YAP-shRNA載體構(gòu)建及其對(duì)食管鱗癌細(xì)胞系生物學(xué)行為的影響

韓高揚(yáng),李小麗,王瑞娟,韓玉杰,張仁鋒,魏創(chuàng)業(yè),孔曉煌,連歡歡,王金龍

(1.鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院 胸外科,河南 鄭州 450007;2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 腫瘤科,河南 鄭州 450000)

食管癌(esophageal carcinoma,EC)是造成死亡的第六大癌癥[1],全球總發(fā)病率的85%左右發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家,中國(guó)占全球EC病例的50%以上,每年約27萬例[2]。盡管手術(shù)切除、輔助放化療和免疫治療等措施有所進(jìn)展,但食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)的5 a生存率仍然很低[3]。傳統(tǒng)的治療方法還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能令人滿意。與大多數(shù)其他癌癥一樣,ESCC的發(fā)展是復(fù)雜的,其發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明。

Hippo信號(hào)傳導(dǎo)通路最初是以果蠅Ste20樣激酶Hippo而命名的通路。Hippo通路主要的生物學(xué)效應(yīng)包括控制細(xì)胞的分化、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖凋亡平衡、維持細(xì)胞的接觸性抑制及參與腫瘤的發(fā)生[4]。Hippo信號(hào)通路故障,動(dòng)態(tài)平衡被破壞,會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖異常,甚至腫瘤的發(fā)生[5]。在Hippo信號(hào)傳導(dǎo)通路中尋找新靶點(diǎn),在分子水平、細(xì)胞水平、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)等方面研究治療惡性腫瘤的方法,已成為現(xiàn)在研究Hippo信號(hào)傳導(dǎo)通路的主要方向。其中Yes相關(guān)蛋白(Yes-associated protein,YAP)是Hippo信號(hào)傳導(dǎo)通路下游的關(guān)鍵效應(yīng)分子,在人體內(nèi),Hippo通路參與細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控,YAP磷酸化后是抑制轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵因子,但有些研究表明YAP是一個(gè)癌基因,可促使正常細(xì)胞向惡性腫瘤細(xì)胞分化。因此本實(shí)驗(yàn)通過研究YAP在ESCC中的表達(dá)情況,并構(gòu)建YAP-shRNA來了解其對(duì)食管鱗癌細(xì)胞系生物學(xué)行為的影響,以期找到食管癌治療的新靶點(diǎn)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2015年1月至2016年6月在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科接受食管癌根治術(shù)且病史資料完整的122例食管鱗癌組織標(biāo)本,同時(shí)取正常食管組織(距惡性腫瘤>5 cm)?；颊咝g(shù)前無放療、化療和免疫治療史,所有患者均自確診之日起進(jìn)行隨訪,直至2021年6月1日或患者死亡,其中10例患者隨訪失聯(lián),此項(xiàng)研究得到了鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的支持。按2017年國(guó)際抗癌聯(lián)盟最新的食管癌TNM分期(第8版)進(jìn)行分期[6]。由3名不知此研究?jī)?nèi)容的病理科醫(yī)生共同判定病理切片免疫組化評(píng)分。

1.2 免疫組化結(jié)果判定

采用半定量法,結(jié)合染色強(qiáng)度和染色范圍評(píng)判YAP表達(dá)結(jié)果。根據(jù)病理切片染色的強(qiáng)度和染色陽性細(xì)胞占總細(xì)胞的比率進(jìn)行評(píng)分。染色強(qiáng)度:陰性(強(qiáng)度和陰性對(duì)照類似)為0分;弱陽性(淡黃色)為1分;陽性(黃色)為2分;強(qiáng)陽性(棕黃色)為3分。染色陽性細(xì)胞占比:陽性細(xì)胞數(shù)<10%為0分,10%～30%為1分,3l%～51%為2分,52%～70%為3分,>70%為4分。結(jié)合染色強(qiáng)度與染色陽性細(xì)胞占比的乘積進(jìn)行綜合判定:0分為陰性(-),1～4分為弱陽性(+),5～8分為陽性(++),9～12分為強(qiáng)陽性(+++)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

人食管鱗狀細(xì)胞系EC9706和EC109(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫)在含有10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的RPMI-1640(Gibco,Invitrogen,NY,USA)中培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為37 ℃,二氧化碳體積分?jǐn)?shù)為5%。細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前24 h接種在六孔板中。

1.4 質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染

針對(duì)不同的靶序列(表1),設(shè)計(jì)了5種用于YAP敲除的shRNA質(zhì)粒:pGPU6-YAP-1103(shRNA1)、pGPU6-YAP-2217(shRNA2)、pGPU6-YAP-1862(shRNA3)、pGPU6-YAP-1662(shRNA4)和pGPU6-YAP-shNC(shNC)的陰性對(duì)照質(zhì)粒。使用Attractene轉(zhuǎn)染試劑(德國(guó)希爾登Qiagen)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到相應(yīng)細(xì)胞中。48 h后采用qRT-PCR檢測(cè)各組YAP RNA表達(dá)情況,72 h后采用蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)各組YAP蛋白表達(dá)情況,以評(píng)估5種質(zhì)粒的有效性,從而為后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇最佳質(zhì)粒。

表1 5種不同的靶序列

1.5 qRT-PCR檢測(cè)

48 h后利用TRIzol(Invitrogen Corporation,加利福尼亞州卡斯巴德)試劑從細(xì)胞中提取RNA。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書(美國(guó)賽默飛世爾科學(xué)公司)對(duì)每個(gè)RNA樣本(1 μg)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA合成。然后利用qRT-PCR檢測(cè)YAP基因表達(dá)量。以管家基因β-actin作為內(nèi)參,YAP引物序列和β-actin引物序列如(表2)所示。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,以β-actin作為參照,計(jì)算Ct均值,應(yīng)用相對(duì)定量法2-ΔΔCt進(jìn)行定量分析。

表2 YAP引物序列和β-actin引物序列

1.6 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)各組YAP蛋白表達(dá)情況

72 h后提取蛋白,采用紫外分光光度計(jì)測(cè)提取蛋白的水平,配制分離膠,水封,加濃縮膠,跑膠,電泳轉(zhuǎn)膜,封閉,加入一抗(1∶200),在4 ℃冰箱內(nèi)過夜孵育,用TBST液洗膜3遍,然后再加入稀釋的二抗(1∶2 000)進(jìn)行孵育,用TBST液洗滌3遍,最后加熒光顯影劑顯影。

1.7 Transwell小室檢測(cè)侵襲能力

用YAP-shRNA2和YAP-shNC轉(zhuǎn)染EC9706和EC109細(xì)胞系,并進(jìn)行培養(yǎng)。48 h后先用胰蛋白酶分離細(xì)胞,再用PBS洗滌,培養(yǎng)在無血清培養(yǎng)液中。在下室中加入600 μL的含血清的培養(yǎng)液,稀釋腫瘤細(xì)胞懸液至每毫升1×105個(gè),并吸取200 μL細(xì)胞懸液加入上室中。在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。用棉簽擦去濾膜上方未穿出的腫瘤細(xì)胞,濾膜用40 g·L-1多聚甲醛固定,時(shí)間約30 min,用結(jié)晶紫染色,切下的膜固封在載玻片上,在倒置顯微鏡下計(jì)膜背面的細(xì)胞數(shù),計(jì)四周和中間的3～4個(gè)視野,然后計(jì)算出平均值。

1.8 CCK8檢測(cè)增殖能力

用YAP-shRNA2和YAP-shNC轉(zhuǎn)染EC9706和EC109細(xì)胞系,把細(xì)胞的水平調(diào)整為每毫升1×104個(gè),調(diào)整好的細(xì)胞懸液按照每孔100 μL的上樣量加到 96孔板內(nèi),每組細(xì)胞5個(gè)復(fù)孔。在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),分別在12、24、36、48 h在每孔細(xì)胞的懸液中加入10 μL的CCK8溶液,然后繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育。1 h后從培養(yǎng)箱中取出96孔板,用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定各組的吸光度,記錄每組5孔的數(shù)值,并取平均值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,運(yùn)用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,并以Cox回歸模型行多因素預(yù)后分析,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化結(jié)果

YAP蛋白在食管正常組織中染色呈淡黃色,染色部位主要集中于細(xì)胞核,少數(shù)為細(xì)胞質(zhì),染色陽性率為9.7%,YAP蛋白在食管鱗癌組織中染色呈棕黃色,在大部分細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均染色,陽性率為64.8%(圖1)。通過分析,發(fā)現(xiàn)YAP蛋白在食管鱗癌組織中的表達(dá)與正常食管組織中表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),不同年齡、性別、分化程度、腫瘤大小患者的YAP蛋白表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表3)。通過隨訪發(fā)現(xiàn)食管鱗癌YAP陽性的患者生存期縮短(圖2)。

A和B為YAP在正常食管組織的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中呈陰性表達(dá);C和D為YAP在食管鱗癌細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中呈陰性表達(dá);E和F為YAP在食管鱗癌細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中陽性表達(dá);A、C、E放大倍數(shù)為200×,B、D、F放大倍數(shù)為400×。

圖2 食管鱗癌患者的生存曲線

表3 YAP表達(dá)與食管鱗癌臨床病理因素分析(n=122)

2.2 質(zhì)粒對(duì)YAP基因表達(dá)的影響

本研究設(shè)計(jì)了5種不同YAPshRNA(shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4、shNC),經(jīng)過轉(zhuǎn)染EC9706和EC109細(xì)胞系,運(yùn)用qRT-PCR和蛋白質(zhì)印跡來檢測(cè)YAP在該細(xì)胞中的表達(dá)情況(圖3),檢測(cè)可見經(jīng)shRNA2和shRNA3轉(zhuǎn)染的EC9706和EC109細(xì)胞,YAP表達(dá)較低,且shRNA2優(yōu)于shRNA3,從而挑選出shRNA2為最有效質(zhì)粒,并培養(yǎng)經(jīng)shRNA2轉(zhuǎn)染的EC9706和EC109細(xì)胞系做下一步實(shí)驗(yàn)。

A為RT-PCR檢測(cè)YAP在EC9706和EC109中的表達(dá);B為蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)YAP在EC9706和EC109中的表達(dá)(shRNA1,shRNA2,shRNA3,shRNA4,shNC)。

2.3 YAP的沉默對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲和增殖能力的影響

采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)來檢驗(yàn)轉(zhuǎn)染前后腫瘤細(xì)胞的侵襲能力,通過計(jì)算YAP-shRNA2和YAP-shNC組在Transwell小室中72 h后的穿膜細(xì)胞數(shù),可以看到Y(jié)AP-shRNA2組穿膜的細(xì)胞數(shù)明顯減少(圖4),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖5),提示YAP基因的沉默能夠抑制EC9706和EC109的侵襲能力。

圖4 Transwell小室的穿膜細(xì)胞

圖5 Transwell小室的穿膜細(xì)胞數(shù)

采用CCK8實(shí)驗(yàn)來檢驗(yàn)轉(zhuǎn)染前后腫瘤細(xì)胞的增殖能力,用酶標(biāo)儀在490 nm處測(cè)定各組的吸光度,記錄每組5孔的數(shù)值,并取均值。通過繪制生長(zhǎng)曲線顯示YAP-shRNA2組的增殖數(shù)明顯下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖6),提示了YAP基因的沉默能夠抑制EC9706和EC109的增殖能力。

圖6 細(xì)胞系的生長(zhǎng)曲線

3 討論

YAP在多種惡性腫瘤中高表達(dá)已被證實(shí)[7-8],然而關(guān)于YAP的表達(dá)與食管鱗癌的臨床病理因素之間的關(guān)系及對(duì)食管癌細(xì)胞系生物學(xué)行為的影響卻少有報(bào)道。在此次研究中,通過對(duì)食管鱗癌臨床病理因素的分析,證實(shí)YAP在食管鱗癌組織中高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān),且YAP高表達(dá)的食管鱗癌患者的生存時(shí)間縮短,通過shRNA轉(zhuǎn)染EC9706和EC109細(xì)胞系使其YAP表達(dá)降低,轉(zhuǎn)染后的EC9706和EC109細(xì)胞系通過Transwell小室實(shí)驗(yàn)和CCK8實(shí)驗(yàn)證實(shí)其侵襲和增殖能力降低。

Hippo信號(hào)傳導(dǎo)通路的異?？蓪?dǎo)致惡性腫瘤發(fā)生,因而被廣泛關(guān)注。YAP是位于染色體11q22上的候選癌基因[9-11],在卵巢癌、胃癌、乳腺癌、前列腺癌等惡性腫瘤組織中呈高表達(dá),且其表達(dá)位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)[12-17]。一項(xiàng)納入115例肝癌組織標(biāo)本的研究顯示,YAP的表達(dá)與AFP水平呈正相關(guān),并且是影響肝癌患者生存期的獨(dú)立預(yù)后因素[18]。對(duì)122例食管鱗癌組織進(jìn)行了免疫組化研究,研究發(fā)現(xiàn)其中64.8%的食管鱗癌組織的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)YAP,且與正常食管組織表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,雖然不同年齡、性別、分化程度、腫瘤大小患者的YAP表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但YAP的表達(dá)差異與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。結(jié)果表明,YAP是在食管鱗癌中高表達(dá)的癌蛋白,且與食管鱗癌的不良預(yù)后相關(guān)。

Hippo信號(hào)傳導(dǎo)通路可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡,使內(nèi)環(huán)境處于動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài),而YAP是Hippo信號(hào)傳導(dǎo)通路下游的關(guān)鍵效應(yīng)分子。作為候選癌基因,YAP已被證實(shí)是調(diào)節(jié)器官大小和細(xì)胞增殖的因子[19]。轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟中YAP的過度表達(dá)可將肝臟質(zhì)量從體重的5%增至約25%,并最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[20]。肝癌中YAP表達(dá)的降低可使腫瘤細(xì)胞的遷移能力降低,G0/G1期細(xì)胞數(shù)量顯著增加[21]。為了了解YAP對(duì)ESCC生物學(xué)行為的影響,本研究沉默了EC細(xì)胞系中的YAP。YAP-shRNA2轉(zhuǎn)染EC9706和EC109細(xì)胞系后,YAPmRNA和YAP蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組,并且侵襲和增殖能力降低,與以上結(jié)果基本一致。

4 小結(jié)

YAP作為一種癌蛋白在食管鱗癌中高表達(dá),并且可以增加癌細(xì)胞的侵襲和增殖能力。此外YAP的高表達(dá)可導(dǎo)致食管鱗癌患者的生存率降低,因此YAP可成為未來食管癌治療的新靶點(diǎn)。但YAP在食管鱗癌中的分子機(jī)制及功能還需要進(jìn)一步努力闡明。