LPCAT1在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及與腫瘤免疫的相關(guān)性分析

王锃涵,王云,王雪梅,朱威威,梁紅霞

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 感染科,河南 鄭州 450000)

原發(fā)性肝癌是全球第六大最常診斷的癌癥和第三大癌癥相關(guān)死因[1],2020年全球約有90萬(wàn)人被診斷為肝癌,83萬(wàn)人死于肝癌[2]。肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是原發(fā)性肝癌最常見的病理類型,因其癥狀隱匿且進(jìn)展迅速,約70%的患者在確診時(shí)已處于中晚期[3]。目前,以程序性死亡受體1(programmed cell death protein 1,PD-1)為代表的免疫治療是中晚期HCC的主要治療手段,也可作為HCC的輔助治療和轉(zhuǎn)化治療手段[4],同時(shí)面臨著客觀應(yīng)答率低、毒副作用高、適應(yīng)性耐藥等挑戰(zhàn)[5]。研究表明,免疫治療與腫瘤細(xì)胞異常的脂質(zhì)代謝密切相關(guān),后者可通過(guò)直接或間接調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的分化、凋亡以及細(xì)胞間相互作用等影響免疫治療效果[6]。血磷脂酰膽堿?；D(zhuǎn)移酶1(lysophosphatidylcholine acyltransferase 1,LPCAT1)作為脂質(zhì)代謝過(guò)程中一種參與膜脂重塑的關(guān)鍵酶[7],已被證實(shí)在多種癌癥中表達(dá)升高,且具有作為診斷和預(yù)后標(biāo)志物的潛力[8-11]。在HCC中,LPCAT1被證實(shí)可通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路進(jìn)而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程,以及通過(guò)抑制信號(hào)傳導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子1進(jìn)而促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖等[12-13]。然而,目前關(guān)于LPCAT1在HCC中與腫瘤免疫微環(huán)境的相互作用等尚未被闡明。

本研究基于腫瘤基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)等數(shù)據(jù)庫(kù),聯(lián)合LPCAT1表達(dá)水平和患者的臨床病理特征、預(yù)后信息等資料,探索LPCAT1在HCC中的診斷意義、預(yù)后意義和潛在功能,通過(guò)細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)探究LPCAT1對(duì)HCC細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響。同時(shí),分析LPCAT1與HCC中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平和標(biāo)志物表達(dá)水平的相關(guān)性,以及LPCAT1與免疫檢查點(diǎn)的遺傳變異和表達(dá)水平的關(guān)系,以此探索LPCAT1在腫瘤免疫中的潛在功能。

1 材料與方法

1.1 LPCAT1表達(dá)情況分析

從TCGA(https://cancergenome.nih.gov)數(shù)據(jù)庫(kù)下載包含374例HCC樣本和50例正常樣本的TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集[14],對(duì)基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)og2對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換,使用R包limma分析LPCAT1在腫瘤和正常樣本中的差異表達(dá)。從人類蛋白質(zhì)表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)(Human Protein Atlas,HPA,https:/www.proteinatlas.org/)22.0中下載LPCAT1在HCC腫瘤和肝臟組織中的蛋白表達(dá)情況[15]。

1.2 LPCAT1預(yù)后意義分析

利用基因表達(dá)譜在線分析平臺(tái)(gene expression profiling interactive analysis,GEPIA)2.0(http://gepia2.cancer-pku.cn)[16]和Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)(http://kmplot.com)對(duì)LPCAT1表達(dá)水平與常見惡性腫瘤的預(yù)后信息進(jìn)行Cox回歸分析或log-rank秩和檢驗(yàn),并繪制預(yù)后生存曲線[17]。通過(guò)繪制受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線分析LPCAT1對(duì)于HCC預(yù)后情況的預(yù)測(cè)效能。

1.3 LPCAT1與HCC患者臨床病理特征的分析

以LPCAT1mRNA表達(dá)水平的中位數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)將樣本分為高表達(dá)組(187例)和低表達(dá)組(187例),利用χ2檢驗(yàn)分析LPCAT1的表達(dá)與臨床病理信息的相關(guān)性,不符合正態(tài)分布的變量運(yùn)用Wilcoxon檢驗(yàn)。隨后進(jìn)行單因素和多因素Cox回歸分析,并通過(guò)Nomogram列線圖對(duì)多因素Cox回歸分析結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.4 LPCAT1在HCC中的功能富集分析

利用Spearman秩相關(guān)性分析挑選與LPCAT1表達(dá)水平具有顯著相關(guān)性的1組基因,上傳至DAVID(the Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery,https://david.ncifcrf.)2021在線數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行功能富集分析,分析內(nèi)容主要包括基因本體論(Gene Ontology,GO)和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)[18]。同時(shí)從基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)官網(wǎng)(https://www.gsea-msigdb.org/)下載GSEA 4.3.0軟件,對(duì)差異基因在信號(hào)通路或生理過(guò)程中的富集情況進(jìn)行GSEA。

1.5 LPCAT1影響免疫細(xì)胞和免疫檢查點(diǎn)的分析

利用腫瘤免疫浸潤(rùn)評(píng)估資源(Tumor Immune Estimation Resource,TIMER)2.0數(shù)據(jù)庫(kù)(http://timer.comp-genomics.org/)分析LPCAT1與腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)豐度的相關(guān)性[19]。應(yīng)用cBioPortal數(shù)據(jù)集(V.5.3.6)(https://www.cbioportal.org/)分析HCC中LPCAT1與免疫檢查點(diǎn)遺傳變異的關(guān)系,包括擴(kuò)增、缺失等[20]。應(yīng)用相關(guān)性分析探索LPCAT1與免疫細(xì)胞標(biāo)志物及免疫檢查點(diǎn)的表達(dá)水平的關(guān)系。

1.6 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.6.1細(xì)胞和主要試劑

人類HCC細(xì)胞系和肝細(xì)胞系均購(gòu)自中國(guó)細(xì)胞典藏中心。DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清等購(gòu)自美國(guó)Gibco公司,一抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司,蛋白定量試劑盒和EdU試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司,熒光定量SYBR Green Ⅰ試劑盒購(gòu)自瑞士Roche公司。siRNA和聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)引物分別由漢恒生物公司和生工生物公司構(gòu)建。

1.6.2細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染

HCC細(xì)胞系和L02細(xì)胞系分別用含10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的DMEM或RPMI 1640培養(yǎng)基培育于5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中。選取匯合度為70%～80%的Huh7和Hep3B細(xì)胞系,按照說(shuō)明書配制含有適量siRNA和Lipofectamine 3000的轉(zhuǎn)染體系,等量加入細(xì)胞培養(yǎng)孔中,8 h后更換為含血清DMEM培養(yǎng)基。36 h后檢測(cè)LPCAT1mRNA水平,48 h后檢測(cè)LPCAT1蛋白質(zhì)水平。

1.6.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR

應(yīng)用Trizol、氯仿等提取總RNA并測(cè)定濃度,依據(jù)操作說(shuō)明配制反轉(zhuǎn)錄體系,依次于25 ℃反應(yīng)5 min,42 ℃反應(yīng)1 h,75 ℃反應(yīng)5 min。隨后依據(jù)操作說(shuō)明配制cDNA擴(kuò)增體系。首先以95 ℃反應(yīng)10 min,后按照95 ℃ 10 s,60 ℃ 15 s,72 ℃ 20 s的順序反應(yīng)40個(gè)循環(huán),運(yùn)用2-△△CT法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.6.4Western blot

收集總蛋白后利用BCA法測(cè)定蛋白濃度并配制上樣體系,97 ℃變性后于125 g·L-1聚丙稀酰胺凝膠和1×Tris-甘氨酸電泳液進(jìn)行電泳,電泳條件為恒壓220 V,約35 min。隨后,于1×Tris-甘氨酸轉(zhuǎn)膜液中構(gòu)建轉(zhuǎn)膜體系,轉(zhuǎn)膜條件恒流0.2 A,70 min。于封閉液中進(jìn)行1 h的室溫封閉,清洗后分別孵育一抗和二抗(1∶5 000),隨后進(jìn)行蛋白顯影和圖像分析。

1.6.5EdU實(shí)驗(yàn)

按照說(shuō)明書配制2×EdU工作液,選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞系加入EdU工作液孵育3 h,隨后進(jìn)行固定和室溫通透處理,并用Click活性溶解體系和Click反應(yīng)液于室溫下避光孵育15 min。用Hoechst 33342溶液對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色。利用熒光顯微鏡對(duì)細(xì)胞增殖情況進(jìn)行觀測(cè)。

1.6.6劃痕實(shí)驗(yàn)

選取貼壁于六孔板的匯合度85%～95%的細(xì)胞,用200 μL槍頭對(duì)細(xì)胞進(jìn)行垂直或水平劃痕,每孔2道劃痕。隨后分別于0 h和36 h時(shí)用普通光學(xué)顯微鏡對(duì)劃痕處進(jìn)行觀測(cè)和拍照,測(cè)量劃痕的變化程度并進(jìn)行后續(xù)分析。注意劃痕后使用不含胎牛血清的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 LPCAT1 mRNA在泛癌中的表達(dá)水平和預(yù)后分析

本研究分析了TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中33種癌癥組織和正常組織中LPCAT1的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,有22種癌癥組織表現(xiàn)出較高水平的LPCAT1,如HCC、膀胱尿路上皮癌、乳腺癌、肺鱗癌等,然而LPCAT1在腎嫌色細(xì)胞癌、甲狀腺癌和胸腺瘤中的表達(dá)水平低于癌旁組織(圖1A)。基于GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)的分析顯示,LPCAT1與HCC、肺鱗癌、低級(jí)別膠質(zhì)瘤的總生存期(overall survival,OS)和疾病特異性生存期(disease specific survival,DSS)具有顯著的相關(guān)性,LPCAT1的表達(dá)水平越高,患者的OS和DSS越短(圖1B)。

A為L(zhǎng)PCAT1在多種惡性腫瘤中顯著高表達(dá);B為L(zhǎng)PCAT1在HCC、肺鱗癌和低級(jí)別膠質(zhì)瘤患者中提示不良預(yù)后。

2.2 LPCAT1在HCC中高表達(dá)且提示不良預(yù)后

根據(jù)TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集和HPA數(shù)據(jù)庫(kù)分析LPCAT1在配對(duì)樣本和非配對(duì)樣本中的表達(dá)水平,結(jié)果均顯示LPCAT1在HCC中的表達(dá)水平高于癌旁組織(P<0.05)(圖2A～B)。對(duì)LPCAT1與HCC臨床病理特征的相關(guān)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果顯示,LPCAT1與較高的T分期(P=0.008)、組織學(xué)分級(jí)(P<0.001)、Edmondson-Steiner分級(jí)(P=0.002)、血清甲胎蛋白水平(P=0.019)以及發(fā)生血管侵襲(P<0.001)具有顯著相關(guān)性,見圖2C及表1(部分患者臨床病理特征信息缺失)。通過(guò)Cox回歸分析探索影響HCC預(yù)后的危險(xiǎn)因素,單因素分析結(jié)果提示,較高的Edmondson-Steiner分級(jí)(P<0.001)、T分期(P<0.001)和LPCAT1表達(dá)水平(P<0.001)是影響HCC生存期的潛在危險(xiǎn)因素,多因素回歸分析提示高表達(dá)的LPCAT1(P<0.001)是影響HCC預(yù)后的獨(dú)立因子(表2)?；诨貧w分析結(jié)果的Nomogram列線圖顯示,LPCAT1高表達(dá)的HCC樣本的單項(xiàng)總分更高,與之對(duì)應(yīng)的1、3、5 a生存率更低,高表達(dá)的LPCAT1可能是HCC患者潛在的預(yù)后預(yù)測(cè)指標(biāo)(圖3)。生存曲線顯示,LPCAT1高表達(dá)的HCC樣本具有較低的OS、DSS和無(wú)進(jìn)展生存期(progression free survival,PFS)(圖4A～C)。依據(jù)ROC曲線分別利用OS、DSS和PFS評(píng)價(jià)LPCAT1對(duì)HCC預(yù)后預(yù)測(cè)的效果,結(jié)果顯示,曲線下面積(area under the curve,AUC)分別為0.886、0.763和0.628,具有較好的預(yù)測(cè)價(jià)值(圖4D～F)。

表1 LPCAT1與HCC臨床病理特征的相關(guān)性[n(%)]

表2 HCC臨床病理特征與總生存率的相關(guān)性分析

A為L(zhǎng)PCAT1在HCC和癌旁樣本中的表達(dá)水平;B為HPA數(shù)據(jù)庫(kù)中LPCAT1在HCC和正常肝臟中的表達(dá)情況;C為L(zhǎng)PCAT1與HCC樣本的臨床病理特征的關(guān)系;*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001。

A為以O(shè)S為預(yù)后指標(biāo)的Nomogram預(yù)后預(yù)測(cè)模型;B為以DSS為預(yù)后指標(biāo)的Nomogram預(yù)后預(yù)測(cè)模型。

A、B、C為基于LPCAT1表達(dá)水平的生存曲線;D、E、F為基于LPCAT1表達(dá)水平的ROC曲線模型。

2.3 LPCAT1的潛在功能分析

利用相關(guān)性分析獲取與LPCAT1的表達(dá)水平相關(guān)性較強(qiáng)的基因共5 155個(gè)(P<0.05,相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值>0.3),以此進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析,結(jié)果顯示,LPCAT1參與的生物過(guò)程主要包括中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的免疫、有絲核分裂、微管細(xì)胞骨架組織等;參與的分子功能主要包括激活跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、鐵離子結(jié)合、酰基轉(zhuǎn)移酶活性等;LPCAT1相關(guān)的細(xì)胞組成主要為細(xì)胞-基質(zhì)黏附結(jié)點(diǎn)、細(xì)胞微管、蛋白-脂質(zhì)復(fù)合體等;KEGG通路富集分析結(jié)果提示,LPCAT1主要參與過(guò)氧化物酶體、糖酵解/糖異生等信號(hào)通路(圖5)。GSEA結(jié)果顯示,LPCAT1在HCC中參與初始或效應(yīng)CD8+T細(xì)胞生成、輔助性T細(xì)胞1和17的上調(diào)、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化等,以及KRAS、Wnt、EGFR等癌癥相關(guān)信號(hào)通路(圖6)。

圖5 HCC樣本中LPCAT1的GO和KEGG功能分析

圖6 HCC樣本中LPCAT1的GSEA富集分析

2.4 LPCAT1與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系

首先利用TIMER 2.0數(shù)據(jù)庫(kù)分析LPCAT1與HCC腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平的相關(guān)性,結(jié)果顯示,LPCAT1與5種免疫抑制性細(xì)胞的浸潤(rùn)豐度呈正相關(guān),包括單核細(xì)胞(r=0.453,P<0.001)、M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophages,TAMs)(r=0.345,P<0.001)、腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(carcinoma-associated fibroblasts,CAFs)(r=0.300,P<0.001)、骨髓源性抑制細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)(r=0.557,P<0.001)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells,Tregs)(r=0.287,P<0.001)(圖7A～E)。自CellMarker 2.0數(shù)據(jù)庫(kù)(http://CellMarker/index.html)查詢上述免疫細(xì)胞的細(xì)胞標(biāo)志基因,相關(guān)性分析提示LPCAT1與上述5種免疫抑制細(xì)胞亞群的標(biāo)志基因在表達(dá)水平上呈正相關(guān)(圖7F)。

A～E為L(zhǎng)PCAT1與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)程度的相關(guān)性分析;F為L(zhǎng)PCAT1與5種免疫抑制性細(xì)胞的標(biāo)志基因表達(dá)水平的相關(guān)性分析;*P<0.05。

2.5 LPCAT1與HCC中免疫檢查點(diǎn)的關(guān)系

為探索LPCAT1可否作為預(yù)測(cè)抗腫瘤免疫治療效果的潛在指標(biāo),分析HCC中LPCAT1與免疫檢查點(diǎn)的關(guān)系。首先利用cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)繪制LPCAT1與免疫檢查點(diǎn)基因的共變異和互斥變異圖譜,并采用Fisher精確檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,結(jié)果表明,LPCAT1與CD48、CD80、HHLA2、TNFSF4和TNFSF18在同一HCC樣本中存在共變異(P<0.05),變異類型按照發(fā)生頻率由高到低依次為擴(kuò)增、深度缺失和錯(cuò)義突變,提示LPCAT1與上述基因具有一定的共現(xiàn)性(圖8A,表3)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示,LPCAT1與免疫檢查點(diǎn)在表達(dá)水平上具有一定的正相關(guān)性(圖8B)。

表3 HCC中LPCAT1和免疫檢查點(diǎn)的互斥性和共現(xiàn)性分析

A為HCC中LPCAT1和免疫檢查點(diǎn)基因的互斥性和共現(xiàn)性分析;B為L(zhǎng)PCAT1與免疫檢查點(diǎn)基因表達(dá)水平的相關(guān)性分析。

2.6 敲低LPCAT1抑制HCC細(xì)胞系的增殖和遷移能力

Western blot結(jié)果顯示,LPCAT1在HCC細(xì)胞系中的表達(dá)高于正常肝臟細(xì)胞(圖9A)。隨后應(yīng)用si-RNA分別轉(zhuǎn)染Huh7和Hep3B兩種細(xì)胞系,分別用Western blot和qRT-PCR驗(yàn)證LPCAT1的敲減效果,結(jié)果顯示,siLPCAT1組中的LPCAT1水平降低,敲減有效(圖9B～C)。EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,siLPCAT1組在3 h內(nèi)進(jìn)行增殖的細(xì)胞比率低于對(duì)照組,敲低LPCAT1可以抑制HCC細(xì)胞的增殖能力(圖9D);細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,siLPCAT1組在劃痕36 h之后劃痕寬度縮短的距離短于對(duì)照組,敲低LPCAT1可以抑制HCC細(xì)胞的遷移能力(圖9E)。

A為L(zhǎng)PCAT1在肝臟細(xì)胞系和HCC細(xì)胞系中的表達(dá)情況;B、C為在蛋白質(zhì)水平和RNA水平驗(yàn)證LPCAT1的敲減效率;D為敲低LPCAT1對(duì)HCC細(xì)胞系增殖能力的影響;E為敲低LPCAT1對(duì)HCC細(xì)胞系遷移行為的影響;**P<0.01。

3 討論

目前,關(guān)于HCC早期診斷和綜合治療的研究均取得了較大的突破和創(chuàng)新,部分中晚期患者有望在進(jìn)行輔助性抗腫瘤藥物治療和局部治療之后再進(jìn)行外科切除,擴(kuò)大了外科切除的治療范圍[21]。此外,圍手術(shù)期可進(jìn)行免疫檢查點(diǎn)抑制劑或分子靶向藥物的單藥或聯(lián)合治療,有助于降低術(shù)后復(fù)發(fā)率[22]。然而,免疫治療和分子靶向治療仍面臨著整體應(yīng)答率低、毒副作用高、原發(fā)或繼發(fā)性耐藥等挑戰(zhàn)[23]。迫切需要對(duì)HCC的發(fā)病和進(jìn)展機(jī)制進(jìn)行多學(xué)科聯(lián)合研究,以獲得理想的生物標(biāo)志物和個(gè)體化治療的靶點(diǎn)。

在癌癥進(jìn)展過(guò)程中,異常活躍的脂質(zhì)合成、吸收和相關(guān)酶的異常表達(dá)已被證實(shí)是一種適應(yīng)性代謝重排現(xiàn)象,又叫做脂質(zhì)代謝重編程[24]。LPCAT1是磷脂酰膽堿代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,催化溶血磷脂酰膽堿轉(zhuǎn)化為磷脂酰膽堿,從而調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和流動(dòng)性[7]。LPCAT1在多種癌癥中的表達(dá)水平升高,如乳腺癌[25]、宮頸癌[26]和前列腺癌[27]等,可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和血管生成等惡性生物學(xué)行為。然而,目前關(guān)于LPCAT1在HCC中的潛在機(jī)制,尤其是對(duì)免疫微環(huán)境和抗腫瘤免疫應(yīng)答的影響尚未明確。

本研究首先基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析了LPCAT1在泛癌中的表達(dá)譜以及與預(yù)后的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)LPCAT1在包括HCC、前列腺癌等在內(nèi)的多種癌癥中的表達(dá)水平升高,且與一些腫瘤的預(yù)后相關(guān),證明了LPCAT1可能參與多種腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展。隨后,通過(guò)分析LPCAT1與HCC臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系,證明高表達(dá)的LPCAT1與HCC患者較高的T分期、Edmondson-Steiner分級(jí)、血清甲胎蛋白水平等具有相關(guān)性,表明LPCAT1與HCC的進(jìn)展有關(guān),進(jìn)一步的Cox回歸分析證實(shí)LPCAT1是HCC的獨(dú)立危險(xiǎn)因子與獨(dú)立預(yù)后因子。ROC曲線顯示LPCAT1對(duì)患者預(yù)后的預(yù)測(cè)具有較高的特異性和敏感性。上述結(jié)果都表明LPCAT1可能是一個(gè)對(duì)HCC具有診斷和預(yù)后評(píng)估能力的生物標(biāo)志物。為探索LPCAT1潛在的致癌機(jī)制,本研究通過(guò)功能富集分析,證實(shí)了LPCAT1在HCC中主要參與多種具有促癌作用的信號(hào)通路和病理過(guò)程。隨后通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)了LPCAT1在HCC細(xì)胞系中的表達(dá)水平升高且敲低LPCAT1對(duì)HCC細(xì)胞的增殖和遷移能力具有抑制性影響。以上結(jié)果均證實(shí)了LPCAT1影響HCC的發(fā)生和進(jìn)展過(guò)程,可為基于LPCAT1的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的研發(fā)提供更多理論基礎(chǔ)。

HCC腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞成分主要由T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、肥大細(xì)胞、單核細(xì)胞、TAMs、MDSCs、CAFs等組成,與腫瘤免疫逃逸和免疫耐受緊密相關(guān)[28]。以PD-1為代表的免疫檢查點(diǎn)抑制劑的功能主要是刺激特異性免疫,打破免疫耐受,重新賦予免疫細(xì)胞識(shí)別和殺傷癌細(xì)胞的活性[23]。目前,越來(lái)越多的研究證明惡性腫瘤中異常的脂質(zhì)代謝與免疫細(xì)胞和免疫檢查點(diǎn)基因具有潛在的相互作用,可共同促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[29-30]。在免疫細(xì)胞方面,研究證實(shí),CD8+淋巴細(xì)胞表面的CD36分子可以吸收低密度脂蛋白并誘導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化,進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤局部CD8+T細(xì)胞功能障礙,促進(jìn)了腫瘤的免疫逃逸[31]。另有研究表明,脂質(zhì)異常聚集可降低樹突狀細(xì)胞的抗原呈遞能力,進(jìn)而導(dǎo)致T細(xì)胞的耗竭或功能障礙[32]。在免疫檢查點(diǎn)方面,研究表明,膽固醇合成過(guò)程的重要限速酶之一辛伐他汀可通過(guò)抑制lncRNASNHG29來(lái)降低Yes相關(guān)蛋白的磷酸化和泛素化介導(dǎo)的蛋白降解,從而使程序性死亡受體配體1的轉(zhuǎn)錄水平降低[33]。另有研究表明,由脂肪酸合成酶(fatty-acid synthase,FASN)催化的脂肪酸從頭合成過(guò)程可促進(jìn)Treg的成熟與分化,在FASN基因缺失的Treg中可檢測(cè)到上調(diào)的PD-1表達(dá)水平,抑制Treg的脂質(zhì)合成過(guò)程可以抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)且增強(qiáng)抗PD-1免疫治療的效果[34]。以上研究均表明脂質(zhì)代謝重編程可通過(guò)影響免疫細(xì)胞和免疫檢查點(diǎn)來(lái)發(fā)揮促癌作用?；赥CGA和TIMER數(shù)據(jù)庫(kù),本研究證實(shí)了LPCAT1的高表達(dá)與5種免疫抑制細(xì)胞群即單核細(xì)胞、Tregs、TAMs、MDSCs和CAFs的浸潤(rùn)水平和標(biāo)志基因的表達(dá)水平呈正相關(guān),表明LPCAT1可能通過(guò)影響免疫抑制性的腫瘤微環(huán)境來(lái)促進(jìn)HCC的進(jìn)展。此外,本研究首次繪制了HCC中LPCAT1與免疫檢查點(diǎn)的共變異和互斥變異圖譜,證實(shí)了LPCAT1與免疫檢查點(diǎn)的遺傳變異密切相關(guān),同時(shí)也證實(shí)了LPCAT1與免疫檢查點(diǎn)的表達(dá)水平呈正相關(guān),創(chuàng)新性地提出LPCAT1可能和免疫檢查點(diǎn)存在相互作用,具有成為預(yù)測(cè)抗HCC免疫治療效果的生物標(biāo)志物的潛力。

4 結(jié)論

本研究初步證實(shí)了LPCAT1在包括HCC在內(nèi)的多種惡性腫瘤中高表達(dá),與HCC患者的臨床病理信息和預(yù)后顯著相關(guān),是HCC的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因子和獨(dú)立預(yù)后因子,且LPCAT1的敲減對(duì)HCC細(xì)胞的增殖和遷移能力有抑制作用。LPCAT1與免疫抑制性細(xì)胞以及免疫檢查點(diǎn)緊密相關(guān),可能通過(guò)參與免疫抑制性腫瘤微環(huán)境的構(gòu)建進(jìn)而參與HCC進(jìn)展,有望成為預(yù)測(cè)抗HCC免疫治療效果的生物標(biāo)志物。需要進(jìn)一步的深入研究為L(zhǎng)PCAT1相關(guān)的HCC治療靶點(diǎn)的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)和臨床證據(jù)。