阿司匹林丁香酚酯顆粒劑有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)方法的建立與驗(yàn)證

王志霞,白莉霞,秦 哲,劉希望,楊亞軍,李世宏,葛聞博,李劍勇

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,蘭州 730050)

阿司匹林丁香酚酯(aspirin eugenol ester,AEE)由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所研究人員利用藥物結(jié)構(gòu)拼合原理,通過(guò)阿司匹林的羧基與丁香酚的羥基結(jié)合而成的一種新型藥用化合物[1-3]。作為一種嵌合的非甾體抗炎藥物[4],在保持前體藥物藥理活性的基礎(chǔ)上,克服了阿司匹林的消化道反應(yīng)及丁香酚不穩(wěn)定和刺激性等問(wèn)題[5-7],這使得AEE藥理活性增強(qiáng),藥物作用時(shí)間更加持久。AEE進(jìn)入體內(nèi)后迅速分解為水楊酸和丁香酚發(fā)揮藥理活性[8-10],具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、降血脂和預(yù)防抗血栓等作用[11-12],無(wú)生殖毒性和致突變等作用[13-14]。

畜禽養(yǎng)殖過(guò)程中,由于環(huán)境的復(fù)雜性,往往會(huì)出現(xiàn)多種因素引起的炎癥反應(yīng),引起畜禽的發(fā)熱和疼痛,導(dǎo)致機(jī)體采食量減少,生長(zhǎng)性能下降[15]。飼料添加劑在提高生產(chǎn)性能與畜禽產(chǎn)品品質(zhì)等方面具有顯著的作用,其中防治性飼料添加劑則能夠起預(yù)防和治療動(dòng)物疾病的作用[16]。AEE可降低炎性介質(zhì)PGE2及5-羥色胺的生成來(lái)發(fā)揮抗炎作用,亦可抑制炎癥中期炎性水腫以及慢性肉芽腫,具有很好的抗炎效果[17]。在此基礎(chǔ)上研發(fā)了一種用于治療畜禽炎癥的AEE顆粒劑,前期試驗(yàn)對(duì)其工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了研究。

任何影響獸藥純度的物質(zhì)均稱為雜質(zhì),獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的雜質(zhì)系指由其生產(chǎn)工藝和原輔料帶入的雜質(zhì),或在貯存過(guò)程中產(chǎn)生的雜質(zhì)。按其來(lái)源,雜質(zhì)可分為一般雜質(zhì)和特殊雜質(zhì),其中特殊雜質(zhì)是指在特定藥物的生產(chǎn)和貯藏過(guò)程引入的雜質(zhì),多指有關(guān)物質(zhì)[18]。AEE顆粒劑中的有關(guān)物質(zhì)主要來(lái)源于原料藥,通過(guò)分析,初步判定其為AEE結(jié)構(gòu)中的乙酰氧基發(fā)生水解后的產(chǎn)物與乙酰水楊酰氯發(fā)生酯化反應(yīng)形成的雜質(zhì)。有關(guān)物質(zhì)的研究在藥品研發(fā)過(guò)程中占有重要作用,貫穿整個(gè)藥品研究的始終,其是否能得到合理、有效的控制,直接關(guān)系到藥品的質(zhì)量可控性和安全性[19],所以規(guī)范地進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)的研究,并將其控制在一個(gè)安全、合理的限度范圍之內(nèi),將直接關(guān)系到藥品的質(zhì)量及安全性。為了更嚴(yán)格地控制顆粒劑的質(zhì)量,本研究采用超高效液相色譜法建立了AEE顆粒劑有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法,進(jìn)而對(duì)AEE顆粒劑中的有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

SQP型電子天平(北京賽多利斯天平有限公司);UPT-II-40 L優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)(上海優(yōu)普實(shí)業(yè)有限公司);Agilent LC1290高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫科技有限公司);電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海恒一科學(xué)儀器有限公司);全方位行星式球磨機(jī)(南京馳順科技發(fā)展有限公司);KQ-600DE數(shù)控超聲清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司);WD-A藥物穩(wěn)定性檢測(cè)儀(天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器有限公司)。

1.2 主要試劑

AEE原料藥(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所,含量100.1%,批號(hào):69119004);AEE對(duì)照品(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所,含量99.6%,批號(hào)20190701);雜質(zhì)A(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所自制,含量99.5%,批號(hào):20190701);丁香酚對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院,含量99.95%,批號(hào)20032206);阿司匹林對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院,含量99.8%,批號(hào)100113-201405);水楊酸對(duì)照品(北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司,含量99.5%,批號(hào)F1602021)。

AEE顆粒劑三批(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所,規(guī)格0.57 g·g-1,批號(hào)分別為20211210、20211214、20211220)。

磷酸(色譜純,SIGMA-ALORICH,批號(hào)STBG5058V);甲醇、乙腈(色譜純,賽默飛世爾科技有限公司)。

1.3 色譜條件

色譜柱:Phenomenex luna C18(150 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:流動(dòng)相A為0.5%磷酸,流動(dòng)相B為色譜乙腈;洗脫梯度見表1;柱溫:35 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng):279 nm;流速:1.0 mL·min-1;進(jìn)樣量:10 μL。

1.4 溶液的制備

1.4.1 對(duì)照品溶液 精密稱取AEE對(duì)照品約25 mg于25 mL容量瓶中,用乙腈溶解并定容至刻度,制成濃度為1 mg·mL-1的AEE對(duì)照品溶液。

1.4.2 供試品溶液 取AEE顆粒劑5 g,研磨均勻(過(guò)100目標(biāo)準(zhǔn)篩),精密稱取過(guò)篩的AEE粉末約43.8 mg(相當(dāng)于AEE 25 mg),置25 mL容量瓶中,加入10 mL乙腈,水浴超聲處理(40 kHz)20 min后定容至刻度,制成濃度為1 mg·mL-1的AEE供試品溶液。

1.4.3 陰性對(duì)照溶液 精密稱取AEE顆粒劑處方量輔料約43.8 mg于25 mL容量瓶中,加入10 mL乙腈,水浴超聲處理(40 kHz)20 min后定容至刻度,作為陰性對(duì)照溶液。

1.4.4 雜質(zhì)A對(duì)照品溶液 精密稱取雜質(zhì)A對(duì)照品約25 mg于25 mL容量瓶中,加乙腈溶解并定容至刻度,作為雜質(zhì)A對(duì)照品溶液。

1.4.5 1%的自身對(duì)照溶液 精密量取“1.4.2”中AEE供試品溶液100μL于10 mL容量瓶中,加乙腈稀釋至刻度,作為1%的自身對(duì)照溶液。

1.4.6 系統(tǒng)適用性溶液 精密稱取AEE對(duì)照品10 mg于25 mL容量瓶中,加入5 mL乙腈使其溶解,再精密量取濃度為500 μg·mL-1的雜質(zhì)A對(duì)照品溶液1 mL至容量瓶中,用乙腈定容至刻度,配制成主成分與雜質(zhì)A比例為200∶10的專屬性溶液,作為系統(tǒng)適用性溶液。

1.4.7 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液 分別精密稱取阿司匹林對(duì)照品、水楊酸對(duì)照品、丁香酚對(duì)照品、AEE對(duì)照品和雜質(zhì)A對(duì)照品各25 mg,置于對(duì)應(yīng)的25 mL容量瓶中,加乙腈溶解并定容至刻度,制備成濃度為1 mg·mL-1的對(duì)照品溶液;精密量取上述對(duì)照品溶液1 mL于10 mL容量瓶中,用乙腈定容至刻度,即得混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.5 專屬性試驗(yàn)

分別取空白流動(dòng)相和“1.4”中AEE對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液、混標(biāo)溶液及系統(tǒng)適用性溶液,按“1.3”中色譜條件進(jìn)樣檢測(cè),記錄色譜圖。

1.6 破壞性試驗(yàn)

按照《化學(xué)藥物雜質(zhì)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》進(jìn)行AEE顆粒劑的破壞性試驗(yàn)[20]。

1.6.1 酸破壞試驗(yàn) 稱取過(guò)篩的AEE顆粒劑粉末約43.8 mg(相當(dāng)于AEE 25 mg)于25 mL容量瓶中,加入10 mL乙腈,水浴超聲處理(40 kHz)20 min,加入1.0 mol·L-1的鹽酸溶液1 mL,搖勻,室溫放置1.0 h,再加入1.0 mol·L-1的氫氧化鈉溶液1 mL中和至pH顯中性,加乙腈定容至刻度,制成酸破壞試液,按“1.3”中色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)。

1.6.2 堿破壞試驗(yàn) 稱取過(guò)篩的AEE顆粒劑粉末約43.8 mg(相當(dāng)于AEE 25 mg)于25 mL容量瓶中,加入10 mL乙腈,水浴超聲處理(40 kHz)20 min,加入0.01 mol·L-1的氫氧化鈉溶液1.5 mL,搖勻,室溫放置0.5 h,再加入0.01 mol·L-1的鹽酸溶液1.5 mL中和至pH 顯中性,加乙腈定容至刻度,制成堿破壞試液,按“1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)。

1.6.3 高溫破壞試驗(yàn) 稱取過(guò)篩的AEE顆粒劑粉末500 mg于無(wú)色具塞三角玻璃瓶中,置于藥物穩(wěn)定性試驗(yàn)箱中,60 ℃放置5 d。稱取上述樣品約43.8 mg(相當(dāng)于AEE 25 mg)于25 mL容量瓶中,加入10 mL乙腈,水浴超聲處理(40 kHz)20 min,用乙腈定容至刻度,制成高溫破壞試液,按“1.3”中色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)。

1.6.4 強(qiáng)光破壞試驗(yàn) 稱取過(guò)篩的AEE顆粒劑粉末500 mg于無(wú)色具塞三角玻璃瓶中,置于藥物穩(wěn)定性試驗(yàn)箱中,溫度為25 ℃,光照強(qiáng)度為4 500 lx±500 lx,放置10 d。稱取上述樣品約43.8 mg(相當(dāng)于AEE 25 mg)于25 mL容量瓶中,加入10 mL乙腈,水浴超聲處理(40 kHz)20 min,用乙腈稀釋至刻度,制成強(qiáng)光破壞試液,按“1.3”中色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)。

1.6.5 氧化破壞試驗(yàn) 稱取過(guò)篩的AEE顆粒劑粉末約43.8 mg(相當(dāng)于AEE 25 mg)于25 mL容量瓶中,加入10 mL乙腈,水浴超聲處理(40 kHz)20 min,再加入30%的雙氧水2 mL,混勻,50 ℃水浴加熱6 h,用乙腈稀釋至刻度,制成氧化破壞試液,按“1.3”中色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)。

1.6.6 未破壞溶液 稱取過(guò)篩的AEE顆粒劑粉末約43.8 mg(相當(dāng)于AEE 25 mg)于25 mL容量瓶中,加入10 mL乙腈,水浴超聲處理(40 kHz)20 min,用乙腈稀釋至刻度,制成未破壞試液,按“1.3”中色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)。

物料守恒計(jì)算方法見表2。

表2 AEE顆粒劑物料守恒計(jì)算方法

1.7 線性關(guān)系

分別取不同體積的雜質(zhì)A對(duì)照品儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中,用乙腈稀釋成濃度為0.25、5、10、20、30、40、50、60 μg·mL-1的雜質(zhì)A對(duì)照品溶液。精密量取上述溶液各10 μL,按“1.3”中色譜條件進(jìn)樣,記錄色譜圖,以峰面積為縱坐標(biāo),以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),按最小二乘法進(jìn)行線性回歸,得到雜質(zhì)A的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.8 檢測(cè)限與定量限

取“1.4”中雜質(zhì)A對(duì)照品儲(chǔ)備液,用乙腈稀釋成濃度為1、0.5、0.25和0.125 μg·mL-1的溶液,按“1.3”中色譜條件進(jìn)樣,記錄色譜峰。以信噪比S/N為3時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度為檢測(cè)限(LOD),以信噪比S/N為10時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度為定量限(LOQ)。

1.9 重復(fù)性試驗(yàn)

按照“1.4.2”中方法,制備6份供試品溶液,按照“1.3”中色譜條件進(jìn)樣,計(jì)算雜質(zhì)A的含量及RSD值。

1.10 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“1.4.1”和“1.4.2”中AEE對(duì)照品溶液和供試品溶液,室溫放置2、4、6、8、10、12 h后按“1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè),計(jì)算雜質(zhì)A峰面積及保留時(shí)間的RSD值。

1.11 回收率試驗(yàn)

精密稱取AEE原料藥適量于10 mL容量瓶中,共9份,按處方量加入空白輔料,分別加入一定量的雜質(zhì)A對(duì)照品,按有關(guān)物質(zhì)限度的80%、100%、120%配制樣品,每個(gè)濃度各3份,加入適量乙腈超聲溶解20 min后,用乙腈定容至刻度,作為低、中、高3個(gè)濃度水平的供試品溶液,按“1.3”中色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算樣品中雜質(zhì)A的回收率及RSD值。

1.12 耐用性試驗(yàn)

按照《中國(guó)獸藥典》中《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則》[18]中耐用性試驗(yàn)指導(dǎo)原則進(jìn)行,考察不同流速、不同柱溫、不同流動(dòng)相比例以及不同色譜柱下儀器色譜行為的變化,計(jì)算雜質(zhì)A的含量和各條件下所得數(shù)據(jù)的RSD值。

1.13 有關(guān)物質(zhì)含量測(cè)定

取AEE顆粒劑樣品3份,按照“1.4”中方法制備AEE供試品溶液和1%的自身對(duì)照品溶液,按“1.3”中色譜條件進(jìn)樣檢測(cè),采用不加校正因子的主成分自身對(duì)照法計(jì)算雜質(zhì)A的含量。

2 結(jié) 果

2.1 專屬性試驗(yàn)

由圖1可知,AEE保留時(shí)間為12.9～13.0 min,雜質(zhì)A保留時(shí)間為17.5～17.6 min,雜質(zhì)A與AEE之間以及各分解產(chǎn)物之間分離度良好,空白輔料不干擾雜質(zhì)A的測(cè)定,該色譜條件可滿足有關(guān)物質(zhì)測(cè)定要求,表明本方法專屬性良好。

A.溶劑;B.空白輔料;C.混標(biāo)溶液;D.系統(tǒng)適應(yīng)性溶液;E.供試品溶液;1.阿司匹林;2.水楊酸;3.丁香酚;4.AEE;5.雜質(zhì)A

2.2 破壞性試驗(yàn)

由圖2可知,AEE顆粒劑在高溫、強(qiáng)光照射條件下基本沒(méi)有降解,含量穩(wěn)定。酸破壞條件下,AEE含量降低了5%,AEE發(fā)生輕度酸水解反應(yīng),生成AEE乙酰氨基水解后的產(chǎn)物。堿破壞條件下,AEE迅速水解,含量降低了12.08%,生成丁香酚和AEE乙酰氨基水解后的產(chǎn)物。氧化破壞條件下,AEE含量降低了6.77%,生成阿司匹林、水楊酸與丁香酚等。

A.未破壞溶液;B.酸破壞溶液;C.堿破壞溶液;D.高溫破壞溶液;E.強(qiáng)光破壞溶液;F.氧化破壞溶液

在各種破壞條件下,AEE主峰與分解產(chǎn)物以及雜質(zhì)峰均能良好分離,分離度均>1.5,不同破壞條件下物料守恒結(jié)果見表3,各種破壞條件下AEE顆粒劑破壞后物料守恒均>95%,回收率較高。表明產(chǎn)生的分解產(chǎn)物與雜質(zhì)A在選定的色譜條件下與主峰達(dá)到良好的分離,空白無(wú)干擾,說(shuō)明該方法專屬性良好。

表3 不同破壞條件下物料平衡結(jié)果

2.3 線性關(guān)系

雜質(zhì)A在0.25～60.0 μg·mL-1的濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好,線性回歸方程為y=3.105 3x-0.752 2,R2=0.999 2(n=8),標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示。

圖3 雜質(zhì)A測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 檢測(cè)限與定量限

試驗(yàn)結(jié)果表明,當(dāng)S/N為3時(shí),雜質(zhì)A的檢測(cè)限為0.25 μg·mL-1;當(dāng)S/N為10時(shí),雜質(zhì)A的定量限為0.5 μg·mL-1。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果見表4,測(cè)得6份AEE顆粒劑中,雜質(zhì)A的含量為0.18%±0.36%(n=6,RSD=2.02%),表明方法重復(fù)性良好。

表4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)AEE供試品溶液和對(duì)照品溶液取樣分析,雜質(zhì)A保留時(shí)間與峰面積RSD值均小于2.0%,且無(wú)其他雜質(zhì)產(chǎn)生,表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 回收率試驗(yàn)

試驗(yàn)結(jié)果表明,不同濃度下雜質(zhì)A的回收率為98.34%～100.15%,RSD為0.68%,滿足回收率限度85%～110%的要求,說(shuō)明該方法回收率好,準(zhǔn)確度高,結(jié)果見表5。

表5 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.8 耐用性試驗(yàn)

耐用性試驗(yàn)結(jié)果見表6,不同條件下,主峰與雜質(zhì)峰分離良好,雜質(zhì)A含量的RSD值小于3.33%,說(shuō)明流動(dòng)相比例、柱溫、流速及色譜柱發(fā)生微小變化時(shí)對(duì)有關(guān)物質(zhì)含量測(cè)定無(wú)顯著性影響,表明AEE顆粒劑有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法耐用性良好。

表6 耐用性試驗(yàn)結(jié)果

2.9 樣品測(cè)定

采用上述超高效液相色譜方法對(duì)3批樣品的有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定,雜質(zhì)A的含量均為0.18%,低于0.5%,總雜質(zhì)含量小于1.0%。

3 討 論

3.1 有關(guān)物質(zhì)方法學(xué)建立

本研究利用紫外分光光度計(jì)對(duì)AEE及雜質(zhì)A進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描,二者在279 nm處均有最大吸收峰,這與本團(tuán)隊(duì)關(guān)于AEE咀嚼片有關(guān)物質(zhì)測(cè)定中采用的檢測(cè)波長(zhǎng)相一致,AEE咀嚼片中利用水∶乙腈∶冰乙酸∶四氫呋喃(70∶20∶5∶5)與乙腈做流動(dòng)相,測(cè)定咀嚼片中AEE的有關(guān)物質(zhì)[21],該流動(dòng)相配比復(fù)雜,在此基礎(chǔ)上對(duì)AEE有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)方法進(jìn)行改進(jìn),最后選擇0.5%磷酸溶液與乙腈作為流動(dòng)相,采用梯度洗脫的方式進(jìn)行測(cè)定,該方法操作簡(jiǎn)單,能很好分離AEE、雜質(zhì)A及各種分解產(chǎn)物,不同吸收峰分離度均大于1.5,峰形及對(duì)稱因子均可滿足要求。

3.2 有關(guān)物質(zhì)來(lái)源分析

通常藥物制劑在制備過(guò)程中產(chǎn)生的雜質(zhì)情況比較復(fù)雜,通過(guò)強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高溫、氧化及光照等破壞試驗(yàn)考察藥物在不同極端環(huán)境中產(chǎn)生的降解產(chǎn)物并進(jìn)行分析,該環(huán)境下產(chǎn)生的降解產(chǎn)物與樣品長(zhǎng)期放置的降解情況相似,考察此情況下的雜質(zhì)更具有實(shí)際意義[22]。在強(qiáng)制降解反應(yīng)中,破壞試驗(yàn)的程度暫無(wú)統(tǒng)一要求,一般以強(qiáng)力破壞后主成分的含量仍占絕大部分為宜,一般5%～20%的降解較為合適[23],AEE顆粒劑的破壞試驗(yàn)中,破壞后主成分的含量均大于88%,符合有關(guān)物質(zhì)專屬性試驗(yàn)檢測(cè)要求。AEE顆粒劑較為穩(wěn)定,對(duì)高溫和光照環(huán)境均不敏感,其有關(guān)物質(zhì)的產(chǎn)生主要與AEE的氧化、酸及堿破壞有關(guān),這與本團(tuán)隊(duì)前期的研究結(jié)果相一致[21],說(shuō)明其主要雜質(zhì)來(lái)源是藥物的氧化、酸及堿破壞,因此在制劑生產(chǎn)中需要注意環(huán)境條件從而避免雜質(zhì)超標(biāo)或新雜質(zhì)的產(chǎn)生。在AEE原料藥中也檢測(cè)到該雜質(zhì),系原料藥合成過(guò)程中產(chǎn)生的工藝雜質(zhì),經(jīng)色譜分析發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)A在原料藥和顆粒劑中保留時(shí)間一致,說(shuō)明該雜質(zhì)來(lái)源于原料藥,因此在原料藥生產(chǎn)以及制劑工藝中需要將雜質(zhì)A的含量進(jìn)行重點(diǎn)控制。

3.3 有關(guān)物質(zhì)限度確定

經(jīng)檢測(cè)3批樣品中雜質(zhì)A的含量均為0.18%,未知雜質(zhì)的總量為0.12%、0.11%、0.11%。本團(tuán)隊(duì)前期建立了UPLC檢測(cè)AEE有關(guān)物質(zhì)的方法,李劍勇等[2]制定了AEE原料藥有關(guān)物質(zhì)檢查限度,雜質(zhì)H19003(阿司匹林)和雜質(zhì)H19004(丁香酚)的峰面積不得大于對(duì)照溶液主峰面積的0.2%,雜質(zhì)A峰面積不得大于對(duì)照溶液主峰面積的0.5%,其他單個(gè)雜質(zhì)峰面積不得大于對(duì)照溶液主峰面積的0.2%,各雜質(zhì)峰面積的和不得大于對(duì)照溶液主峰面積的1.0%,供試品溶液色譜圖中任何小于對(duì)照溶液主峰面積0.1倍的色譜峰忽略不計(jì)。參考2012版《獸藥研究技術(shù)指導(dǎo)原則匯編》中“獸用化學(xué)藥物雜質(zhì)研究技術(shù)指導(dǎo)原則”[24],將顆粒劑的雜質(zhì)限度定為單個(gè)雜質(zhì)峰面積不得大于對(duì)照品溶液主峰面積的0.5%,各雜質(zhì)峰面積之和不得大于對(duì)照品主峰面積的1.0%,供試品溶液中任何小于對(duì)照溶液主峰面積0.05倍的峰可忽略不計(jì)。

4 結(jié) 論

本研究建立了UPLC法測(cè)定AEE顆粒劑中的有關(guān)物質(zhì),從前期制備的3批AEE顆粒劑小試放大樣品的測(cè)定結(jié)果和方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果可知,本方法專屬性強(qiáng),靈敏度高,適用性好,用時(shí)短,可用于AEE顆粒劑有關(guān)物質(zhì)的質(zhì)量控制,同時(shí)可為顆粒劑中試生產(chǎn)的雜質(zhì)控制提供技術(shù)依據(jù)。