)失調(diào);Non-small cell lung cancer:非小細(xì)胞肺癌;Platelet activation:血小板活化;Human immunodeficiency virus 1 infection:人類免疫缺陷病毒1型感染;cAMP signaling pathway:cAMP信號(hào)通路;Shigellosis:志賀菌病;Proteoglycans in cancer:蛋白質(zhì)多糖在癌癥中的作用;B cell receptor signaling pathway:B細(xì)胞受體信號(hào)通路;AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications:糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路;Natural killer cell mediated cytotoxicity:自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性;PD-L1 expression and PD-1 checkpoint pathway in cancer:PD-L1在癌癥中的表達(dá)和PD-1檢查點(diǎn)通路;Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection:卡波濟(jì)肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染;Cholinergic synapse:膽堿能突觸;Parathyroid hormone synthesis,secretion and action:甲狀旁腺激素的合成、分泌和作用;Th1 and Th2 cell differentiation:Th1和Th2細(xì)胞分化;Inflammatory mediator regulation of TRP channels TRP:通道的炎性介質(zhì)調(diào)節(jié)

表3 枸杞多糖干預(yù)免疫抑制雛雞KEGG篩選的通路及富集基因

2.8 差異表達(dá)基因PPI網(wǎng)絡(luò)分析

枸杞多糖干預(yù)后回調(diào)差異表達(dá)基因PPI網(wǎng)絡(luò)圖,如圖11所示。結(jié)果表明,PIK3CD、JAK3、GATA3、HIF1A、NKX2-5和INPPL1為其中的關(guān)鍵基因,除NKX2-5外均為上述篩選差異通路中的富集基因,可能作為枸杞多糖拮抗雛雞免疫抑制的藥效靶點(diǎn)。

圖11 枸杞多糖干預(yù)回調(diào)差異表達(dá)基因PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.9 RT-qPCR驗(yàn)證結(jié)果

RT-qPCR驗(yàn)證結(jié)果表明,CD83、CCL4在枸杞多糖干預(yù)后表現(xiàn)出上調(diào)的趨勢,PSPH、LPIN2、ULK2呈現(xiàn)為下調(diào)趨勢,并且與轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)變化趨勢基本一致(圖12),表明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的有較高的可靠性。

A.RNA-seq所檢測5個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)水平;B.qRT-PCR所檢測5個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)水平。*表示與NC組差異顯著(P<0.05),**表示與NC組差異極顯著(P<0.01);#表示與CY組差異顯著(P<0.05),##表示與CY組差異極顯著(P<0.01)

3 討 論

CY因其良好的免疫抑制效果,常被用于免疫抑制模型的建立。研究表明,CY通過抑制機(jī)體免疫器官的發(fā)育、降低免疫細(xì)胞數(shù)量和減少免疫相關(guān)細(xì)胞因子產(chǎn)生達(dá)到免疫抑制的效果,而LBP可通過調(diào)節(jié)各種免疫細(xì)胞活化、分化,及促進(jìn)免疫分子的分泌達(dá)到免疫增強(qiáng)的作用[19-20]。

3.1 枸杞多糖對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

本研究發(fā)現(xiàn),LBP干預(yù)后,下調(diào)的108個(gè)共表達(dá)基因最主要顯著富集在線粒體自噬信號(hào)通路上,下調(diào)的關(guān)鍵基因?yàn)槿毖跽T導(dǎo)因子-1a(HIF1A)。HIF-1a是一種PAS家族轉(zhuǎn)錄因子,可調(diào)節(jié)代謝對(duì)組織氧環(huán)境變化的適應(yīng)。在常氧條件下,HIF-1a被脯氨酰羥化酶迅速降解。在缺氧條件下,HIF-1a穩(wěn)定并與組成型表達(dá)的HIF-1b形成異二聚體,并與調(diào)節(jié)不同生物過程的基因中的缺氧反應(yīng)元件結(jié)合[21]。HIF1A在缺氧適應(yīng)性反應(yīng)中特異性表達(dá),可能參與脊髓損傷后繼發(fā)性缺血缺氧過程,并可能介導(dǎo)損傷性細(xì)胞凋亡[22]。在快速生長的腫瘤中,細(xì)胞通常會(huì)遇到缺氧應(yīng)激,從而導(dǎo)致HIF表達(dá)的誘導(dǎo),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[23]。研究表明,CY也可造成再生障礙性貧血,常被用于動(dòng)物貧血模型的建立[24],并使血清中HIF-1a表達(dá)水平升高[25]。本試驗(yàn)中CY組脾組織中HIF1A表達(dá)上升,提示CY可造成機(jī)體貧血引起HIF1A表達(dá)上調(diào),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,給予LBP干預(yù)后HIF1A表達(dá)水平顯著降低,表明LBP能夠改善脾免疫細(xì)胞凋亡情況,進(jìn)而緩解雛雞免疫抑制作用。

3.2 枸杞多糖對(duì)免疫功能的影響

轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn),許多差異表達(dá)基因與免疫反應(yīng)相關(guān),所涉及到的關(guān)鍵基因包括PIK3CD、GATA3和JAK3。PIK3CD是磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)家族的成員,是細(xì)胞代謝、增殖、分化和凋亡等細(xì)胞功能中的關(guān)鍵信號(hào)調(diào)控樞紐[26]。PIK3CD主要在白細(xì)胞中表達(dá),可能占B淋巴細(xì)胞中PI3K活性的60%,是B細(xì)胞發(fā)育和存活所必需的[27]。細(xì)胞中PIK3CD含量降低會(huì)阻止B細(xì)胞分化并減少循環(huán)中成熟B細(xì)胞的數(shù)量,這表明其在B細(xì)胞濾泡成熟和存活中不可或缺的作用[28]。本試驗(yàn)中,給予LBP后PIK3CD表達(dá)水平較CY組出現(xiàn)顯著上調(diào)。

T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子基因GATA3分別是Th1和Th2細(xì)胞的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,可促進(jìn)T細(xì)胞活化與分化,并且在多種炎癥反應(yīng)中具有重要作用[29]。JAK3是酪氨酸激酶家族的重要成員之一,在轉(zhuǎn)導(dǎo)來自IL-2、IL-4、IL-7、IL-9和IL-15受體的信號(hào)中起關(guān)鍵作用,對(duì)T細(xì)胞和B細(xì)胞的增殖分化以及在維持機(jī)體的免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[30]。本試驗(yàn)中,給予LBP后GATA3、JAK3表達(dá)水平較CY組出現(xiàn)顯著上調(diào)。

INPPL1(又稱SHIP2)是一種抑制性磷酸酶,對(duì)肌醇磷脂磷脂肌醇-3,4,5-三磷酸(PIP3)具有特異性[31]。SHIP通過水解PIP3作為免疫反應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)因子,而PIP3作為脂質(zhì)第二信使,對(duì)機(jī)體各免疫細(xì)胞的發(fā)育和功能起到調(diào)控作用[32]。本試驗(yàn)中,給予LBP后INPPL1表達(dá)水平較CY組出現(xiàn)顯著上調(diào)。

綜上可見,LBP具有緩解雛雞免疫抑制的作用。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法探究枸杞多糖拮抗雛雞免疫抑制的作用機(jī)制,與NC組/CY組鑒定出的差異表達(dá)基因比較,發(fā)現(xiàn)LBP回調(diào)的差異表達(dá)基因有178個(gè),其中上調(diào)基因70個(gè),下調(diào)基因108個(gè),顯著逆轉(zhuǎn)調(diào)節(jié)富集通路有92條。結(jié)果表明,LBP可通過調(diào)節(jié)線粒體自噬、趨化因子信號(hào)通路、C型凝集素受體信號(hào)通路、B細(xì)胞受體信號(hào)通路、血小板活化、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、Th1和Th2細(xì)胞分化等通路,起到抑制細(xì)胞凋亡,提高免疫功能的作用。