黑果枸杞花青素對低氧誘導(dǎo)的H9c2大鼠心肌細胞凋亡的影響

沈 童,王夢杰,吳 華,李金銘,王 碩,武小慶,陳鑫磊,行倩文,劉 波

(青海大學,西寧 810016)

青海省特色野生植物黑果枸杞(LyciumruthenicumMurray)含有豐富的花青素(anthocyanidin),有“花青素之王”之稱,花青素別名花色苷,是水溶性類黃酮色素的重要亞類[1-3]。據(jù)報道,花青素有預(yù)防心血管疾病等生物功效[4-5]。近年來,對于花青素抗炎[6]、抗氧化能力得到多方面的證實[7-8]。

氧氣對于機體的正常有氧代謝至關(guān)重要,是維持穩(wěn)態(tài)的基礎(chǔ)[9]。居住在高海拔地區(qū)[10]、低氧血癥(低血氧含量和低血壓)、供氧受損和細胞攝氧/利用受損會使機體中氧含量和壓力低于正常水平,會使機體造成缺氧[11]。研究表明,缺氧能夠誘發(fā)一系列心血管疾病,導(dǎo)致心內(nèi)環(huán)境低氧引起心肌細胞凋亡對機體帶來的影響[12]。但目前,很少看到黑果枸杞花青素對H9c2大鼠心肌細胞凋亡影響的調(diào)控作用的報道,基于此,本研究通過探究黑果枸杞花青素對低氧誘導(dǎo)的H9c2大鼠心肌細胞凋亡影響,明確其對低氧誘導(dǎo)的H9c2大鼠心肌細胞的保護作用,為深入研究黑果枸杞花青素調(diào)控低氧誘導(dǎo)的H9c2大鼠心肌細胞凋亡的分子機制提供理論參考,也為其對動物機體的免疫作用研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞來源

大鼠H9c2細胞株購自中國科學院上海細胞庫。

1.2 藥物及試劑

黑果枸杞花青素(純度:64.4%)購自青海金麥杞生物科技有限公司;紅景天苷(salidroside)標準品SS8080購自北京索萊寶科技有限公司;DMEM干粉、胎牛血清、雙抗購自Gibco公司;PBS購自Hfart公司;Hoechst33342/PI雙染試劑盒CA1120-100 T、RIPA裂解液、5×蛋白上樣緩沖液、TRIZOL購自北京索萊寶科技有限公司;LDH檢測試劑盒C0016、ROS檢測試劑盒S0033 S、細胞凋亡檢測試劑盒C1062 S、鼠源GADPH一抗、山羊抗兔IgG A0516購自碧云天生物技術(shù)有限公司;鼠源Bcl2一抗、鼠源Bax一抗購自美國Proteintech公司;PageRuler預(yù)染蛋白Marker購自美國Thermo fisher公司;PVDF膜購自美國Millipore公司。

1.3 儀 器

臺式電熱恒溫鼓風干燥箱及CO2細胞培養(yǎng)箱,購自美國NUAIRE公司;MIC-101細胞低氧小室-細胞缺氧-細胞高氧富氧培養(yǎng)倉,購自杭州Aipu Instrument Equipment有限公司;高速低溫水平離心機購自英國Dynamica公司;酶標儀購自意大利MuLTISKAN公司;電子天平購自美國METTLER TOLEDO公司;倒置熒光顯微鏡購自日本奧林巴斯公司;高端流式細胞儀購自美國BECKMAN COULTER公司;電泳儀、熒光定量PCR儀器購自美國Bio-Rad公司;恒溫金屬浴購自蘇州江東精密儀器有限公司;Western blot轉(zhuǎn)膜儀、電泳儀購自北京六一生物科技公司;搖床購自美國SCILOGEX公司;PH儀購自美國Alalis公司;化學發(fā)光成像儀購自北京賽智科技有限公司。

1.4 細胞培養(yǎng)

1.4.1 細胞常規(guī)培養(yǎng) H9c2大鼠心肌細胞于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下在細胞培養(yǎng)箱中進行常規(guī)培養(yǎng),待細胞生長至融合度70%～80%時進行傳代,2～3 d進行一次細胞傳代,培養(yǎng)足夠的細胞。

1.4.2 構(gòu)建體外H9c2大鼠心肌細胞低氧模型 H9c2大鼠心肌細胞生長密度約60%時,將細胞分為常氧組和低氧組,常氧組細胞置于CO2培養(yǎng)箱(O2=21%,N2=74%,CO2=5%)將低氧組細胞置于細胞低氧培養(yǎng)裝置(O2=1%,N2=94%,CO2=5%)中作低氧誘導(dǎo)24 h,常氧組細胞則進行常規(guī)培養(yǎng)。

1.5 LDH含量測定

將H9c2大鼠心肌細胞以1×105·mL-1的密度接種于96孔板中,100 μL·孔-1,細胞生長密度約60%時進行誘導(dǎo)。設(shè)常氧組(N)、低氧組(H)和低氧+黑果枸杞花青素組(H+AC),常氧組細胞進行常規(guī)培養(yǎng),低氧組細胞在O2=1%條件下誘導(dǎo)24 h,低氧+黑果枸杞花青素組細胞采用50 μg·mL-1黑果枸杞花青素預(yù)處理12 h后,置于低氧+50 μg·mL-1黑果枸杞花青素條件下繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h。在各時間點前的1 h,陽性對照孔加10 μL LDH最大稀釋劑,隨后將96孔板400g離心5 min;取120 μL各孔上清和60 μL LDH檢測試劑(檢測前新鮮配制,包括20 μL乳酸溶液、20 μL酶溶液、20 μL 1×NT溶液),加至新的96孔板中,避光孵育30 min用酶標儀檢測各孔490 nm處吸光度。

1.6 觀察細胞形態(tài)

將H9c2大鼠心肌細胞以1×106·mL-1的密度接種于6孔板中(1 mL·孔-1),細胞分組及培養(yǎng)同“1.5”,正常光源下通過倒置熒光顯微鏡觀察心肌細胞形態(tài)學變化。

1.7 ROS含量測定

將H9c2大鼠心肌細胞以1×106·mL-1的密度接種于6孔板中(1 mL·孔-1),待細胞貼壁24 h后,對細胞進行誘導(dǎo),設(shè)常氧組(N)、低氧組(H)和低氧+黑果枸杞花青素組(H+AC)、低氧+紅景天苷組(H+Sal)。常氧組細胞進行常規(guī)培養(yǎng);低氧組細胞在O2=1%條件下誘導(dǎo)24 h;低氧+黑果枸杞花青素組細胞采用50 μg·mL-1黑果枸杞花青素預(yù)處理12 h后,細胞置于低氧+50 μg·mL-1黑果枸杞花青素條件下繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h;低氧+紅景天苷組細胞采用1×10-4mol·L-1紅景天苷預(yù)處理12 h后,細胞置于低氧+1×10-4mol·L-1紅景天苷條件下繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h[13]。無血清培養(yǎng)液:DCFH-DA=1∶1 000對DCFH-DA進行稀釋,陽性對照組加入10 μL Rosup,原位裝載DCFH-DA熒光探針后孵育30 min,洗滌2次以充分去除未裝載的探針,通過熒光酶標儀測定熒光強度值,其中,激發(fā)波長為502 nm,發(fā)射波長為530 nm。

1.8 Hoechst33342/PI雙染法檢測黑果枸杞花青素對低氧誘導(dǎo)的H9c2大鼠心肌細胞凋亡程度

以每孔5×105·mL-1細胞接種至24孔培養(yǎng)板,細胞分組及培養(yǎng)同“1.7”。PBS洗滌2次后加入4%甲醛固定,先后加入Hoechst33342和PI染液,避光室溫孵育30 min后洗滌2次,在倒置熒光顯微鏡上觀察拍照。

1.9 流式細胞術(shù)檢測黑果枸杞花青素對低氧誘導(dǎo)的H9c2大鼠心肌細胞凋亡率

將H9c2大鼠心肌細胞以1×106·mL-1的密度接種于6孔板中(每孔1 mL),待細胞貼壁24 h后,對細胞進行誘導(dǎo),細胞分組同“1.7”。收集細胞液,加入不含乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)的胰酶收集貼壁細胞,用PBS清洗兩次后,進行AnnexinV/PI雙染,避光室溫孵育5 min后,上機檢測。

1.10 qRT-PCR法檢測黑果枸杞花青素對低氧誘導(dǎo)的凋亡相關(guān)因子(Bcl2、Bax)在mRNA表達水平

細胞分組同“1.7”,TRIZOL法提取Total RNA,分別通過凝膠電泳和微量核酸蛋白檢測儀檢測RNA樣品的完整性和濃度。通過逆轉(zhuǎn)錄體系(4.0 μL 5×FastKing-RT Super Mix、50 ng～2.0 μg Total RNA和RNase Free ddH2O)進行42 ℃反應(yīng)15 min,而后95 ℃反應(yīng)3 min獲得cDNA。之后使用熒光定量反應(yīng)體系(10 μL 2×SuperReal Color PreMix、0.6 μL正向引物、0.6 μL反向引物、2 μL含Dilution Buffer的cDNA模板和RNase-free ddH2O)進行95 ℃條件下反應(yīng)15 min;95 ℃ 10 sec;55 ℃ 30 sec;72 ℃ 32 sec進行40個循環(huán),使用上海生工設(shè)計合成的引物,如表1所示,各基因的相對表達量采用2-ΔΔct法表示。

表1 凋亡因子引物序列

1.11 Western-blot法檢測黑果枸杞花青素對低氧誘導(dǎo)的凋亡相關(guān)因子(Bcl-2、Bax)在蛋白表達水平

細胞分組同 “1.7”,提取細胞總蛋白通過BCA法蛋白質(zhì)定量,而后進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)電泳,70 V電泳20 min,當marker條帶跑過濃縮膠,電壓升高到120 V。切膠后轉(zhuǎn)印50 min,封閉液封閉2 h,聚偏氟乙烯[poly(vinylidene fluoride),PBST]洗滌PVDF膜5次。一抗4 ℃孵育過夜;次日PBST洗滌5次后加入二抗孵育1 h。ECL發(fā)光液顯色后用凝膠成像系統(tǒng)觀察條帶分布。

1.12 統(tǒng)計學分析

2 結(jié) 果

2.1 黑果枸杞花青素對低氧誘導(dǎo)的H9c2大鼠心肌細胞LDH含量的影響

由圖1可知,與常氧組相比,低氧組H9c2大鼠心肌細胞LDH含量極顯著增加(P<0.01);低氧+黑果枸杞花青素組LDH含量顯著增加(P<0.05)。與低氧組相比,低氧+黑果枸杞花青素組H9c2大鼠心肌細胞LDH含量顯著減少(P<0.05)。綜上所述,黑果枸杞花青素可以有效抑制低氧環(huán)境下H9c2大鼠心肌細胞LDH含量,降低低氧誘導(dǎo)的細胞損傷,保護細胞完整性。

Hyp.低氧;AC.黑果枸杞花青素;*.P<0.05;**.P<0.01

2.2 黑果枸杞花青素對低氧誘導(dǎo)的H9c2大鼠心肌細胞形態(tài)的影響

由圖2可知,在正常光源下觀察細胞形態(tài)發(fā)現(xiàn),與常氧組相比,低氧和低氧+黑果枸杞花青素組H9c2大鼠心肌細胞出現(xiàn)不同程度的密度降低,細胞縮小,細胞邊界模糊,呈現(xiàn)凋亡和壞死形態(tài)。與低氧組相比,低氧+黑果枸杞花青素組細胞密度升高,細胞邊界清晰,細胞形態(tài)相對正常。結(jié)果表明,黑果枸杞花青素可提高低氧誘導(dǎo)的H9c2大鼠心肌細胞密度,減少低氧誘導(dǎo)的細胞形態(tài)改變,提高H9c2大鼠心肌細胞活性。

Hyp.低氧;AC.黑果枸杞花青素;正常細胞用黑色箭頭標識,非正常細胞用紅色箭頭標識

2.3 黑果枸杞花青素對低氧誘導(dǎo)的ROS含量的影響

各組ROS含量見圖3。可以看出,與常氧對照組相比,低氧組ROS含量極顯著增加(P<0.01),低氧+黑果枸杞花青素和低氧+紅景天苷組ROS含量無顯著變化(P>0.05)。與低氧組相比,低氧+黑果枸杞花青素和低氧+紅景天苷組ROS含量均極顯著減少(P<0.01);低氧條件下,黑果枸杞花青素與陽性對照紅景天苷對細胞ROS含量的調(diào)控作用差異不顯著(P>0.05)。綜上所述,黑果枸杞花青素可有效降低低氧誘導(dǎo)的H9c2大鼠心肌細胞ROS積聚。

Hyp.低氧;AC.黑果枸杞花青素;Sal.紅景天苷;*.P<0.05;**.P<0.01;無標注表示P>0.05

2.4 黑果枸杞花青素對低氧誘導(dǎo)的H9c2大鼠心肌細胞凋亡的影響

Hoechst33342和PI均可與DNA或RNA結(jié)合,Hoechst33342通過細胞膜將早中期凋亡細胞和正常細胞染成亮藍色分葉狀或碎片狀和淡藍色圓形,而PI因通不過正常細胞細胞膜只能將壞死和晚期凋亡細胞染成不規(guī)則紅色。Hoechst33342及PI熒光染色結(jié)果發(fā)現(xiàn),與常氧組相比,低氧組藍色和紅色熒光強度明顯增強;低氧+黑果枸杞花青素組的熒光強度有增強趨勢。與低氧組相比,低氧+黑果枸杞花青素組藍色和紅色熒光強度顯著降低(圖4)。結(jié)果表明黑果枸杞花青素可有效減少低氧誘導(dǎo)的細胞壞死和細胞凋亡。

圖4 黑果枸杞花青素對低氧誘導(dǎo)的H9c2大鼠心肌細胞凋亡的影響

2.5 黑果枸杞花青素對低氧誘導(dǎo)的H9c2大鼠心肌細胞凋亡率的影響

由圖5可知,與常氧組相比,低氧組H9c2大鼠心肌細胞凋亡率極顯著升高(P<0.01);低氧+黑果枸杞花青素和低氧+紅景天苷組H9c2大鼠心肌細胞凋亡率無顯著變化(P>0.05)。與低氧組相比,低氧+黑果枸杞花青素組和低氧+紅景天苷組H9c2大鼠心肌細胞凋亡率均極顯著降低(P<0.01)。低氧條件下,黑果枸杞花青素與陽性對照紅景天苷對H9c2大鼠心肌細胞凋亡率的影響差異不顯著(P>0.05)。結(jié)果表明,黑果枸杞花青素可有效抑制低氧誘導(dǎo)的H9c2大鼠心肌細胞凋亡率。

A.大鼠心肌細胞流式細胞術(shù)結(jié)果圖;B.大鼠心肌細胞凋亡率柱狀圖(Hyp.低氧;AC.黑果枸杞花青素;Sal.紅景天苷;*.P<0.05;**.P<0.01;無標注表示P>0.05)

2.6 黑果枸杞花青素對低氧誘導(dǎo)的H9c2大鼠心肌細胞凋亡相關(guān)因子(Bcl2、Bax、Bcl2/Bax)在mRNA水平表達的影響

從圖6可以看出,與常氧組相比,低氧組Bcl2和Bcl2/Bax比值的mRNA表達極顯著降低(P<0.01),Bax的mRNA表達極顯著上調(diào)(P<0.01);低氧+黑果枸杞花青素組中Bcl2和Bcl2/Bax比值因子的mRNA表達極顯著降低(P<0.01),Bax的mRNA表達無顯著變化(P>0.05);低氧+紅景天苷組Bax的mRNA表達顯著上調(diào)(P<0.05),Bcl2/Bax比值的mRNA表達極顯著下降(P<0.01),Bcl2的mRNA表達無顯著變化(P>0.05)。與低氧組相比,低氧+黑果枸杞花青素組中Bcl2和Bcl2/Bax比值的mRNA表達顯著上調(diào)(P<0.05),Bax的mRNA表達無顯著變化(P>0.05);低氧+紅景天苷組Bcl2和Bcl2/Bax比值的mRNA表達極顯著上調(diào)(P<0.01),Bax的mRNA表達極顯著降低(P<0.01)。低氧條件下,黑果枸杞花青素與Bcl2 mRNA表達的調(diào)控作用與陽性對照紅景天苷無顯著差異(P>0.05)。

A.凋亡相關(guān)因子Bcl2 mRNA表達水平;B.凋亡相關(guān)因子Bax mRNA表達水平;C.凋亡相關(guān)因子Bcl2/Bax mRNA表達水平。*.P<0.05;**.P<0.01;無標注表示P>0.05

綜上,黑果枸杞花青素在低氧條件下通過上調(diào)Bcl2和Bcl2/Bax比值的mRNA表達,下調(diào)Bax的mRNA表達來抑制低氧誘導(dǎo)的H9c2大鼠心肌細胞的凋亡。

2.7 黑果枸杞花青素對低氧誘導(dǎo)的H9c2大鼠心肌細胞凋亡相關(guān)因子(Bcl2、Bax、Bcl2/Bax)在蛋白水平表達的影響

從圖7可以看出,與常氧組相比,低氧組Bcl2和Bcl2/Bax比值的蛋白表達極顯著降低(P<0.01),Bax的蛋白表達極顯著上調(diào)(P<0.01);低氧+黑果枸杞花青素組中Bcl2/Bax比值因子的蛋白表達顯著上調(diào)(P<0.05),Bcl2和Bax的蛋白表達無顯著變化(P>0.05);低氧+紅景天苷組Bcl2、Bax和Bcl2/Bax比值的蛋白表達均無顯著變化(P>0.05)。與低氧組相比,低氧+黑果枸杞花青素和紅景天苷組中Bcl2和Bcl2/Bax比值的蛋白表達均極顯著上調(diào)(P<0.01),Bax的蛋白表達均極顯著降低(P<0.01)。低氧條件下,黑果枸杞花青素與Bcl2、Bax和Bcl2/Bax比值蛋白表達的調(diào)控作用與陽性對照紅景天苷無顯著差異(P>0.05)。

A.蛋白印跡法檢測Bcl2、Bax蛋白表達;B.凋亡相關(guān)因子Bcl2蛋白水平表達;C.凋亡相關(guān)因子Bax蛋白水平表達;D.凋亡相關(guān)因子Bcl2/Bax蛋白水平表達。*.P<0.05;**.P<0.01;無標注表示P>0.05

綜上,黑果枸杞花青素在低氧條件下通過上調(diào)Bcl2和Bcl2/Bax比值的蛋白表達,下調(diào)Bax的蛋白表達來抑制低氧誘導(dǎo)的H9c2大鼠心肌細胞的凋亡。

3 討 論

組織和細胞處于低于正常氧濃度(21%)的環(huán)境被稱為低氧[14],嚴重的低氧會對機體心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、代謝相關(guān)等多系統(tǒng)器官造成損害。低氧條件下,細胞液中LDH含量升高,細胞發(fā)生皺縮、變形等形態(tài)學變化,細胞結(jié)構(gòu)即細胞膜的完整性和細胞正常形態(tài)遭到破壞。本試驗研究結(jié)果表明,低氧可造成H9c2大鼠心肌細胞膜完整性降低、細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)遭到破壞,呈現(xiàn)凋亡和壞死的形態(tài),與前人研究結(jié)果一致[15-16]。此外,試驗結(jié)果顯示,黑果枸杞花青素可以有效保護低氧誘導(dǎo)的H9c2大鼠心肌細胞的細胞形態(tài),抑制低氧誘導(dǎo)的H9c2大鼠心肌細胞ROS積聚,并通過下調(diào)Bax、上調(diào)Bcl2和Bcl2/Bax比值的mRNA和蛋白表達抑制低氧誘導(dǎo)的H9c2大鼠心肌細胞凋亡。

細胞凋亡是受多基因復(fù)雜調(diào)控的細胞程序化死亡,涉及胞內(nèi)相關(guān)因子激活、表達及調(diào)控等;對動物機體免疫防御、細胞損傷等具有重要作用[17-18]。Bcl2家族蛋白與細胞凋亡機制密切相關(guān),其中抗凋亡蛋白Bcl2的異常表達是凋亡發(fā)生的一個關(guān)鍵因素。位于膜表面的Bcl2有調(diào)節(jié)線粒體通透性轉(zhuǎn)運孔開放的作用,在凋亡信號刺激下,Bcl2的異常表達促使其不可逆的過度開放,破壞細胞膜完整性,釋放出促凋亡因子。Bax和Bcl2同屬于Bcl2家族,但二者功能相反,Bcl2抑制凋亡的發(fā)生,而Bax則促進細胞凋亡[19]。線粒體有氧呼吸是內(nèi)源性ROS的主要來源[20],缺氧可導(dǎo)致細胞產(chǎn)生大量ROS,ROS若未得到及時清除則破壞機體天然的抗氧化系統(tǒng),可以直接損傷心肌細胞、蛋白結(jié)構(gòu)及DNA并可通過上調(diào)Bcl2、下調(diào)Bax的表達誘導(dǎo)心肌細胞凋亡,進而引起缺氧性機體損傷,從而影響心的結(jié)構(gòu)和功能[21-22]。本試驗研究發(fā)現(xiàn),低氧環(huán)境下,H9c2大鼠心肌細胞ROS過度積聚,通過上調(diào)Bax、下調(diào)Bcl2和Bcl2/Bax比值的mRNA和蛋白表達促進H9c2大鼠心肌細胞凋亡。紅景天苷是緩解高原反應(yīng)臨床藥物紅景天的主要活性物質(zhì)之一,具有抗疲勞、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)、清除氧自由基等多種功效[23],已證實對心肌缺血具有保護作用,抑制心肌細胞的凋亡[24],具有良好的抗氧化和消除自由基等生理功能,故試驗中將其作為陽性對照組對比檢測黑果枸杞花青素對低氧誘導(dǎo)的H9c2大鼠心肌細胞凋亡的影響和對其低氧適應(yīng)性的作用。本研究結(jié)果顯示,黑果枸杞花青素可有效抑制低氧誘導(dǎo)的H9c2大鼠心肌細胞ROS含量積聚和凋亡,并在低氧條件下可下調(diào)Bax、上調(diào)Bcl2和Bcl2/Bax比值的mRNA和蛋白表達來抑制低氧誘導(dǎo)的H9c2大鼠心肌細胞凋亡,且低氧條件下,黑果枸杞花青素對低氧誘導(dǎo)的H9c2大鼠心肌細胞凋亡的抑制作用與紅景天苷無顯著差異。綜上表明,黑果枸杞花青素可有效抑制低氧誘導(dǎo)的H9c2大鼠心肌細胞ROS積聚,并可通過下調(diào)Bax、上調(diào)Bcl2和Bcl2/Bax的mRNA和蛋白表達抑制H9c2大鼠心肌細胞凋亡。

4 結(jié) 論

低氧條件下,黑果枸杞花青素可以有效抑制H9c2大鼠心肌細胞LDH含量,降低低氧誘導(dǎo)的細胞損傷,保護細胞完整性,并減少低氧誘導(dǎo)的H9c2大鼠心肌細胞形態(tài)發(fā)生變化,維持H9c2大鼠心肌細胞的正常形態(tài)。綜上表明,黑果枸杞花青素可以有效緩解低氧引起的H9c2大鼠心肌細胞損傷,對低氧誘導(dǎo)的H9c2大鼠心肌細胞具有良好的保護性。